Пцр как расшифровать: Что такое ПЦР-анализ?

Содержание

Что такое ПЦР-анализ?

Что такое ПЦР-анализ?

ПЦР — это метод лабораторной диагностики, направленный на выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Трёхбуквенный вариант — это аббревиатура названия «полимеразная цепная реакция». Собственно, в этом названии и отражается суть метода, но для того, чтобы разобраться, придётся основательно вспомнить школьный курс биологии.

Но сначала – немного истории. Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

В литературе очень часто встречается такое образное описание ПЦР: это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. В принципе, очень точное описание. Если продолжать сравнение, то игла – это небольшой участок генетического материала микроорганизма, а стог сена – это организм человека, в котором данный микроорганизм поселился.

Что показывает анализ ПЦР

Анализ позволяет обнаружить присутствие генетического материала инфекционных возбудителей. ПЦР в гинекологии и в урологии широко применяется для выявления скрытых и труднодиагностируемых инфекций. В том числе выполняется ПЦР и на ВИЧ.

Принцип работы

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причём для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

Достоинства

Теория – это, безусловно, замечательно, но что мы имеем на выходе? Какую практическую выгоду получает человек, когда отправляется на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР?

Безусловно, одно из главных достоинств — это универсальностьметода. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем.
Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа.

Метод обладает высочайшей чувствительностью – мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя.
Несомненное преимущество метода – оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день.
При помощи ПЦР определяют возбудителя , а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.

Молекулярная (ДНК/РНК) диагностика методом ПЦР

Анализ ПЦР позволяет выявлять инфенционные заболевания по уникальному ДНК, свойственному только каждой конкретной инфекции. Этот метод эффективно применяется для диагностики ЗППП и других инфекций.

Что такое ПЦР

ПЦР — полимеразная цепная реакция. В основе такого метода диагностики лежит многократно увеличение участка чужеродного ДНК. Для анализа может использоваться любой биологический материал пациента: кровь, слюна, выделения и др. Это зависит от назначения врача.
ПЦР-диагностика чаще всего применяется в урологии и гинекологии. Кроме того, ПЦР позволяет выявить вирусные пневмонии, гастроэнтерологические и многие другие заболевания.

Преимущества метода

Быстрые результаты;
Способность выявить даже единичные молекулы возбудителя заболевания;
Высокая точность диагноза;
Возможность диагностики нескольких заболевания по одному образцу биоматериала;

Выявление вирусов и инфекций на самых ранних стадиях.

Подготовка к анализу

В зависимости от материала, который пойдет на анализ, необходимо соблюдать ряд рекомендаций:

при использовании слюны, в течение 4 часов перед анализом нельзя есть и принимать препараты, непосредственно перед процедурой следует промыть рот прокипяченой водой;
перед сбором мочи необходимо промыть половые органы; для анализа требуется утренняя моча;
мужчинам перед сдачей спермы нужно на 3 дня воздержаться от интимной близости, перегрева, не употреблять острую пищу и алкоголь; непосредственно перед анализом следует воздержаться от мочеиспускания на 3 часа;
такие же требования относятся к сдачи женщинами урогенитального мазка; кроме того, за несколько недель запрещен прием антибактериальных препаратов, за неделю прекратить прием интимных гелей, мазей и т. д.;

кровь следует сдавать утром натощак.

Сдайте анализ ПЦР в «Здоровье»!

Для получения точного диагноза важно четко соблюдать процесс от забора материала до финальных этапов исследования. В биоматериале не должно быть примесей, хранение и транспортировка в лабораторию должны осуществляться в особых условиях.
Все эти условия строго соблюдаются в медицинском центре «Здоровье». С нами вы можете не сомневаться в точности диагностики.

расшифровка и применение — АЛТ Украина ЛТД

К нам часто поступает множество вопросов, касающихся такого метода лабораторной диагностики как ПЦР. В своей статье, мы постарались рассмотреть самые актуальные из них.

Надеемся наш материал будет полезным для Вас!

Что такое ПЦР-диагностика?

ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) — это высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, основанный на анализе генетического материала (ДНК и РНК). Для диагностики используется слюна, кровь, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы, в зависимости от целей исследования.

Какие опасные инфекции можно выявлять в реанимации методом ПЦР?

Методом ПЦР можно выявлять любые опасные инфекции, которые приводят к критическому состоянию пациента. Своевременное выявление инфекционного агента, вызвавшего данное состояние, позволит правильно скорректировать лечение и спасти жизнь.

Подойдёт ли этот метод для скрининга, для подтверждения диагноза?

Скрининговый анализ, в общем понимании, действительно не совсем подходящий метод для неотложной медицины. Скрининг, по большей части, является профилактическим мероприятием и представляет собой массовые тотальные исследования по выявлению скрытых, внешне не проявляющихся или недавно начавшихся патологических процессов у пациентов. Например, ПЦР-диагностика прекрасно используется в гинекологической практике для скрининга вируса папиломы человека (ВПЧ) или болезней, передающихся половым путём (ЗППП). Также ПЦР метод широко используется для скринингового тестирования плазмы крови на предмет выявления вирусов гепатита В, С, D, E. И так далее.

Для скрининга эффективнее использовать ныне устаревающий метод ИФА или современной ИХЛА?

С методами ИФА и ИХЛА не всё так однозначно. Они выявляют косвенные признаки патологических изменений и это является их главным недостатком. Организму на вредное воздействие необходимо вначале сформировать иммунный ответ, наработать антитела, которые в последующем возможно выявить только со временем. Может возникнуть ситуация, когда организм уже заражен какой-либо инфекцией, а антител к ней еще нет или их титр находится ниже порога чувствительности тест-набора. Или наоборот – возбудителя уже нет в организме, а антитела ещё выявляются.

Хронологически метод ПЦР в клинической практике появился позже ИФА и ИХЛА и по факту является более современным. По показателям специфичности и чувствительности ПЦР выше данных иммунологических методов. К тому же ПЦР-анализ выявляет прямую первопричину процессов – их генетическую основу, а не следствие. Для получения нужного результата при постановке ПЦР нет необходимости выявлять весь геном мишени. Задачи по анализу всего генома решаются с помощью других методов (например, таргетный или полногеномный анализ с помощью секвенирования нового поколения – NGS).

С помощью ПЦР-теста выявляется высоко консервативный фрагмент ДНК (определённая нуклеотидная последовательность), однозначно характеризующий мишень. А при методе ПЦР в реальном времени можно даже определить изначальное количество мишени в пробе.

Что этот метод даст для лечения и выявления мультирезистентного штама микобактерий?

Выявление мультирезистентных шаммов позволит изначально не использовать те антибиотики, к которым у возбудителя существует генетически обусловленная стойкость, а использовать другие препараты. Например против штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к Изониазиду и Рифампицину сразу применять фторхинолоны или инъекционные препараты.

Можно ли при ВИЧ вылечить чувствительные штаммы?

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вообще не восприимчив ко антибиотикам и противомикробным препаратам, потому что не является бактерией. Против вирусов необходимо применять противовирусные препараты. Трудность лечения вирусных заболеваний вообще и СПИДа в частности обусловлена их биологической особенностью – активная фаза жизнедеятельности вируса проходит только внутри живой клетки. Поэтому вирусные частицы защищены от воздействий внешней среды. Уничтожить вирус можно только с клеткой, в случае с ВИЧ – с клеткой иммунной системы.

Как исследование соотношения субпопуляций лейкоцитов выявляет онкомаркеры?

Числовое значение соотношения субпопуляций лейкоцитов является индикаторным или маркерным показателем наличия онкологического процесса, т.е. одним из онкомаркеров. В норме и при патологии данное значение отличается. Например, при значениях CD4+/CD8+ в диапазоне от 1,2 до 2,6 может свидетельствовать о возможном наличии в организме множественной миеломы или солидных опухолей. Увеличение значения более до 3 и более может указывать на острый Т-лимфобластный лейкоз или хронический Т-лейкозе. И т.д. Другими словами –в данном случае преобладание Т-хелперов над Т-киллерами специфически информативно.
Но онкомаркеры могут быть и генетическими. На сегодняшний момент обнаружены тысячи мутантных аллелей генов, которые с той или иной вероятностью могут приводить к развитию онкологического процесса. На рынке существует множество тест-систем для выявления онкомаркеров разных производителей.

Рак шейки матки целесообразно предотвращать (или диагностировать на ранней – внутриэпителиальной стадии) до его развития путём разработки и внедрения государственных программ по тотальному скринингу женщин на наличие ВПЧ с регулярными подтверждающими цитологическими исследованиями. Также огромным фактором по своевременному предотвращению данного заболевания будет внедрение вакцинации против ВПЧ всех младенцев при рождении (и мальчиков и девочек).

ПЦР диагностика в Саратове и Энгельсе — (клиники Di Центр)

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию.

Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови. После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

ВИЧ;
герпеса;
различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
кандидоза;
гепатитов;
мононуклеоза;
листериоза;
цитомегаловируса;
туберкулеза;
вируса папилломы человека;
клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.
Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.
Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.
Оперативность. Результат, как правило, готов через 5−7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.
Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.
Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Расшифровка результатов

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

ПЦР в реальном времени в Медицинском Di-Центре проводится на анализаторах Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene Q (Австралия, Германия).

Как выявляют вирус COVID-19 с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени?

Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо ДНК, либо РНК.

ДНК — это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.

РНК обычно представляет собой состоящую из одной цепи молекулу, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы они могли синтезировать и выполнять функции, которые поддерживают жизнь и развитие организмов. Существуют различные типы РНК, которые выполняют копирование, транскрибирование и передачу.

Некоторые вирусы, такие как коронавирус (SARS-CoV-2), содержат только РНК, что означает, что они полагаются на проникновение в здоровые клетки для размножения и выживания. Оказавшись внутри клетки, вирус использует свой собственный генетический код (РНК в случае коронавируса) чтобы взять под контроль и «перепрограммировать» клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов.

Для того чтобы при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени выявить на раннем этапе присутствие в организме вируса, такого как коронавирус, ученым необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией». Это делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью процесса ОТ-ПЦР в реальном времени, применяемого для выявления вирусов.

Ученые амплифицируют определенную часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз. Амплификация важна, поскольку вместо того, чтобы пытаться найти ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации, ученые имеют достаточно большое количество заданных участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить, что вирус присутствует.

ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний

ПЦР — диагностика (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, который основывается на исследовании генетического материала человека (ДНК и РНК). В зависимости от цели исследования используются кровь, слюна, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы.

ПЦР — анализ

Часто бывает, что различные по своей природе вирусы могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. ПЦР анализ позволяет определить наличие возбудителя, даже при минимальном содержании его штаммов в биологическом материале, а в отдельных случаях, выявляет даже единичные клетки вирусов или бактерий. Определяется вирус, природа его появления, устанавливается сила его воздействия на организм и количество имеющихся микробов в организме. Эта информация важна для лечащего врача при выборе лекарственных препаратов и назначении методов лечения.

В настоящее время ПЦР тест позволяет выявлять все известные современной медицине вирусные заболевания. В том числе даже те, которые могут годами «жить» в организме человека и не проявлять себя, ожидая наиболее комфортных условий для своей «работы». Диагностика «растущих» длительное время возбудителей особенно актуальна в гинекологии и урологии.

В медицинской лаборатории «Синэво» можно пройти ПЦР — диагностику по следующим заболеваниям:

Гепатит B и C

Проведение ПЦР — диагностики необходимо здесь в силу того, что вирус гепатитов имеет продолжительный инкубационный период (до 180 дней) и достаточно серьезные последствия, вплоть до летального исхода.

ИППП

Заболевания, передающиеся половым путем: уреплазмол половых органов, хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз. Коварство заключается в том, что симптомы данных заболеваний зачастую на ранних стадиях «стерты». Эта группа заболеваний опасна тем, что может вызвать у женщин бесплодие, оказывает серьезное влияние на течение беременности, увеличивает риск развития рака шейки матки. У мужчин снижается подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, вызывая мужское бесплодие, поражается мочеиспускательный канал и развивается простатит. Увеличиваются риски заболевания генитальным герпесом, а так же ВИЧ/СПИД. Пакет 18.1 «Обследование на ИППП».

Сдать анализ рекомендуется и супругам, желающим родить здорового ребенка. Ведь только ПЦР — диагностика позволяет выявить скрытые инфекции в организме и предотвратить их проникновение в организм плода.

Герпес

Опасное и устойчивое заболевание. Зачастую болезнь не системна и протекает долгие годы в неактивном режиме. При этом возможны проявления, похожие на симптомы герпеса. Но истекают они так быстро, что не возможно точно поставить диагноз традиционным способом. Опасность герпеса в том, что он может поражать центральную нервную систему и стать причиной развития менингита и энцефалита. См. услуги ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (соскоб) и ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (кровь, качественное определение).

Тест на отцовство

Благодаря ПЦР — диагностике инфекции выявляются на начальном этапе их развития, что способствует скорейшему выздоровлению и предотвращению серьезных осложнений.

тестирование — что это такое, как работает метод ПЦР, показания, подготовка к проведению ПЦР-теста, как проводится ПЦР-анализ, результаты теста

Опубликовано: 10. 02.2021 13:07:00 Обновлено: 18.02.2021 Просмотров: 148380

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК.

А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%. Исключен риск ложноположительных результатов.
Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных – разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент – уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки.
Универсальность. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны.
Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.

Какие есть недостатки

Единственный серьезный недостаток, связанный с методом полимеразной цепной реакции, — его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайших соблюдений правил и серьезной оснащенности лабораторного комплекса. Не каждая лаборатория может позволить себе все необходимое оборудование.

Показания к проведению ПЦР-анализа

ПЦР – один из наиболее востребованных способов диагностики в медицине, и применяется он в самых разных областях:

Диагностика инфекционных заболеваний (гепатит, ВИЧ, TORCH-инфекции и огромное множество других видов патогенов).
Урогинекология (диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы). Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ – вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки.
Неонатология. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ – главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 (COVID-19), ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий.
Генетика. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР.

ПЦР-тесты применяются везде, где нужен быстрый, точный и надежный результат.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

Еще одно немаловажное преимущество ПЦР-анализов – это отсутствие специфической подготовки к проведению тестов. Достаточно следовать стандартным рекомендациям специалиста:

Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту.
При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом.
Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты.

Подробную инструкцию по правилам подготовки к каждому анализу вы всегда можете получить у лечащего врача или у консультантов на нашей горячей линии.

Как проводится ПЦР-анализ

С 1983 года, когда был изобретен данный метод, прошло много времени, и технологии не стоят на месте. Сегодня существует несколько различных методик для проведения ПЦР-теста:

С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке.
Вложенная ПЦР (или «гнездовая») — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров.
Изотермические методы – не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом

Это далеко не все существующие на сегодняшний день разновидности ПЦР-технологий. Ученые активно развивают эту важную и перспективную область лабораторной диагностики, совершенствуют методы ПЦР, оттачивают техники и изобретают новые подходы.

Результаты ПЦР-теста

Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

Что это такое, как это сделано, что означают результаты

Обзор

Что такое ПЦР-тест?

Тест полимеразной цепной реакции (ПЦР) выполняется для обнаружения генетического материала от определенного организма, например вируса. Тест обнаруживает наличие вируса, если вы инфицированы во время теста. Тест также может обнаруживать фрагменты вируса даже после того, как вы больше не инфицированы.

Что такое ПЦР-тест на COVID-19?

ПЦР-тест на COVID-19 — это тест, используемый для диагностики людей, которые в настоящее время инфицированы SARS-CoV-2, коронавирусом, вызывающим COVID-19.ПЦР-тест — это «золотой стандарт» для диагностики COVID-19, потому что это самый точный и надежный тест.

Кому следует пройти тестирование на COVID-19?

Пройдите тестирование:

Если у вас симптомы COVID-19.
Если вы находились в пределах шести футов от человека с положительным результатом на Covid-19 в течение 15 или более минут. (Примечание: некоторые сайты тестирования не предлагают тестирование, если вы подверглись заражению, но у вас нет симптомов.)

Детали теста

Как работает ПЦР-тест на COVID-19?

ПЦР-тест на COVID-19 состоит из трех основных этапов: 1) сбор образца, 2) экстракция и 3) ПЦР.

Забор пробы проводится с помощью тампона для сбора респираторного материала, обнаруженного в носу. Тампон содержит мягкий наконечник на длинной гибкой палочке, которую вставляют в нос. Существуют разные типы мазков из носа, в том числе мазки из носа, которые собирают образец непосредственно в ваших ноздрях, и мазки из носоглотки, которые идут дальше в полость носа для сбора. Для сбора материала для ПЦР-теста на COVID-19 достаточно мазка любого типа. После сбора мазок запаивают в пробирку и отправляют в лабораторию.
Когда лабораторный технолог получает образец, он выполняет процесс, называемый экстракцией, который выделяет генетический материал из образца, включая генетический материал от любого вируса, который может присутствовать.
Затем на этапе ПЦР используются специальные химические вещества и аппарат ПЦР, называемый термоциклером, который вызывает реакцию, в результате которой создаются миллионы копий небольшой части генетического материала вируса SARS-CoV-2. Во время этого процесса одно из химических веществ излучает флуоресцентный свет, если в образце присутствует SARS-CoV-2.Этот флуоресцентный свет является «сигналом», который обнаруживается машиной для ПЦР, и специальное программное обеспечение используется для интерпретации сигнала как положительного результата теста.

Результаты и последующие действия

Что означают результаты ПЦР-теста на COVID-19?

A положительный тест результат означает, что у вас очень вероятно, что у вас COVID-19. Большинство людей имеют легкое заболевание и могут безопасно выздороветь дома без медицинской помощи. Свяжитесь с вашим лечащим врачом, если ваши симптомы ухудшатся, или если у вас есть вопросы или опасения.

Отрицательный результат теста Результат означает, что у вас, вероятно, не было COVID-19 на момент прохождения теста. Однако можно заразиться SARS-CoV-2, но в вашем организме недостаточно вируса, чтобы его можно было обнаружить с помощью теста. Например, это может произойти, если вы недавно заразились, но у вас еще нет симптомов; или это могло произойти, если до тестирования у вас был COVID-19 более недели. Помните, что отрицательный результат теста не означает, что вы в безопасности в течение длительного времени.После теста вы можете заразиться COVID-19, заразиться и передать вирус SARS-Cov-2 другим людям.

Если ваш тест положительный, поговорите со своим врачом, оставайтесь дома и отделитесь от других. Если ваш тест отрицательный, продолжайте принимать меры, чтобы защитить себя и других от заражения COVID-19. Узнайте больше о том, что делать при положительном результате теста, и о способах предотвращения заражения COVID-19.

Как скоро станут доступны результаты ПЦР-теста на COVID-19?

Вы должны получить результаты своего теста уже через 24 часа после взятия пробы, но иногда это может занять несколько дней в зависимости от того, сколько времени потребуется пробе, чтобы добраться до лаборатории, и от того, сколько других проб находится в очереди на анализ.

Каковы преимущества ПЦР-теста на COVID-19?

Основными преимуществами ПЦР-теста на COVID-19 являются его точность и надежность. Это самый точный тест для обнаружения COVID-19.

Есть ли недостатки у ПЦР-теста на COVID-19?

Поскольку тест способен обнаруживать очень небольшие количества вирусного материала, он может продолжать обнаруживать фрагменты вируса SARS-CoV-2 даже после того, как вы вылечились от COVID-19 и больше не являются заразными. Таким образом, вы можете продолжать давать положительный результат, если у вас был COVID-19 в далеком прошлом, даже если вы не можете передать вирус SARS-CoV-2 другим людям.

дополнительные детали

Чем отличается тест ПЦР на COVID-19 с другими доступными тестами на COVID-19?

В основном, существует два типа тестов: диагностические тесты и тесты на антитела. Диагностические тесты говорят вам, есть ли у вас активная (текущая) инфекция COVID-19. Тесты на антитела говорят вам, что у вас уже был COVID-19.

Диагностические тесты:

ПЦР-тест: Этот тест проверяет наличие фактического генетического материала вируса или его фрагментов при его распаде.Это самый надежный и точный тест для выявления активного заражения.
Тест на антиген: Этот тест обнаруживает кусочки белков на поверхности вируса, называемые антигенами. Тесты на антигены обычно считаются быстрыми, занимающими всего 15–30 минут, но менее точными, чем тест ПЦР. Экспресс-тесты на антигены наиболее точны, если их использовать в течение нескольких дней после появления симптомов, когда в вашем организме присутствует наибольшее количество вируса. Поскольку этот тест не так точен, как тест ПЦР, если тест на антиген отрицательный, ваш лечащий врач может заказать тест ПЦР, чтобы подтвердить отрицательный результат теста.

Тест на антитела:

Тест на антитела (серологический): Этот тест определяет, есть ли у вас иммунный ответ (антитела) к вирусу. Это означает, что у вас есть вирус, и ваше тело (иммунная система, в частности антитела) предприняло атаку, чтобы с ним бороться. Тест обнаруживает эти антитела. Обычно после заражения требуется около недели, чтобы выработалось достаточно антител, чтобы их можно было обнаружить в крови. По этой причине этот тест не следует использовать для диагностики активной инфекции.

Как узнать, где пройти тестирование на COVID-19?

Если у вас есть симптомы COVID-19 или вы контактировали с людьми с симптомами или с положительным результатом теста, вы можете пройти тестирование. Сначала поговорите со своим врачом. Они рассмотрят ваши симптомы лично или на видеовстрече. Провайдер разместит заказ на тест и сообщит вам, где вы можете пройти тестирование. Помните, что если вы подверглись воздействию вируса SARS-CoV-2, но у вас нет симптомов, сначала позвоните в центр тестирования, чтобы убедиться, что они позволят вам пройти тестирование.

Вы также можете позвонить или проверить веб-сайты местных больниц в сети медицинского страхования или обратиться в местные медицинские центры или центры неотложной помощи. Министерство здравоохранения и социальных служб США предоставляет ссылки для поиска мест тестирования на уровне сообществ в вашем штате. Вы также можете проверить веб-сайты департамента здравоохранения своего штата или местного департамента здравоохранения, чтобы получить самую свежую информацию о местах проведения анализов. Центры по контролю за заболеваниями предоставляют ссылки на эти государственные и местные департаменты здравоохранения.

Полимеразная цепная реакция — обзор

Что означает ПЦР? Кто это придумал?

Каков основной принцип ПЦР?

Назовите различные компоненты, необходимые для ПЦР.

Какой фермент используется в ПЦР? Объясните, почему этот фермент используется для реакции.

Какие различные стадии входят в один цикл реакции ПЦР?

Что такое T _m? Почему это значение важно для ПЦР?

Опишите, какие типы параметров используются для расчета Т _м грунтовки.

Что такое ошибочная заправка? Что может вызвать ошибочный старт при ПЦР?

Что такое вырожденные праймеры? Назовите два варианта использования вырожденных праймеров.

10.

Какие изменения в стандартной ПЦР сделаны для ПЦР на больших расстояниях?

11.

Опишите ПЦР с горячим стартом. Какие две общие модификации сохраняют полимеразу Taq неактивной до стадии денатурации первого цикла ПЦР?

12.

Что такое обратная транскриптаза?

13.

Что такое кДНК? Как они сделаны?

14.

Каковы различные варианты использования ОТ-ПЦР?

15.

Назовите три различных типа праймеров, которые можно использовать для реакции обратной транскриптазы? В чем преимущества и недостатки каждого типа грунтовки?

16.

Опишите, как SYBR Green I будет использоваться в кПЦР для оценки количества продукта ПЦР.

17.

Опишите, как 5’-зонд нуклеазы используется в кПЦР для оценки количества продукта ПЦР.

18.

Объясните, как использование 5’-нуклеазного зонда может обеспечить большую специфичность во время кПЦР.

19.

Почему трудно получить полноразмерную кДНК с помощью обратной транскриптазы?

20.

Каковы два способа изменения оснований в ДНК с помощью ПЦР?

21.

Какие этапы включают вставку или удаление ДНК с помощью ПЦР?

22.

Что такое мультиплексный КПЦР? Как проходит эта процедура?

23.

Назовите два применения ПЦР в медицинской диагностике.

24.

Каковы преимущества ПЦР-анализа в окружающей среде?

Зонд 5′-нуклеазы

Зонд, используемый для определения относительного количества продуктов ПЦР, образующихся в каждом цикле количественной ПЦР (кПЦР).Зонд имеет флуорофор на 5′-конце и гаситель на 3′-конце, который предотвращает испускание флуоресцентного света до тех пор, пока он не разложится ДНК-полимеразой.

отжиг

(в ПЦР) Второй этап каждого цикла ПЦР, на котором температура термоциклера позволяет образовывать водородные связи между праймером ПЦР и его комплементарной целевой ДНК.

последовательность штрих-кода

Уникальная последовательность, добавленная в кассету для маркировки гена меткой для последующего анализа.

биомаркер

Измеримое вещество, обнаруженное в крови и т. Д., Которое указывает тип и / или тяжесть заболевания.

циркулирующая опухолевая ДНК (ктДНК)

Фрагменты ДНК, обнаруженные в крови, которые происходят от умирающих опухолевых клеток. Количество ctDNA увеличивается с тяжестью рака и является хорошим биомаркером для определения типа и стадии рака.

комплементарная ДНК (кДНК)

Вариант гена, в котором отсутствуют интроны и который сделан из соответствующей мРНК с использованием обратной транскриптазы.

вырожденный праймер

Праймеры, сконструированные так, чтобы иметь более одного возможного основания в определенных положениях в последовательности. После синтеза появляются разные праймеры, некоторые из них будут иметь одно из возможных оснований, а другие праймеры будут иметь альтернативные основания.

денатурация

(в ПЦР) Первый этап каждого цикла ПЦР, на котором температура термоциклера достаточно высока для «плавления» водородных связей, удерживающих вместе двухцепочечную ДНК, и в результате получается одноцепочечная ДНК.

направленный мутагенез

Преднамеренное изменение последовательности ДНК гена с помощью любого из множества искусственных методов.

удлинение

(в ПЦР) Третий этап каждого цикла ПЦР, на котором температура термоциклера устанавливается на оптимальную температуру для термостабильной ДНК-полимеразы для удлинения или удлинения праймера ПЦР, создавая копию целевой ДНК.

ДНК из окружающей среды (eDNA)

ДНК, собранная из окружающей среды, которая содержит очень сложную смесь фрагментов ДНК любого организма, присутствующего или, возможно, даже недавно прошедшего через место отбора проб.

extension

резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET)

Передача энергии от коротковолнового флуорофора к длинноволновому флуорофору, который гасит коротковолновое излучение.

флуорофор

Флуоресцентная группа, излучающая свет с большей длиной волны после воздействия света с другой длиной волны.

шпилька

ПЦР с горячим стартом

Структура ДНК, которая образуется, когда две области комплементарной последовательности рядом друг с другом отжигаются.

индексная последовательность

Уникальная нуклеотидная последовательность, добавленная в кассету для маркировки гена меткой для последующего анализа.

Зонд 5′-нуклеазы

интеркалирующий флуоресцентный краситель

Флуоресцентная молекула, которая излучает флуоресцентный свет только тогда, когда она встроена или интеркалирована между парами оснований двухцепочечной ДНК.

обратная ПЦР

Метод использования ПЦР для амплификации неизвестных последовательностей путем циркуляризации молекулы-шаблона.

ПЦР дальнего действия

Реакция ПЦР, используемая специально для амплификации более длинных целевых последовательностей, чем стандартная ПЦР.

температура плавления (T _m)

(праймера ПЦР) Температура, при которой половина праймеров связывается водородными связями с их комплементарной последовательностью в целевой ДНК, а другая половина не присоединяется.

ошибочное зачисление

(в ПЦР) Когда праймеры ПЦР связываются в неправильном месте и позволяют ДНК-полимеразе делать копии неправильной ДНК в образце.Это может быть вызвано слишком низкой температурой отжига или плохо спроектированными праймерами ПЦР, которые комплементарны повторяющейся ДНК в геноме.

молекулярный маяк

Флуоресцентный зонд, который содержит как флуорофор, так и группу тушения, соединенную структурой ДНК шпильки. Зонд флуоресцирует только тогда, когда он связывается с определенной последовательностью-мишенью ДНК, которая высвобождает шпильку и отделяет флуорофор от гасителя.

молекулярное сшивание

Создание гибридного гена путем соединения сегментов из нескольких источников с помощью ПЦР.

мультиплексная кПЦР

Использование нескольких наборов праймеров и различных флуоресцентно меченных зондов 5′-нуклеаз для одновременного количественного определения накопления множественных последовательностей-мишеней.

oligo (dT) primer

Праймер, представляющий собой цепь из 18–20 T, которая предназначена для отжига с любой мРНК с полиА-хвостом. Используется в ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) для преобразования всех мРНК полиА в образце в кДНК.

праймер перекрытия

ПЦР-праймер, который соответствует небольшим областям двух разных генных сегментов и используется для соединения сегментов ДНК из разных источников.

ПЦР-ампликон

Последние копии целевой ДНК, созданные во время реакции ПЦР.

Аппарат ПЦР

См. Термоциклер.

ПЦР-праймеры

Короткие фрагменты одноцепочечной ДНК, комплементарные последовательностям на концах целевого сегмента ДНК. 3′-гидроксильная группа необходима ДНК-полимеразе для инициации синтеза ДНК.

Продукт ПЦР

Конечные копии целевой ДНК, созданные во время реакции ПЦР.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Амплификация последовательности ДНК путем повторяющихся циклов разделения цепей и репликации ДНК.

праймер-димер

Структура образуется, когда два праймера ПЦР отжигаются друг с другом, а не с целевой ДНК. Из-за комплементарных последовательностей между двумя праймерами ПЦР.

количественная ПЦР (кПЦР)

ПЦР, в которой добавление флуоресцентного красителя, такого как SYBR I Green, или добавление флуоресцентно меченного 5 ’нуклеазного зонда позволяет измерить накопление продуктов ПЦР.Скорость накопления продуктов ПЦР показывает, сколько целевых ДНК присутствовало в образце, поскольку чем больше количество исходной целевой ДНК, тем быстрее накапливаются продукты ПЦР.

quencher

Молекула, которая предотвращает флуоресценцию, поглощая свет, излучаемый флуорофором.

случайный гексамер

Праймер длиной шесть нуклеотидов, синтезированный так, что каждый нуклеотид может быть любым из четырех оснований (G, A, T или C).Это смесь праймеров, каждая из которых имеет потенциальную последовательность из шести нуклеотидов, и, следовательно, существуют праймеры, комплементарные любой случайной последовательности из шести оснований в образце РНК.

ПЦР в реальном времени

ПЦР, в которой добавление флуоресцентного красителя, такого как SYBR Green I, или добавление флуоресцентно меченного зонда 5’-нуклеазы позволяет измерить накопление продуктов ПЦР. Скорость накопления продуктов ПЦР показывает, сколько целевых ДНК присутствовало в образце, поскольку чем больше количество исходной целевой ДНК, тем быстрее накапливаются продукты ПЦР.

контрольный образец

(в криминалистике) Образец ДНК, взятый у жертвы, любого подозреваемого и всех людей, имевших доступ к месту преступления. Продукты ПЦР из каждой контрольной пробы сравниваются с пробами, собранными на месте преступления, чтобы идентифицировать лиц, которые присутствовали на месте преступления.

обратная транскриптаза

Фермент, который начинается с РНК и создает ДНК-копию генетической информации.

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

Вариант ПЦР, который начинается с мРНК для создания копий. Сначала мРНК преобразуется в кДНК с помощью обратной транскриптазы, а затем ПЦР делает несколько копий этой кДНК.

SYBR Green I

ДНК-связывающий флуоресцентный краситель, который связывается только с двухцепочечной ДНК и становится флуоресцентным только при связывании. Краситель не флуоресцирует в растворе.

хвостовых праймеров ПЦР

ПЦР-праймеров, которые имеют дополнительные последовательности на 5′-конце, которые включаются в конечный продукт ПЦР.

Полимераза Taq

Термостойкая ДНК-полимераза из Thermus aquaticus , используемая для ПЦР.

целевая последовательность

Определенная область или последовательность в исходном образце ДНК, который амплифицируется в реакции ПЦР.

термоциклер

Устройство, используемое для быстрого и точного переключения между несколькими температурами в заданном порядке (для ПЦР).

Thermus aquaticus

Термофильные бактерии, обнаруженные в горячих источниках и используемые в качестве источника термостабильной ДНК-полимеразы для ПЦР.

ДНК-полимераза

Фермент, который образует полимер или цепочку ДНК путем соединения отдельных нуклеотидов.

5′-нуклеазный зонд

Короткий одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный ДНК-мишени и имеющий флуорофор, прикрепленный к 5′-концу, и гаситель, прикрепленный к 3′-концу.

ПЦР-тест на COVID-19 надежен, несмотря на шумиху вокруг значений Ct | Office for Science and Society

Настоящие криминальные сериалы, такие как Serial и Making a Murderer , приглашают нас отточить наши способности и превзойти детективов, назначенных для расследования, в выяснении того, что на самом деле произошло.Мы слышим официальное повествование, а затем изучаем различные подсказки, предоставленные нам рассказчиком, оборачивая их мысленным взором в поисках этого дымящегося пистолета.

Когда бушевала пандемия COVID-19, некоторые люди решили, что болезнь далеко не так серьезна, как нам сказали, и искали способы дискредитировать усилия общественного здравоохранения. Одно из их предполагаемых дымящихся ружей? Они сказали нам, что лабораторный тест на COVID-19, называемый тестом ПЦР, не проводился должным образом. Значения Ct были явно завышены, и тест выдавал случайный шум.Они решили, что ПЦР-тест на COVID-19 — это сломанная машина, порождающая ложные срабатывания и страх.

Все это неправда. В лабораторные дни я провел бесчисленное количество ПЦР, и я хочу объяснить, что такое ПЦР, что это за значения Ct и что они означают, и почему ученые, интерпретирующие эти тесты, на самом деле знают, что они делают

Приключение полимеразной цепной реакции

Представьте, что перед вами сборник рассказов, и вы хотите знать, есть ли в нем рассказ о Шерлоке Холмсе «Скандал в Богемии».«Очевидно, вы могли бы ознакомиться с указателем или, возможно, даже с суперобложкой, но я хочу использовать этот пример, чтобы объяснить, как ученые охотятся за генами коронавируса в образцах, которые они получают от людей, выстраивающихся в очередь для тестирования.

Мы можем сосредоточиться на одном из последних предложений в этой истории: «И вот как великий скандал угрожал затронуть королевство Богемия, и как лучшие планы мистера Шерлока Холмса были разбиты женским остроумием». Это предложение не встречается ни в одном другом рассказе: поэтому, если мы сможем найти его в этой книге, оно будет указывать на то, что на его страницах присутствует «Скандал в Богемии».

Ученые выбрали бы две короткие фразы, называемые «праймеры», которые составят основу этого предложения. Например, «И было как» для начала и «женское остроумие» в конце. Что произойдет в лаборатории, так это то, что все, что находится между этими двумя фразами или праймерами, будет усилено: будут сделаны копии. Это предложение будет копироваться снова и снова в процессе, известном как ПЦР или полимеразная цепная реакция, названная в честь фермента, который копирует.

ПЦР — это рабочая лошадка в лабораториях молекулярной биологии.Используется для обнаружения инфекционных микроорганизмов; чтобы узнать, есть ли в ДНК пациента определенная мутация, вызывающая заболевание; и сравнить образец, найденный на месте преступления, с образцами в базе данных или с ДНК подозреваемого. Он функционирует, увеличивая определенную часть генетического материала столько раз, что ее можно обнаружить. Но когда дело доходит до обнаружения коронавируса, время имеет существенное значение, поэтому используемый тип ПЦР называется анализом ПЦР в реальном времени и содержит дополнительный поворот: обнаружение этих скопированных предложений выполняется по мере их копирования. .

Возвращаясь к нашему рассказу, мы бы разработали зонд, который привязан к центральной фразе «королевство Богемия». Представьте, что мы начинаем с единственной копии всего нашего предложения. После одного цикла амплификации у нас теперь есть два. После второго цикла у нас их четыре. Потом 8, 16, 32, 64, 128 копий. Число копий увеличивается экспоненциально, потому что каждая копия становится шаблоном для следующего раунда амплификации. И во время каждого раунда амплификации наш зонд «Царство Богемии» связывается со всеми доступными копиями этой фразы.К этому зонду прикреплена флуоресцентная молекула, которая при возбуждении лазером излучает свет, как сигнальный маяк. Что происходит с этим светом, когда зонду разрешается связать 8 копий фразы, затем 16, затем 32? Обнаруживается все больше и больше света. Это световое излучение является нашим ключом к разгадке того, что фраза из «Скандала в Богемии» присутствовала все время и продолжает развиваться.

Последний элемент, который мне нужно рассмотреть, и тот, на который ухватились противники COVID, — это предел обнаружения.Видите ли, если вы дадите мне стопку бумаг, заполненную последней страницей из «Скандала в Богемии», и попросите меня провести ПЦР в реальном времени, световой сигнал, который я получу от зонда, будет громким и четким. так как я буду вводить большое количество исходного материала. Но если мы начнем с одной страницы, потребуется много циклов амплификации, прежде чем достаточное количество зондов сможет привязаться к «царству Богемии» и излучать достаточно света, чтобы их можно было обнаружить.

Итак, этот тест ПЦР в реальном времени имеет предел обнаружения.Когда вирусов много, ответ довольно однозначный. Но когда в образце мало вирусных частиц (потому что, например, мы только что заразились вирусом, и у него не было времени сделать много копий самого себя), потребуется много-много циклов амплификации, прежде чем мы сможем обнаружить достаточно света, чтобы увидеть присутствие вируса.

Некоторые люди утверждают, что тест ПЦР на коронавирус проводится слишком много циклов и, следовательно, в основном ненадежен. Они просят раскрывать значение Ct для каждого теста, чтобы они могли сами судить, является ли тест точным или нет.В этом утверждении есть доля правды, но, как вы увидите, не более того.

Значения Ct не элементарные

Это печально известное значение Ct или порог цикла довольно просто. Это количество циклов усиления, необходимое для получения достаточного количества света. Под «достаточным количеством света» мы подразумеваем, что он пересекает порог, где он явно выше того, что можно было бы назвать фоновым шумом. В нашем вымышленном примере выше мы усиливаем предложение один раз и получаем две копии: излучается и обнаруживается крошечный кусочек света.В другом цикле у нас четыре копии: больше света. Затем восемь копий, 16 копий, 32 копии, и с каждым циклом мы обнаруживаем все больше и больше света, поскольку все больше и больше зондов связываются с фразой «королевство Богемия». В какой-то момент, скажем, в цикле 25, будет обнаружено достаточно света, чтобы мы очистили этот порог. Значение Ct будет 25.

Низкое значение Ct означает, что было много исходного материала (много страниц с интересующим нас предложением или много копий коронавируса).Высокое значение Ct означает, что исходного материала было мало, поэтому требуется больше времени, чтобы получить достаточно копий, чтобы вы могли их увидеть.

Опасность, когда вы видите высокие значения Ct (например, 38-40), заключается в том, что сигнал, который вы в конечном итоге получаете, может быть неточным: возвращаясь к мистеру Холмсу, он мог бы усиливать несколько похожее предложение из другой истории. Это суть истины, на которую ухватились противники COVID. Но реальность технологии ПЦР намного сложнее: мы не можем просто установить универсальное значение Ct, за пределами которого мы объявляем все тесты отрицательными.Значение Ct в некотором смысле относительное.

В разных лабораториях были созданы разные ПЦР-тесты для поиска коронавируса с использованием разных комбинаций зонда и праймера для поиска разных генов в геноме коронавируса на разных ПЦР-машинах. Неудивительно, что когда 26 лабораторий Онтарио, которые проводят тестирование на коронавирус, участвовали в проверке квалификации, они увидели вариабельность значений Ct до восьми циклов между ними при тестировании одного и того же образца. Образцы, которые, как известно, являются положительными и отрицательными на коронавирус, обрабатываются вместе с неизвестными образцами, и их поведение во время анализа также влияет на интерпретацию результатов.Вот почему в Канаде не рекомендуется указывать значение Ct: само по себе это не имеет большого значения.

В некотором смысле это не похоже на куриный суп. У многих семей есть свой рецепт. Пока он прошел внутреннюю проверку, а это означает, что он выглядит как куриный суп, а на вкус как куриный суп, и люди, которые его едят, довольны им, это совершенно функциональный куриный суп. ПЦР-тесты бывают разных видов, но до тех пор, пока они проверены (с использованием известного количества вируса, его многократного разбавления и запуска этих образцов, чтобы увидеть, какие значения Ct они генерируют), они надежны.Они не идеальны, потому что ни один тест не идеален, но они абсолютно не бесполезный мусор, который некоторые люди в Интернете могут заставить вас поверить.

Пандемия привела к увеличению числа кабинетных экспертов, людей, которые никогда не ступали в лабораторию, внезапно узнав о ПЦР и думая, как в настоящих криминальных драмах, что они раскрыли дело настойчиво. Но интерпретация тестов ПЦР на коронавирус зависит от гораздо большего, чем одно значение Ct: оно зависит от всей вышеупомянутой изменчивости «куриного супа», а также от типа собранных образцов, независимо от того, объединены ли образцы в одну лунку. чтобы сэкономить на реагентах (с последующим индивидуальным тестированием положительных пулов) и на вероятности до тестирования, то есть на том, есть ли у испытуемого симптомы симптомы и был ли он потенциально подвержен воздействию вируса.Слепая зависимость от значений Ct, к сожалению, свидетельствует о неправильном понимании сложности молекулярной диагностики. Значения Ct не элементарны; они требуют опыта для интерпретации.

Возьмите домой сообщение:
— Некоторые люди ошибочно утверждают, что тест ПЦР на коронавирус бесполезен, потому что так называемые значения Ct слишком высоки, и тест обнаруживает вещи, которые не являются коронавирусом
— The ПЦР-тесты на коронавирус, прошедшие внутреннюю валидацию агентствами общественного здравоохранения, на самом деле очень надежны. факторы

@CrackedScience

Оставьте комментарий!

Фотография предоставлена Джеймсом Гатани

Анализ и прогнозирование глобальных праймеров и зондов ОТ-ПЦР в реальном времени для SARS-CoV-2

Описание данных

GISAID стал ведущим источником геномов SARS-CoV-2, содержащего наибольшее количество последовательностей геномов вокруг мир с метаданными о месте и времени сбора ¹⁵.Геномы SARS-CoV-2 из репозитория GISAID были курированы, собирая высококачественные геномы за период с 24 августа 2017 г. по 31 июля 2020 г. ¹⁶. Хотя этот диапазон дат предшествует началу текущей вспышки, последовательности генома из более ранних моментов и времени служат в качестве контроля для сравнения. Мы определяем геномы высокого качества как геномы с менее 1% N в последовательности и менее 0,05% уникальных несинонимичных мутаций. Принимая эти меры, мы уменьшаем шум, создаваемый случайными мутациями или ошибками секвенирования, обнаруженными в геноме.В результате был получен набор из 61 996 геномов SARS-CoV-2, для которых мы оценили гомологию праймеров.

ВОЗ опубликовала праймеры из шести стран — Китая, Франции, США, Японии, Германии, Гонконга и Таиланда ⁵. Каждый опубликованный протокол представляет собой метод анализа RT-PCR, и для каждого набора праймеров предусмотрены прямая, обратная и зондовая последовательность ⁵. Для этого исследования мы используем предоставленные последовательности без каких-либо изменений.

Сравнение праймеров для ПЦР

Используя последовательности праймеров и геномы SARS-CoV-2, описанные выше, мы проводим сравнение последовательностей.В частности, мы использовали BLASTN с параметрами, аналогичными Primer-BLAST ¹⁷. Эта процедура была проверена для учета полного выравнивания последовательностей прямого, обратного и зондового праймеров ¹⁸. Затем результаты BLAST анализируются, гарантируя, что прямая, обратная и зондовая последовательности соответствуют заданному геному, и что последовательность зонда совпадает в пространстве в прямом и обратном направлениях на геноме, а количество несовпадений агрегируется для каждой последовательности ПЦР. и геном.Этот показатель не обязательно предсказывает, приведет ли тест ПЦР к положительному или отрицательному результату для конкретного генома, но скорее измеряет изменчивость в пределах целевой области гена. Поскольку все геномы, включенные в этот корпус, связаны с SARS-CoV-2, можно предположить, что они были собраны с помощью положительного анализа. Мутации в целевой области гена со временем могут влиять на чувствительность праймеров.

Методы анализа времени

Для каждого регионального теста каждый праймер нацелен на определенный участок генома, полученный из различных эталонных геномов.Однако по мере того, как происходит репликация и мутация вируса, эти целевые области циркулирующих вирусных геномов накапливают отличия последовательностей от эталонных. Таким образом, эффективность праймера со временем может снижаться. По мере накопления большего количества мутаций важно измерять скорость роста несоответствия между последовательностью праймера и целевым участком как функцию времени. Исходя из этой скорости, можно предвидеть, когда следует обновить целевые последовательности, используемые в региональном тесте. Чтобы оценить скорость мутаций целевых генов с течением времени, мы группируем геномы по дате отбора проб и суммируем количество несовпадений за каждый день.Чтобы уменьшить шум от дней с небольшим количеством собранных геномов, для любого анализа, основанного на времени, мы рассматриваем только те дни, когда было секвенировано более 100 уникальных геномов. С этим ограничением данные доступны за период с 1 января 2020 г. по 25 июля 2020 г., всего 207 дней. Этот процесс удаляет резко выделяющиеся данные, которые были секвенированы до начала пандемии, включая последовательности, которые были собраны от нечеловеческих хозяев.

Географические методы анализа

По мере того, как вирус распространился по всему миру, мы наблюдаем определенные мутации, характерные для вспышек в зависимости от географического местоположения.Как показали исследования с использованием байесовского коалесцентного анализа, высокие темпы эволюции и быстрый рост популяции вируса SARS-CoV-2 приводят к увеличению диверсификации вируса по географическому положению ¹⁹. Чтобы понять, как тесты ПЦР по-разному реагируют на геномы, собранные по странам, мы сначала извлекаем страну выборки для каждого генома из заголовка fasta, предоставленного GISAID, а затем группируем количество несоответствий, обнаруженных в геноме, по стране и за пределами страны.

Методы анализа клады

Геномы SARS-CoV-2 были разделены на клады для определения групп мутаций. Для этого анализа мы используем категории, указанные в NextStrain, которые определяются частотой и географическим распределением. Их сценарий для категоризации геномов в рамках определенных определений клад был использован для классификации каждого генома в наборе данных ²⁰. Кроме того, NextStrain публикует локус генома, который определяет каждую кладу, и эти локусы сравнивали с местоположением генома, с которым связываются мишени праймера.Группируя количество несовпадений для каждой ПЦР по кладу геномов, мы видим, как различные генетические вариации влияют на производительность теста ПЦР.

Как интерпретировать результаты ОТ-ПЦР?

Полимеразная цепная реакция обратной транскрипции в реальном времени, или ОТ-ПЦР, является стандартным методом диагностики COVID-19. Но тест хорош настолько, насколько хорош образец. Давайте посмотрим, как время сбора образцов и тип используемого образца влияют на результаты ОТ-ПЦР.

Как тип используемого образца влияет на результаты ОТ-ПЦР?

Образцы верхних дыхательных путей

Большинство образцов ОТ-ПЦР собирают из верхних дыхательных путей с помощью мазков из носоглотки, хотя можно также использовать мазки из ротоглотки, а в последнее время и слюну.Считается, что чувствительность и временной интервал одинаковы для всех трех типов образцов.

Эти образцы наиболее точны в течение первой недели после появления симптомов, а вирусная нагрузка снижается в течение следующих двух недель. Через четыре недели после появления симптомов ОТ-ПЦР скорее будет отрицательной, чем положительной. ¹

^{Рисунок 1. Образцы из верхних дыхательных путей обеспечивают наиболее точные результаты для диагностики COVID-19 с использованием тестирования полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени в первую неделю после появления симптомов.Через четыре недели после появления симптомов ОТ-ПЦР с большей вероятностью даст отрицательный результат (адаптировано из Sethuraman, N, Jeremiah SS, and Ryo A. 2020).}

Одно исследование с использованием образцов из верхних дыхательных путей сообщило о 38% ложноотрицательных результатах в день появления симптомов. Он упал до 20% на третий день после появления симптомов, но вырос до 67% примерно через две недели. ² Другие исследования показали аналогичную траекторию, но с разной частотой ложноотрицательных результатов.

^{Рисунок 2. При использовании полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени для диагностики инфекции SARS-CoV-2 количество ложноотрицательных результатов составляет 38% в день появления симптомов COVID-19. Этот показатель снижается до 20% на третий день после появления симптомов и неуклонно возрастает до 67% всего через две недели после появления симптомов (адаптировано из Kucirka, LM, Lauer, SA, Laeyendecker, O, et al., 2020).}

Итак, если вы тестируете пациента в течение первых нескольких дней после появления симптомов, стандартные образцы из верхних дыхательных путей кажутся достаточно надежными, хотя вы все равно можете пропустить значительное количество инфицированных людей.Но часто к тому времени, когда пациент поступает в больницу, у него могут быть симптомы более недели, что снижает надежность этих образцов.

Образцы нижних дыхательных путей

Образцы из нижних дыхательных путей, включая образцы мокроты и бронхоальвеолярного лаважа, как правило, более точны на более поздних стадиях заболевания, особенно для пациентов с пневмонией.

Вирусная нагрузка в этих образцах высока на ранней стадии заболевания, и они остаются положительными дольше, чем образцы из верхних дыхательных путей, особенно у пациентов с более тяжелым заболеванием.¹ Итак, для госпитализированного пациента с пневмонией образец мокроты может быть более надежным, чем мазок из носоглотки.

^{Рис. 3. Образцы нижних дыхательных путей, взятые с помощью бронхоальвеолярного лаважа или мокроты, имеют более высокую начальную вирусную нагрузку, которая сохраняется в течение более длительного периода после появления симптомов COVID-19. Таким образом, более точные результаты получаются с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени} ^{(RT-PCR), на более поздних стадиях болезни с использованием этих образцов по сравнению с образцами из верхних дыхательных путей (адаптировано из Sethuraman, N, Jeremiah SS, and Ре А.2020).}

Но не все пациенты могут получить образец мокроты, а бронхоальвеолярный лаваж — инвазивная процедура с образованием аэрозолей, поэтому они обычно не являются первым методом выбора.

Как я могу быть уверен, что отрицательный результат — это действительно отрицательный результат?

Снижение вирусной нагрузки не всегда происходит последовательно, даже у пациентов с легкой формой заболевания, и вирусная нагрузка может возрасти день ото дня, как показали исследования госпитализированных пациентов.³

^{Рис. 4. Вирусная нагрузка SARS-CoV-2 в мокроте и образцах носоглотки меняется со временем. В определенный день вирусная нагрузка может упасть ниже порогового значения, что приведет к отрицательному результату полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией} ^{(ОТ-ПЦР), в то время как вирусная нагрузка может повыситься в следующие дни, дав положительный результат ОТ-ПЦР. (По материалам Wolfel, R, Corman, VM, Guggemos, W, et al., 2020).}

Если рассматривать вирусную нагрузку с течением времени как с образцами носоглотки, так и с образцами мокроты, то в любой день мазок может дать положительный или отрицательный результат в зависимости от вирусной нагрузки.Например, может быть день, когда у пациента будет отрицательный результат теста, а позже — положительный результат. Вот почему два отрицательных теста, проведенных с интервалом не менее 24 часов, необходимы, чтобы объявить пациента, что он больше не инфицирован, и могут объяснить сообщения о пациентах, которые дали положительный результат в дни или недели даже после двух отрицательных тестов.

А как насчет тестирования пациентов без симптомов?

В одном исследовании сообщалось о 100% ложных отрицательных результатах в день заражения, которые снизились до 66% на четвертый день, предположительно за день до типичного появления симптомов.²

^{Рис. 5. У бессимптомных пациентов с инфекцией SARS-CoV-2 существует 100% ложноотрицательных результатов с полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией в реальном времени} ^{, или ОТ-ПЦР, в день инфекции и 66% ложноотрицательных результатов через четыре дня после заражения (адаптировано из Kucirka, LM, Lauer, SA, Laeyendecker, O, et al., 2020).}

Другое исследование показало, что пик передачи вируса происходит примерно за день до появления симптомов, поэтому вирусная нагрузка, вероятно, достаточно высока, чтобы ее можно было обнаружить в этот момент.⁴

^{Рис. 6. Оценки показывают, что вирусная нагрузка SARS-CoV-2 у бессимптомных пациентов достаточно высока для выявления инфекции с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени за день до появления симптомов (адаптировано из He, X, Lau, EHY, Wu, P, et al., 2020).}

По оценкам, те, у кого появляются симптомы, скорее всего, начнут давать положительный результат примерно за два дня до появления симптомов, но проблема в том, что мы не знаем, когда это произойдет!

Итак, важно знать, что бессимптомный человек, который контактировал с подтвержденным случаем или присутствовал на мероприятии, где были инфицированы другие, может еще не дать положительный результат теста на вирус.Они могут быть заражены, но мы пока не видим этого на RT-PCR. Вот почему этому человеку все еще необходимо принять соответствующие меры по дистанцированию или изоляции, чтобы предотвратить передачу.

Итак, ОТ-ПЦР положительный, что будет дальше?

Положительный тест ОТ-ПЦР просто указывает на присутствие вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК) в образце, но не говорит нам, является ли присутствующий вирус инфекционным или даже нетронутым. Когда вирус разрушается иммунной системой, он оставляет после себя некоторые вирусные компоненты, включая РНК, которые можно обнаружить с помощью ОТ-ПЦР.Но, конечно, одна эта РНК не заразна.

Чтобы определить, присутствует ли интактный вирус в дыхательных путях пациента, исследователи пытаются вырастить образец пациента в лаборатории, чтобы посмотреть, смогут ли они выделить сам вирус. Если они успешны, это указывает на то, что пациент выделяет интактный вирус, способный к репликации.

^{Рис. 7. Чтобы определить, есть ли в дыхательных путях пациента интактный SARS-CoV-2, исследователи пытаются изолировать вирус, выращивая образец пациента в лабораторных условиях.В случае успеха очевидно, что этот пациент выделяет интактный вирус, который может размножаться.}

Они могут сделать еще один шаг вперед и культивировать выделенный вирус на человеческих клетках. Если вирус способен инфицировать клетки человека, мы можем сделать вывод о наличии инфекционного вируса.

^{Рис. 8. Если SARS-CoV-2, выделенный из образца пациента, культивируется с человеческими клетками и заражает их, исследователи могут сделать вывод, что у этого пациента есть инфекционный вирус и он может передавать его другим.}

Исследователям удалось выделить живой вирус от госпитализированных пациентов в первую неделю после появления симптомов, при этом образцы мокроты производят больше живого вируса, чем мазки из носоглотки. По прошествии восьми дней после появления симптомов исследователи больше не могли изолировать жизнеспособный вирус из любого типа образца, предполагая, что пациенты могут не быть заразными после первой недели, даже если результаты ОТ-ПЦР остаются положительными намного дольше. ¹

^{Рисунок 9. Хотя результаты полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени} ^{(ОТ-ПЦР) могут быть положительными, SARS-CoV-2 не может быть выделен по истечении восьми дней после появления симптомов, независимо от типа используемого образца (адаптировано из Sethuraman, N , Иеремия С.С. и Ре А. 2020).}

Другое исследование показало корреляцию между пороговым значением цикла пациента, или значением C _t, и способностью культивировать инфекционный вирус из образцов верхних дыхательных путей.⁵ Значение C _t ниже 40 считается положительным тестом, чем ниже значение C _t, тем выше вирусная нагрузка. В их популяции пациенты со значением C _t 34 или выше не вырабатывали инфекционного вируса. Некоторые пациенты в этом исследовании дали положительный результат, но не оказались заразными. Таким образом, может существовать значение C _t, при котором пациенты перестают быть заразными, даже если они все еще выделяют вирусную РНК.

^{Рисунок 10. Пациенты с пороговым циклом (C _t) 34 или выше не дали положительной культуры SARS-CoV-2 и не оказались заразными (адаптировано из La Scola, B, Le Bideau, M, Andreani, J , et al., 2020).}

Эти результаты частично объясняют, почему CDC разрешает медицинским работникам вернуться к работе через десять дней после появления симптомов, если у них не было симптомов в течение как минимум 72 часов, даже если результаты ОТ-ПЦР все еще положительны.

Что мне делать, если результат теста моего пациента отрицательный?

Хотя положительный результат ОТ-ПЦР на SARS-CoV-2 является довольно надежным индикатором того, что ваш пациент инфицирован, нельзя исключить болезнь на основе одного отрицательного теста.

^{Рис. 11. Положительный результат полимеразной цепной реакции обратной транскрипции SARS-CoV-2 в реальном времени} ^{(ОТ-ПЦР) — надежный индикатор инфекции. Однако нельзя исключить заражение SARS-CoV-2 одним отрицательным результатом.}

Важно интерпретировать любой отрицательный результат в клиническом контексте. Посмотрите на клиническую картину пациента и задайте себе несколько вопросов:

Типична ли эта клиническая картина для COVID-19?
В чем их риск?
Были ли они близко контактировали с инфицированным человеком?
Работают ли они в сфере повышенного риска?
Практиковали ли они физическое дистанцирование и ношение маски на публике?

В случае сомнений проведите повторное испытание, возможно, используя другой тип образца.Рассмотрите возможность заказа других тестов, таких как компьютерная томография (КТ) или серологические тесты, чтобы обеспечить перекрестную проверку. И обязательно придерживайтесь строгих протоколов инфекционного контроля и изолируйте пациента, пока не получите больше уверенности в результате.

На этом пока все. Если вы хотите улучшить свое понимание ключевых концепций медицины и улучшить свои клинические навыки, обязательно зарегистрируйтесь для получения бесплатной пробной учетной записи, которая предоставит вам доступ к бесплатным видео и загрузкам.Мы поможем вам принять правильные решения для вас и ваших пациентов.

Полимеразная цепная реакция

в диагностике и лечении инфекций центральной нервной системы | Инфекционные болезни | JAMA Neurology

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это широко применяемый лабораторный тест для диагностики широкого спектра заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), включая генетические и аутоиммунные заболевания, злокачественные новообразования и инфекции. ¹ ^{, 2} Обладая способностью обнаруживать незначительные количества ДНК или РНК, содержащихся в тканях или жидкостях, ПЦР повысила скорость и точность диагностики, улучшила понимание патогенеза и помогла выявить инфекционные причины заболеваний, ранее считавшихся идиопатическими.Кроме того, ПЦР можно проводить на различных тканях, сохраняемых по-разному — даже архивные образцы могут использоваться для получения важной эпидемиологической информации. Быстрая и точная диагностика позволяет назначить соответствующее лечение и избежать ненужных или инвазивных исследований.

Сила ПЦР является результатом ее способности синтезировать миллионы копий определенного сегмента гена in vitro, начиная с одной или только нескольких копий матрицы, количество которых невозможно обнаружить другими методами.Метод ПЦР проиллюстрирован на рисунке 1. После того, как последовательность интересующего сегмента ДНК идентифицирована (матрица), выбираются 2 синтетических олигонуклеотида (праймера), последовательность которых комплементарна каждой цепи ДНК, подлежащей амплификации. Эти праймеры обычно имеют длину от 20 до 40 оснований. На первом этапе требуется денатурация двухцепочечной ДНК-матрицы путем ее нагревания до 92–95 ° C. Как только это произойдет, праймеры будут отжигаться с соответствующими дополнительными цепями матрицы после охлаждения до 55-70 ° C.Чтобы максимизировать отжиг праймер-матрица по сравнению с повторным отжигом матрица-матрица, праймеры поставляются в большом количестве; таким образом, доступно больше праймеров для связывания, чем цепей ДНК de novo. Связывание праймеров с матрицей — это только первый шаг. Чтобы построить новую цепь ДНК, комплементарную матрице, необходимы 2 основных ингредиента: нуклеотиды (аденин, гуанин, тимидин, цитозин) и фермент, катализирующий их связывание (ДНК-полимераза). Предоставляя нуклеотиды в огромном молярном избытке и используя термостабильную ДНК-полимеразу (обычно Taq полимераза), новая комплементарная последовательность ДНК ниже отожженного праймера собирается, в результате чего образуются 2 полные пары двухцепочечной ДНК.Это завершает первый цикл. Множественные циклы (обычно 30-40) денатурирования, отжига новых праймеров и удлинения цепи в конечном итоге дают более 1 миллиарда копий исходной ДНК-матрицы за 2-3 часа. Вся реакция завершается в автономном термоциклере с использованием очень малых объемов (микролитров) реагентов и образца.

Когда важно знать не только то, что ген (ДНК) присутствует, но также и то, что он экспрессируется и транскрибируется в информационную РНК (мРНК), или когда РНК-вирусы являются целью обнаружения, вариант ПЦР, называемый обратным можно использовать ПЦР с транскриптазой (ОТ-ПЦР).Общий принцип идентичен изложенному выше, но вместо полимеразы Taq используется фермент с активностью обратной транскриптазы, который сначала выполняет обратную транскрипцию мРНК в комплементарную ДНК. Комплементарная ДНК затем служит матрицей, из которой амплифицируется интересующий сегмент. Ситуации, в которых это может быть важно, включают заболевания, вызванные генетическими дефектами с переменной пенетрантностью, или вирусные инфекции, в патогенезе которых играет роль как латентная, так и литическая инфекция (например, герпесвирусы).

Продукты амплификации ПЦР можно обнаружить с помощью различных методов. Продукты могут быть загружены в агарозный гель, окрашенный бромидом этидия, а затем подвергнуты электрофорезу, что позволяет осуществить миграцию продукта ДНК в его предполагаемое место в геле на основе размера образованного фрагмента (определяемого расстоянием между 2 выбранными праймерами). Однако, чтобы убедиться, что эти продукты являются специфичными, необходимо провести Саузерн-блоттинг. В этом процессе целевая ДНК переносится и иммобилизуется на мембране, а затем маркируется дополнительным зондом, к которому прикреплен радиоактивный, флуоресцентный или колориметрический маркер.Дополнительный метод, который можно использовать для повышения специфичности продуктов, называется вложенной ПЦР . В этом методе второй раунд ПЦР выполняется с использованием праймеров, внутренних по отношению к исходным праймерам, таким образом идентифицируя только подмножество продуктов амплификации, которые соответствуют целевому фрагменту. Вложенная ПЦР также может использоваться для повышения чувствительности ПЦР. Возможно, лучшим стандартом для обеспечения специфичности является секвенирование продуктов ПЦР и сравнение последовательности с известной последовательностью целевого гена.Однако секвенирование продуктов ПЦР обычно не выполняется в качестве рутинной процедуры, и его использование в значительной степени ограничивается первоначальной проверкой анализов ПЦР и в качестве инструмента исследования.

Синтез неспецифических продуктов может привести к ложноположительным результатам ПЦР, если не будут предприняты соответствующие шаги для подтверждения специфичности. Может произойти неправильный запуск (связывание праймеров с неправильной областью ДНК), но это можно свести к минимуму, увеличив «жесткость» условий реакции, и можно обнаружить, если не удается найти амплифицированный материал с помощью саузерн-блоттинга.Ложноположительные результаты ПЦР также могут возникать из-за загрязнения реакций нуклеиновой кислотой либо продуктами предыдущих реакций (переход), либо присутствующими в лабораторных условиях. Опытные лаборатории принимают всесторонние меры предосторожности, чтобы избежать источников непреднамеренного заражения, включая надлежащий дизайн лабораторных помещений и протоколы работы с образцами. Отрицательные контроли используются во всех прогонах реакций для обнаружения непреднамеренного загрязнения.

Актуальность для практики неврологии

Существует множество областей, в которых ПЦР может непосредственно применяться в клинической практике.² В этом обзоре мы сосредоточимся на применении ПЦР для диагностики и лечения инфекционных неврологических заболеваний. ² ^{, 3}

Вирусы являются распространенными возбудителями некоторых неврологических заболеваний (например, менингита, энцефалита и миелита). Выделить многие вирусы стандартными методами культивирования клеток сложно, а зачастую и невозможно. Даже для вирусов, таких как энтеровирусы, которые обычно более поддаются культивированию, для точной идентификации может потребоваться продолжительный период (часто до 8 дней).Ложноотрицательные культуры являются обычным явлением и могут встречаться в 25–35% образцов, а некоторые серотипы энтеровирусов вообще не растут в культуре клеток. В случае энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса (ВПГ), у взрослых вирус почти никогда не обнаруживается в спинномозговой жидкости (ЦСЖ) при культивировании. В результате этих проблем до широкого использования ПЦР-теста спинномозговой жидкости в вирусной диагностике пациенты часто получали ненужную эмпирическую противомикробную терапию в течение длительных периодов времени и подвергались инвазивным диагностическим процедурам, таким как биопсия головного мозга.Серологическая диагностика вирусных инфекций ЦНС ограничивается, прежде всего, временем, необходимым для обнаружения высоких уровней продукции специфических антител (часто 2-3 недели от начала заболевания), или повсеместной серопозитивностью к определенным вирусам (например, HSV). Косвенные доказательства вирусной инфекции, такие как стул или респираторное выделение, могут быть полезны, но они не обязательно коррелируют с активным заболеванием ЦНС (например, периодическое выделение цитомегаловируса с мочой или респираторным секретом, а также длительное выделение энтеровирусов происходят при бессимптомном течении болезни. лиц).Полимеразная цепная реакция привлекательна тем, что позволяет обойти большинство этих ограничений. В таблице 1 представлен широкий спектр вирусных инфекций ЦНС, для которых клинически применима ПЦР. По мере того как будут идентифицированы более специфические противовирусные соединения, которые можно использовать в терапевтических целях, точная диагностика будет становиться все более важной.

Помимо вирусных инфекций, ПЦР также используется для диагностики бактериальных, микобактериальных, риккетсиозных и протозойных инфекций ЦНС (таблица 2).

Часто бывает трудно точно определить чувствительность и специфичность ПЦР при инфекциях ЦНС, потому что в некоторых ситуациях ранее используемые стандарты диагностики оказываются менее чувствительными, чем ПЦР. Существующие стандарты, такие как вирусный посев спинномозговой жидкости, часто бывают нечувствительными и медленными. В некоторых случаях окончательный диагноз был основан на инвазивных процедурах, таких как биопсия головного мозга, которая могла быть выполнена только у тяжелобольных пациентов, потенциально создавая искаженную картину тяжести или характера заболевания (например, энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса).Несмотря на крайнюю чувствительность ПЦР, все же случаются ложноотрицательные результаты. В случае большинства вирусных инфекций самые высокие уровни нуклеиновой кислоты присутствуют остро и обычно снижаются при лечении или с течением времени. Задержка в проведении ПЦР может привести к ложноотрицательным результатам. Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в жидкостях или тканях организма и могут приводить к ложноотрицательным результатам. В спинномозговой жидкости наиболее часто встречающимися ингибиторами являются гемовые продукты, возникающие в результате распада эритроцитов. Небольшое количество эритроцитов в образцах спинномозговой жидкости не препятствует ПЦР, но это может быть проблемой для образцов спинномозговой жидкости, сильно загрязненных кровью.В образцах с высоким уровнем белка или высоким числом лейкоцитов ингибирования не отмечено. В отличие от других образцов, CSF имеет тенденцию иметь низкие концентрации эндонуклеаз / экзонуклеаз и белков, которые могут ингибировать действие полимеразы.

Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием всего 30 мкл спинномозговой жидкости. Полимеразные цепные реакции лучше всего проводить на свежих образцах спинномозговой жидкости, хотя кратковременное (дни) хранение спинномозговой жидкости при температуре холодильника, по-видимому, не приводит к значительному снижению диагностической эффективности.Положительные результаты ПЦР были получены для образцов спинномозговой жидкости, которые были заморожены в течение многих лет, но снижение чувствительности с течением времени тщательно не исследовалось. В целом ДНК оказывается более стабильной при хранении, чем РНК, которая более подвержена деградации. Наконец, короткие курсы (например, несколько дней) антимикробной терапии, по-видимому, не оказывают значительного влияния на результаты ПЦР, что является большим преимуществом по сравнению с методами культивирования, при которых диагностические результаты часто резко падают даже после коротких периодов антимикробной терапии.

Другие клинические применения и актуальность для исследования нейробиологии

Помимо помощи в диагностике инфекционных заболеваний, ПЦР может использоваться для множества других целей. Полимеразная цепная реакция может облегчить дифференциальную диагностику между рецидивирующей вирусной инфекцией, которая, как ожидается, будет положительной на ПЦР, и постинфекционным иммуноопосредованным заболеванием, которое отрицательно на ПЦР.Например, после противовирусной терапии энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса, у некоторых пациентов наблюдается клинический рецидив. Положительный результат ПЦР CSF HSV предполагает, что это вызвано рецидивирующей вирусной инфекцией, и поддерживает возобновление противовирусной терапии. Отрицательный результат ПЦР соответствует постинфекционному иммуноопосредованному процессу, и дополнительная противовирусная терапия редко имеет значение. Полимеразная цепная реакция может использоваться для идентификации детерминант лекарственной устойчивости путем секвенирования ПЦР-амплифицированных генов, кодирующих мишени для противовирусной терапии.Например, ПЦР-амплификация и секвенирование выбранных вирусных генов у пациентов с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) может помочь выявить мутации, которые коррелируют с устойчивостью к специфическим антиретровирусным препаратам. Поскольку методы ПЦР стали более сложными, теперь во многих случаях стало возможным точно определить количество нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, а не просто обеспечить качественное обнаружение. Количественная ПЦР может оказаться полезной для мониторинга продолжительности и адекватности терапии или для получения прогностической информации о заболевании.Качественная ПЦР все чаще используется для изучения инфекции ЦНС, вызванной ВИЧ и ВПГ. В случае неонатального энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса, качественная ПЦР привела к изменению рекомендованной дозировки и продолжительности терапии ацикловиром и привела к более широкому использованию дополнительной пероральной терапии после первичной внутривенной противовирусной терапии. В случае ВИЧ-инфекции количественное определение вирусной нагрузки в спинномозговой жидкости активно исследуется как потенциальный маркер риска и тяжести ВИЧ-ассоциированной энцефалопатии.Полимеразная цепная реакция также может помочь определить потенциальную роль вирусов или других микробных патогенов в неврологических и психических заболеваниях с неопределенными причинами, включая шизофрению, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания. Одним из интересных результатов первоначальных исследований в этой области является частота, с которой нуклеиновая кислота, соответствующая множеству вирусных патогенов, может быть идентифицирована в ткани мозга даже у пациентов без известных неврологических заболеваний.Напротив, результаты ПЦР ЦСЖ почти всегда отрицательны у бессимптомных лиц без известных неврологических заболеваний. В случае CSF положительные результаты ПЦР почти всегда коррелируют с наличием клинически значимого заболевания. Значение положительных результатов ПЦР в ткани мозга следует интерпретировать с большой осторожностью, пока не будут выяснены природа, значение и частота «нормальной геномной флоры мозга», идентифицированной с помощью ПЦР.

Принята к публикации 8 января 1999 г.

Это исследование было поддержано грантами программы Merit Review and Research Enhancement Award от Департамента по делам ветеранов, Вашингтон, округ Колумбия; по гранту DAMD17-98-8614 от армии США, Вашингтон, округ Колумбия; и грантом 5R01AG14071 Национального института старения, Бетесда, Мэриленд (доктор Тайлер).

Мы благодарим Адриану Вайнберг, доктор медицины, за ее вдумчивые комментарии.

Автор, ответственный за переписку: Кеннет Л. Тайлер, доктор медицины, отделение неврологии, B-182, Центр медицинских наук Университета Колорадо, 4200 E Девятая авеню, Денвер, CO 80262 (электронная почта: [email protected]).

1.Ерлих HAGelfand ДСнинский JJ Последние достижения в области полимеразной цепной реакции. Наука. 1991; 2521643-1651Google ScholarCrossref 2. Дарнелл Р.Б. Полимеразная цепная реакция: приложение к заболеваниям нервной системы. Ann Neurol. 1993; 34513-523Google ScholarCrossref 3.Weber TFrye SBodemer MOtto MLuke W Клиническое значение методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики вирусных инфекций нервной системы. J Neurovirol. 1996; 2175-190Google ScholarCrossref 4. Читать SJJeffery KJMBangham CRM Асептический менингит и энцефалит: роль ПЦР в диагностической лаборатории. J Clin Microbiol. 1997; 35691-696Google Scholar5.Bergstrom T Полимеразная цепная реакция для диагностики инфекций центральной нервной системы, вызванных вирусом ветряной оспы, без кожных проявлений. Scand J Infect Dis Suppl. 1996; 10041-45Google Scholar6.Fodor П.А.Левин MJWeinberg ATyler KL Атипичный энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса, диагностированный с помощью ПЦР-амплификации вирусной ДНК из спинномозговой жидкости. Неврология. 1998; 51554-549Google ScholarCrossref 7.Lakeman FDWhitley RJ для Национальной группы совместных противовирусных исследований аллергии и инфекционных заболеваний, Диагностика герпетического энцефалита: применение полимеразной цепной реакции к спинномозговой жидкости у пациентов, подвергшихся биопсии мозга, и корреляция с заболеванием. J Infect Dis. 1995; 171857-863Google ScholarCrossref 8.Landgren MKyllerman MBergstrom Т.Дотевалл LLjungstrom LRicksten Диагностика инфекции центральной нервной системы, вызванной вирусом Эпштейна-Барра, путем амплификации ДНК из спинномозговой жидкости. Ann Neurol. 1994; 35631-635Google ScholarCrossref 9. Liedtke WMalessa RFaustmann PMEis-Hubinger Результаты ПЦР AM HHV-6 при ВИЧ-ассоциированном неврологическом заболевании и рассеянном склерозе. J Neurovirol. 1995; 1253–258Google ScholarCrossref 10. McGuire ДБархит Шолландер HMiles ДНК вируса M JC в спинномозговой жидкости пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека: прогностическая ценность для прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии. Ann Neurol. 1995; 37395–399Google ScholarCrossref 11.Pratt Р.Д.Чолс SMcKinney N и другие. Вирусологические маркеры вируса иммунодефицита человека 1 типа в спинномозговой жидкости инфицированных детей. J Infect Dis. 1996; 174288-293Google ScholarCrossref 12. Rotbart HAAhmed AHickey S и другие. Диагностика энтеровирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции на нескольких типах образцов. Ped Infect Dis J. 1997; 16409-411Google ScholarCrossref 13.Вайнберг Аспиерс DCai G-YLong CMSun RTevere V Оценка коммерческого набора для ПЦР для диагностики цитомегаловирусной инфекции центральной нервной системы. J Clin Microbiol. 1998; 363382-3384Google Scholar14.Centurion-Lara ACastro CShaffer Дж. М. Ван Вурхис WCMarra CMLukehart SA Обнаружение бледной трепонемы с помощью чувствительной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой. J Clin Microbiol. 1997; 351348-1352Google Scholar15.Kox Л.Ф.Куйпер Сколк AH Ранняя диагностика туберкулезного менингита методом полимеразной цепной реакции. Неврология. 1995; 452228-2232Google ScholarCrossref 16.Pachner А.Р.Делани E Полимеразная цепная реакция в диагностике нейроборрелиоза Лайма. Ann Neurol. 1993; 34544-550Google ScholarCrossref 17.Rodriguez JCMartinez MMMartinez ARRoyo G Оценка различных методов диагностики энцефалита Toxoplasma . J Med Microbiol. 1997; 46597-601Google ScholarCrossref

PCR: Тридцать пять лет и новые надежды | Наука

Технология Feature

Автор Алан Дав 9 10 13 мая. 10, 2018, 14:00

За 35 лет, прошедших с момента изобретения, полимеразная цепная реакция (ПЦР) стала стандартным методом в лабораторной биологии, но ученые продолжают находить новаторские — и даже спасающие жизнь — применения для нее.

В мае 1983 года Кэри Маллис, в то время учёный в Cetus Corporation в Эмеривилле, Калифорния, синтезировал некоторые олигонуклеотиды, смешал их с небольшим количеством матричной ДНК и добавил фермент полимеразу и несколько других реагентов. После серии инкубаций полимераза многократно скопировала шаблон в цепной реакции, как и надеялся Маллис.

Mullis в конечном итоге отошел от научного мейнстрима, и Cetus был поглощен рядом других компаний, но PCR сохранилась.Подобно шаблонам ДНК, на которые она нацелена, ПЦР была воспроизведена, амплифицирована и распространена в лабораториях по всему миру. Специализированные термоциклеры и связанные с ними инструменты наводняют рынок, поставщики продают широкий выбор термостабильных полимераз, а студенты во всем мире изучают эту технику на вводных курсах биологии.

В настоящее время отмечает свое 35-летие, ПЦР стал повсеместным лабораторным инструментом. Тем не менее исследователи, инженеры и врачи все еще находят способы продвинуть его на новые территории.Выборка некоторых из этих усилий показывает, насколько далеко расширился охват ПЦР: от молочных заводов до клиник, и от классных комнат до космоса.

Подобно шаблонам ДНК, на которые она нацелена, ПЦР была воспроизведена, амплифицирована и распространена в лабораториях по всему миру.

Последовательность запуска

Основным аппаратным компонентом ПЦР является термоциклер, устройство, способное быстро нагревать и охлаждать пробирки для образцов и поддерживать их при точной температуре в течение определенных периодов времени.Хотя три десятилетия разработки и конкуренции значительно улучшили эти машины, они все еще относительно тяжелые, энергоемкие и дорогие. В результате один из определяющих методов современной молекулярной биологии оставался недоступным для преподавателей и непригодным для использования во многих удаленных местах.

«ПЦР — одна из наиболее важных [исследовательских] технологий, и все же она является одной из самых ограничивающих, когда вы находитесь за пределами лаборатории из-за размера и стоимости оборудования», — говорит Зик Альварес-Сааведра, генетик и соучредитель MiniPCR в Кембридже, Массачусетс.Разочарованный постоянной неподвижностью ПЦР, Альварес-Сааведра в 2013 году вместе с молекулярным нейробиологом Себастьяном Кравесом создали портативный термоциклер.

Большинство термоциклов контролируют свою температуру с помощью переходов Пельтье, термоэлектрических устройств, которые могут быстро переключаться между нагревом и охлаждением. К сожалению, переходы Пельтье неэффективны, а компоненты, необходимые для их работы, делают машины ПЦР тяжелыми и жадными до электричества.

Альварес-Сааведра и Кравес использовали другой подход, нагревая образцы с помощью тонкопленочного резистивного нагревателя, аналогичного обогревателям окон в автомобилях.Для охлаждения команда использует простой вентилятор. Микроконтроллер управляет циклами нагрева, охлаждения и инкубации. Благодаря более простой конструкции машина стала намного меньше и легче обычных термоциклеров, а также принесла другие преимущества. «Когда вы делаете что-то меньшее, в нем меньше деталей и меньше блок питания … так что это помогает снизить стоимость», — говорит Альварес-Сааведра.

Как они и надеялись, недорогая система MiniPCR сразу понравилась школам. «Учеба в старшей школе без возможности приблизиться к биотехнологиям была своего рода болевой точкой для нас, [когда мы] становились учеными, поэтому мы хотели избавиться от этих препятствий», — говорит Кравес.Компания также разработала небольшую простую систему электрофореза в агарозном геле в качестве сопутствующего продукта. Полный комплект с термоциклером MiniPCR, гелевой системой и аксессуарами продается менее чем за 1000 долларов США, что позволяет уложиться в бюджеты многих школьных систем.

Хотя школы стали основным рынком для MiniPCR, другие также быстро приняли эту платформу. Кравес говорит, что полевые ученые, животноводы и пищевые компании все использовали эту систему, часто находя дешевле и быстрее проводить собственные анализы на основе ПЦР на месте, а не отправлять образцы в удаленную лабораторию.

Однако самый неожиданный звонок поступил от инженеров, работающих на Международной космической станции. «Мы никогда не проектировали эту технологию так, чтобы она была удобной для космоса, поэтому мы были удивлены, когда космические агентства … сказали нам, что она очень хорошо разработана для космических полетов», — говорит Кравес. Система MiniPCR теперь является основным компонентом текущего конкурса «Гены в космосе», где учащиеся средних школ предлагают эксперименты на основе ПЦР, которые затем проводятся астронавтами на космической станции в условиях микрогравитации
.

Смартфон PCR

MiniPCR была первой компанией, которая запустила ПЦР в космос, но они не единственные, кто пытался сделать этот метод более дешевым и портативным. Ahram Biosystems в Сеуле, Южная Корея, продает миниатюрный термоциклер Palm PCR, который похож на устройство MiniPCR. Между тем, Biomeme в Филадельфии, штат Пенсильвания, выводит идею портативной ПЦР на новый уровень, расширяя ее, чтобы включить ПЦР в реальном времени.

В режиме реального времени или количественной ПЦР (кПЦР) экспериментаторы используют флуоресцентные маркеры для непрерывного мониторинга процесса амплификации ПЦР.Измеряя скорость появления новых копий ДНК, исследователи могут вычислить, сколько молекул-шаблонов должно было быть в исходном образце. Они также могут считывать результаты непосредственно из реакционных пробирок для ПЦР без использования агарозных гелей. Однако весь этот мониторинг и вычисления требуют значительной вычислительной мощности и дополнительного оборудования, что делает количественную ПЦР еще более сложной и дорогой, чем стандартная ПЦР.

Соучредители Biomeme Марк ДеДжон, Джесси ван Вестринен и Макс Перельман думали, что несвязанная тенденция может помочь вывести количественную ПЦР из лаборатории.«Мы подумали:« Эй, у каждого есть смартфон в кармане », [и] мы действительно не видели, чтобы кто-нибудь использовал их для молекулярной диагностики», — говорит ван Вестринен. Решая те же инженерные проблемы, с которыми MiniPCR столкнулся со своим термоциклером, Biomeme также справился с трудностями добавления оптических датчиков через приложение для смартфона, которое может контролировать и отслеживать реакции qPCR, а также стабильные наборы реагентов для подготовки проб.

Для использования в полевых условиях «пробоподготовка, пожалуй, самая сложная вещь…. и с самого начала одной из наших задач была разработка очень простого продукта, не требующего каких-либо знаний или специального лабораторного оборудования », — говорит ван Вестринен. Результатом стал каталог наборов, предназначенных для различных применений, каждый из которых содержит лиофилизированные реагенты и праймеры, предварительно отмеренные в пробирках для образцов.

Перельман говорит, что с помощью одного из наборов компании минимально обученный экспериментатор может за несколько минут превратить неочищенный образец в набор реакций количественной ПЦР, готовых для термоциклера.Сама машина имеет док-станцию, совместимую со стандартными разъемами для смартфонов. Веб-портал данных Biomeme может хранить полученные необработанные данные, которые исследователи могут анализировать онлайн или загружать на свои компьютеры.

Текущее устройство Biomeme стоит около 4000 долларов США, оно значительно дороже, чем система MiniPCR, но Перельман утверждает, что оно предлагает дополнительную полезность: «Вы можете завершить все менее чем за час … просто проведите пальцем влево или вправо в приложении и [ вы] можете видеть усиление в реальном времени.Перельман добавляет, что теперь компания работает с пользователями из числа оборонных и правоохранительных органов, а также с полевыми учеными и пищевыми компаниями.

Быстрые и мертвые

В то время как портативный ПЦР значительно расширяет возможности этого метода, исследователи во всем мире также продолжают расширять его возможности бесчисленными способами. Хороший тому пример — отличить живые бактерии от мертвых.

ПЦР

чрезвычайно чувствительна и специфична для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот, но простое знание того, что конкретная последовательность ДНК или РНК присутствует, не доказывает, что она связана с живым организмом.Это серьезная проблема в пищевой промышленности, где как пастеризованные, так и непастеризованные продукты дают положительный результат на патогенные бактерии с помощью ПЦР, даже если бактерии безопасно мертвы в первом и опасно живы во втором. В результате пищевые лаборатории долгое время полагались на относительно медленные и громоздкие анализы культур для окончательного тестирования.

Реагенты

для сшивания ДНК, которые могут проникать только в мертвые бактерии, стали первым крупным достижением в этой области. Сшивание предотвращает амплификацию ДНК мертвых бактерий в последующей реакции ПЦР.С первым поколением этих реагентов было сложно работать, требовалось темное помещение и бережное хранение в холодильнике. Совсем недавно Такаши Соедзима и его коллеги из Morinaga Milk Industry в Канагаве, Япония, разработали стабильные, светостойкие соединения, которые аналогичным образом нацелены на мертвые бактерии. Последняя работа команды касалась реагентов на основе палладия, которые избирательно мешали ПЦР-амплификации ДНК мертвых, но не живых бактерий. Объединение палладиевых реагентов с КПЦР дало тест, который может заменить старые и более дорогие методы, оптимизируя производство на молочных заводах и других предприятиях пищевой промышленности ( 1 ).

Получение капли от рака

Исследователи и производители оборудования также внесли более радикальные изменения в ПЦР, заимствуя технологии из других областей. Одна из таких попыток привела к цифровой ПЦР с каплями (ddPCR), которая сочетает в себе аспекты сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, с традиционной ПЦР. Хотя протокол для ddPCR несколько сложен, он также стал высоко автоматизированным. Действительно, Bio-Rad в Геркулесе, Калифорния, теперь продает полные аппараты ddPCR, которые могут выполнять всю процедуру автоматически.В этих системах распылитель разделяет подготовленную реакцию ПЦР на тысячи капель размером нанолитр, а затем удерживает капли отдельно во время этапов термоциклирования. Каждая капля содержит свою собственную серию амплификаций, которую затем машина сортирует с помощью флуоресцентных маркеров для обнаружения целевых последовательностей.

ddPCR оказался особенно полезным для обнаружения дефицитных мишеней в образцах с очень высокими фоновыми уровнями нецелевой ДНК, таких как маркеры опухоли ДНК, циркулирующие в образцах крови пациентов.Этот метод стал достаточно надежным, чтобы по крайней мере одна компания, Biodesix в Боулдере, штат Колорадо, теперь предлагает клинические тесты, называемые «жидкой биопсией», на основе ddPCR. Используя небольшой образец крови, тест Biodesix может быстро определить точные мутации в опухоли пациента с раком легкого, что позволяет врачам выбрать наиболее эффективные лекарства для этого типа опухоли.

«Как только мы узнаем точные мутации, появятся целевые методы лечения, которые могут повлиять на их результат, и это так…. изменение всей парадигмы того, как мы лечим пациентов », — говорят Марк Боулинг, Пол Р. и Кэтрин М. Хеттингер Уокер, заслуженный профессор клинической онкологии в Университете Восточной Каролины в Гринвилле, Северная Каролина, и один из первых приверженцев новой контрольная работа. В то время как обычный анализ биопсии и секвенирование могут дать ту же информацию, тест Biodesix выполняется намного быстрее. «Мы можем получить результаты тестов в течение трех дней», — говорит Боулинг. Стандартная биопсия может занять более двух недель.Боулинг говорит, что разница может буквально означать жизнь или смерть для пациентов, опухоли которых поддаются таргетной терапии.

Поскольку тест Biodesix основан на ПЦР, ему есть куда расширяться, поскольку производители лекарств выпускают более генетически ориентированные препараты. Однако Боулинг говорит, что даже при ограниченном выборе текущих целевых химиотерапевтических препаратов, знание точного типа опухоли пациента уже примерно в трети случаев меняет стратегию лечения его команды.

Создание лучшего цикла

Клинические испытания всегда были в центре внимания разработчиков ПЦР, но иногда требования техники сдерживали их.Первая публикация, подтверждающая принцип действия, описывающая метод ПЦР Маллиса, продемонстрировала, как его можно использовать для идентификации мутации гемоглобина, ответственной за серповидно-клеточный признак ( 2 ). К сожалению, ПЦР остается слишком дорогостоящим для многих клинических лабораторий в Африке к югу от Сахары, где серповидно-клеточная анемия является эндемическим заболеванием.

Несмотря на то, что ПЦР продолжает расширяться в новые области, эти и другие ограничения вдохновили многочисленных исследователей на разработку альтернативных методов амплификации нуклеиновых кислот.Многие из этих методов работают с аналогичными принципами, но предлагают разные наборы преимуществ. Амплификация с множественным смещением, в которой используется высокопроцессивная полимераза, стала стандартной техникой в геномном секвенировании, в то время как амплификация с вращающимся кругом, которая может многократно копировать целевую последовательность на одну цепь ДНК, нашла широкое применение в биохимии.

Между тем, петлевая изотермическая амплификация (LAMP) стала популярным выбором для исследователей, которые хотят провести тесты на основе ДНК в сельской местности.Как следует из названия, LAMP использует фермент, который может открывать и многократно копировать молекулу ДНК при постоянной температуре, устраняя необходимость в дорогостоящих термоциклерах.

Это привлекательно для таких компаний, как LaCAR MDx Technologies в Льеже, Бельгия, которые пытаются разработать клинические тесты для использования в менее развитых странах. «Мы просто искали способ упростить молекулярно-генетическое тестирование. Вы можете использовать какой-нибудь картридж или [устройство ПЦР], но тогда вам понадобятся дорогие материалы и сложная технология », — говорит Арно Аллаер, генеральный директор LaCAR.

Вместо этого компания начала работать с LAMP и быстро обнаружила, что она чрезвычайно надежна. Помимо работы без термоциклера, тесты компании на основе LAMP могут идентифицировать точечные мутации в гене из свежих или замороженных образцов крови или даже из сухих пятен крови на промокательной бумаге, не требуя стадии извлечения ДНК. Наконец, выполнив обещание оригинальной ПЦР-бумаги, LaCAR теперь разработала недорогой, надежный тест на серповидно-клеточную характеристику, основанный на своих выводах.«Мы провели одно клиническое испытание в Университете Льежа, [и] мы проведем одно также в Конго», — говорит Аллаер ( 3 ).

Независимо от того, производят ли они портативные термоциклеры, используют передовые ПЦР-тесты для быстрой диагностики рака или изучают другие методы, позволяющие избавиться от ограничений ПЦР, эксперты в этой области с оптимизмом смотрят на следующие 35 лет амплификации ДНК. «Это захватывающее время», — говорит Боулинг.

Список литературы

1. T. Soejima, K. Iwatsuki, Appl.Environ. Microbiol. 82 , 6930–6941 (2016).

2. Р. К. Сайки, и др., ., Science , , 230, , 1350–1354 (1985).

3. Л. Детеммерман, С. Оливье, В. Бурс, Ф. Бёмер, Гематология 23 , 181–186 (2018).