Yingliang Duan

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук, Ухань 430071, Китай

Линфэн Мяо

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук, Ухань 430071 , Китай

Hanqing Ye

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук, Ухань 430071, Китай

Цуйцин Ян

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии , Китайская академия наук, Ухань 430071, Китай

Биши Фу

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук, Ухань 430071 , Китай

Филип Х.Schwartz

² National Human Neural Stem Cell Resource, Children’s Hospital of Orange County Research Institute, Orange, CA 92868, USA

Simon Rayner

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии, Китайская академия Наук, Ухань 430071, Китай

Элизабет А. Фортунато

³ Департамент биологических наук и Центр репродуктивной биологии, Университет Айдахо, Москва, ID 83844-3052, США

Мин-Хуа Ло

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук, Ухань 430071, Китай

¹ Государственная ключевая лаборатория вирусологии, Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук, Ухань 430071, Китай

² National Human Neural Stem Cell Resource, Children’s Hospital of Orange County Research Institute, Orange, CA 92868, USA

³ Departm Отделение биологических наук и Центр репродуктивной биологии Университета Айдахо, Москва, ID 83844-3052, США

Получено 7 февраля 2012 г .; Принято 5 апреля 2012 г.

Реферат

Иммунофлуоресцентный анализ (ИФА) — один из наиболее часто используемых методов в биологических науках и клинической диагностике, но он дорог и требует много времени.Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали более быстрый и экономичный IFA (f-IFA) путем модификации стандартного IFA и применили этот метод для отслеживания прогрессирования инфекции цитомегаловируса человека (HCMV) в различных клетках. Разработанный нами f-IFA не только экономит время, но и значительно снижает количество антител (Ab), что облегчает применение IFA в клинической диагностике. Для f-IFA требуется всего 15 минут для блокирования, 10 минут инкубации для каждого первичного и вторичного Abs с последующей 1-минутной интенсивной промывкой после каждой инкубации.Только 25 мкл разбавленного раствора Ab требовалось для каждого покровного стекла на этапах первичной и вторичной инкубации Ab. Кроме того, все этапы выполнялись при комнатной температуре. Этот f-IFA успешно применялся для отслеживания проникновения вириона (pp65) и экспрессии вирусных генов (IE1, UL44 и pp65) с целью отслеживания деталей процесса инфицирования HCMV. Мы обнаружили, что ~ 0,5% инфицированных HCMV клеток T98G образовывали множество микроядер (IE1 и окрашивание ядер) и имели выделение вируса (окрашивание pp65) с помощью f-IFA, что не могло быть обнаружено с помощью традиционного IFA.Наши результаты показали, что f-IFA — это чувствительный, удобный, быстрый и экономичный метод для изучения деталей развития вирусной инфекции, особенно инфекции HCMV. Более быстрая и экономичная функция с более высокой чувствительностью и специфичностью означает, что f-IFA имеет потенциальное применение в клинической диагностике.

Ключевые слова: иммунофлуоресцентный анализ , цитомегаловирус человека, проникновение вируса, экспрессия вирусного гена, репликация вируса

Введение

Иммунофлуоресцентный анализ (IFA) часто используется в клеточной и молекулярной биологии для демонстрации местоположения и функций целевых белков (e .г. клеточные и неклеточные, внутриклеточные и мембранные, эндогенные и экзогенные белки) [1,2]. Есть два подхода к подготовке образцов, используемых в IFA. Первый метод использует клетки [2] или микробы [1], которые бросают, сушат и фиксируют на покровных стеклах / предметных стеклах; второй метод использует прилипшие клетки, которые выращивают непосредственно на покровных стеклах [3,4], сохраняя естественную морфологию клеток и более четко и точно показывая положение целевого белка. Кроме того, методы IFA можно разделить на прямой иммунофлуоресцентный анализ (dIFA) и непрямой иммунофлуоресцентный анализ (iIFA) в соответствии с антителами (Abs), используемыми для обнаружения.В dIFA флуоресцентный краситель конъюгирован с первичным Ab, которое специфически связывается с целевым белком. Флуоресцентный сигнал обнаруживается, когда краситель активируется светом соответствующей длины волны. В iIFA вторичное Ab, которое специфически связывается с первичным Ab, конъюгировано с флуорофором, который аналогичным образом активируется возбуждающим излучением.

Окрашивание IFA включает блокирование, инкубацию Ab и их промежуточные отмывки. Ограничивающими факторами стадии окрашивания являются продолжительность и объем / количество Ab.Основные недостатки текущих IFA заключаются в том, что они требуют больших затрат времени и средств; время каждой инкубации и отмывки может увеличиваться до нескольких часов, а объем раствора Ab может достигать миллилитров [4,5]. Таким образом, несмотря на свою полезность, ИФА не является рентабельным в клинической диагностике, и необходимо повысить эффективность ИФА.

Нашей целью было преодоление этих ограничений путем разработки более быстрого, удобного и экономичного метода IFA и применение улучшенного метода для отслеживания инфекции цитомегаловируса человека (HCMV), а именно отслеживания экспрессии вирусных генов и определения местоположения вирусных антигенов. (белки).В свою очередь, должна быть возможность отслеживать инфекционный процесс в инфицированных HCMV клетках и иметь потенциал для патологической диагностики в клиниках. Разработанный нами метод f-IFA был модифицирован по сравнению со стандартным методом iIFA для клеток, выращенных и закрепленных на покровных стеклах [4,5], который оказался чувствительным и специфичным для обнаружения вирусной инфекции, но имеет недостаток — время — потребительно и дорого. В нашем методе клетки культивировали и заражали имитацией вируса, как описано ранее [6–8], и покровные стекла собирали в указанные моменты времени с последующей фиксацией и пермеабилизацией [7].Существенные различия в нашем протоколе f-IFA включают следующее: (i) В течение всего процесса f-IFA покровные стекла накладывались лицевой стороной вниз на инкубационный раствор по направлению к парапленочной мембране, что значительно увеличивало эффективность фетальной бычьей сыворотки (FBS ) блокирование и реакции Ab, так что время окрашивания и количество Ab резко сократились. (ii) Мы применили интенсивную и быструю промывку с усилием и быстро повторили погружение в промывочный буфер, что значительно повысило эффективность промывки.(iii) Все эти операции и реакции проводили при комнатной температуре (RT), за исключением хранения образцов и реагентов при 4 ° C и временного хранения реагентов на льду. (iv) Никакого дополнительного оборудования, такого как инкубатор 37 ° C и шейкер, не требуется. Наши результаты показали, что протокол f-IFA значительно быстрее и использует меньше Abs по сравнению с любыми другими методами IFA [2–5].

Материалы и методы

Антитела

Моноклональные антитела (mAb) против UL44 (IgG1) (1: 1000) и mAb против pp65 (IgG1) (1: 1500) были приобретены в Институте исследований рака Рамбо-Гудвина, Inc.(Сайксвилл, США). MAb против IE1 (IgG2a) (1: 1000) было любезно подарено Биллом Бриттом из Университета Алабамы (Бирмингем, США). MAb против GFAP (IgG2b) (1: 1000) было от NeoMarkers Inc. (Уолтем, США). Вторичные антитела, конъюгированные с TRITC, козьими антителами против мышиных IgG1 и IgG2a (1: 250) были получены от Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, США). Конъюгированные с Alexa 488 козьи антимышиные IgG1, IgG2a и IgG2b Abs (1: 5000) были получены от Molecular Probes (Юджин, США). Ядерный краситель Hoechst 33258 (1: 5000) был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США).Все Abs и Hoechst 33258 были свежевыведены непосредственно перед использованием в основном блокирующем растворе [BBS, 1% BSA и 0,01% Tween-20 в фосфатно-солевом буфере (PBS)].

Клетки и культура клеток

Использовали клетки с различной проницаемостью для инфекции HCMV. Эмбриональные фибробласты легких человека (HEL) и нейральные клетки-предшественники (NPC) являются первичными клетками и полностью допускают инфекцию HCMV; и T98G представляет собой линию клеток глиобластомы, которая является полупермиссивной для инфекции HCMV. Эти клетки культивировали на покровных стеклах, как описано ранее [7–10].Вкратце, поли-d-лизин без покрытия (для HEL) или с покрытием (для T98G и NPC) помещали в чашки, а затем клетки высевали на чашки. Клетки HEL и T98G культивировали в минимальной эссенциальной среде (Gibco / BRL, Гейтерсбург, США) с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 Ед / мл) и стрептомицина (100 мкг / мл), l-глутамина (2 мМ). NPC культивировали в наполовину измененной питательной среде (GM). GM представляет собой модифицированную Дульбекко среду Игла-F12, содержащую l-глутамин (2 мМ глутамакс; Gibco / BRL), антибиотики пенициллин / стрептомицин (100 Ед / мл и 100 мкг / мл), гентамицин (50 мкг / мл), амфотерицин B ( Фунгизон; Gibco / BRL; 1.5 мкг / мл), 10% BIT9500 (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада), основной фактор роста фибробластов человека (Invitrogen, Карлсбад, США; 20 нг / мл) и фактор роста эпителия человека (Invitrogen; 20 нг / мл) . Клетки поддерживали при 37 ° C в 100% увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ .

Вирусы и вирусная инфекция

Для заражения использовали штаммы вирусов HCMV, Towne (ATCC VR-977) и AD169 (ATCC VR-538). Клетки NPC и T98G инфицировали штаммом Towne при множественности инфицирования (MOI) 3 и 10 соответственно, а клетки HEL инфицировали штаммом AD169 при MOI 5.Клетки, выросшие на покровных стеклах, были инфицированы имитацией вируса или вирусом и собраны в указанное время после инфицирования (pi).

Faster IFA

Приготовление образцов покровных стекол

Покровные стекла собирали с чашек для культивирования острыми, стерилизованными пламенем пинцетом и помещали в 12-луночные планшеты, заполненные PBS. После промывки образцы фиксировали 1 мл буфера для фиксации [3% (об. / Об.) Формальдегида в PBS] в течение 10 мин при комнатной температуре. Впоследствии буфер для фиксации был откачан и покровные стекла дважды промыты PBS.Фиксированные покровные стекла можно хранить при 4 ° C в PBS. Для повышения проницаемости PBS из лунок удаляли и в каждую лунку добавляли 1 мл буфера для пермеабилизации (1% Triton X-100 в PBS), статически инкубировали в течение 5 минут, затем отсасывали буфер для повышения проницаемости и тщательно промывали покровные стекла PBS.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Перед окрашиванием на стол помещали кусок парапленочной мембраны желаемой длины. Чтобы парафильм не двигался во время окрашивания, парапленку плотно прикрепляли к столу с помощью тонкой пленки воды, образованной несколькими каплями воды.Область для каждого покровного стекла была отмечена маркером / маркером, и три пластиковых стакана были заполнены PBS (100 мл) [ Рис. (A) ]. Иммунофлуоресцентное окрашивание состояло из блокирования и последовательной инкубации с первичными и вторичными растворами антител; за каждым шагом следовала быстрая и обширная промывка [ Рис. (B) ]. (i) Блокирующий : 30 мкл блокирующего раствора (BS, 30% FBS в BBS) добавляли в каждую определенную область, промытое покровное стекло помещали (лицевой стороной вниз) над предварительно уложенным BS, позволяя одному краю касаться BS. а затем покровное стекло медленно отпускали, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха [ Рис.(B) ]; затем покровное стекло блокировали на 15 мин. Затем к краю покровного стекла добавляли достаточное количество PBS, чтобы разбавить BS и «плавать» покровное стекло [ Рис. (C) ]. Одно покровное стекло было взято и промыто последовательно в трех стаканах с PBS, многократно окунувшись в него. Избыток PBS сливали на бумажную салфетку. (ii) Инкубация с первичным Ab. : 25 мкл раствора первичного Ab помещали в соответствующую область и промытое покровное стекло помещали в раствор, как на стадии блокирования.Покровные стекла инкубировали в течение 10 минут, затем реакцию останавливали с помощью PBS и покровное стекло промывали, как на стадии блокирования. (iii) Инкубация со вторичным Abs : 25 мкл раствора вторичного Abs, содержащего ядерный контрастный краситель Hoechst 33258, помещали в соответствующую область. Промытое покровное стекло помещали в раствор. Инкубация, остановка реакции и промывка были идентичны инкубации с первичными Abs.

Демонстрация экспериментальных операций (A) Установите химические стаканы и парапленочную мембрану.(B) Быстрая и обширная промывка (вверх) и нанесение покровного стекла на растворы (BS, первичные и вторичные Abs) для инкубации (вниз). (C) Остановите реакцию и удерживайте покровное стекло, добавив PBS по краю покровного стекла кончиком 1000 мкл (вверху), и абсорбируйте избыточный буфер бумагой Kimwipe (внизу).

Установка покровных стекол

Предметные стекла были очищены и помечены, и на предметное стекло был добавлен раствор против выцветания (1 p -фенилендиамин в 90% глицерине); затем промытые и осушенные покровные стекла помещали (лицевой стороной вниз) поверх монтажного раствора против выцветания и осторожно нажимали пинцетом, чтобы выдавить лишний раствор.Избыток монтажного раствора против выцветания был удален путем осторожного вакуумирования. Покровные стекла закрывали лаком для ногтей и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Nikon, Токио, Япония).

Применение f-IFA для отслеживания прогрессирования инфекции HCMV в различных клетках

Ложные или инфицированные вирусом клетки на покровных стеклах собирали в указанное время pi и обрабатывали на протяжении всей фиксации, пермеабилизации и иммуноокрашивания. f-IFA применяли для отслеживания прогресса полностью пермиссивной инфекции HCMV в HEL, инфекции в T98G и изменений цитоскелета / цитопатических эффектов (CPE) у NPC.

Результаты

Выбор условий инкубации и промывки

Есть два варианта, которые в настоящее время используются для этапа инкубации с Abs: покровные стекла обращены вверх или вниз. Мы выбрали вариант лицевой стороной вниз, потому что он требует меньшего объема раствора Ab и потенциально обеспечивает более равномерное распределение по поверхности покровного стекла. Существует несколько способов постинкубационной промывки. Наиболее распространенный метод — поместить каждое покровное стекло в отдельную лунку 12-луночного планшета и залить лунку PBS, повернуть в течение 10 минут, повторяя 3 раза.Этот метод требует более длительного времени и большого количества промывочного буфера. Быстрая и обширная промывка путем последовательного погружения покровных стекол в три стакана с PBS потребовала всего 1 мин [ Рис. (A, B), ]. Результаты показали, что одинаково высокое качество изображений может быть получено обоими методами стирки (данные не показаны).

Оптимизация объема раствора и времени инкубации

Для оптимизации объема раствора были протестированы объемы от 15 до 50 мкл с шагом 5 мкл. Объема 15 мкл было недостаточно, чтобы покрыть все покровное стекло; 20 мкл было достаточно для инкубации, но было непросто добавить PBS, чтобы остановить инкубацию и создать плавающее покровное стекло; увеличение объема до 25 мкл позволило преодолеть этот недостаток [ рис.(C) ]; Объемы 30 мкл и более не увеличивали мощность сигнала и не снижали фон. Наконец, 25 мкл были выбраны как минимальный эффективный объем.

Для оптимизации времени инкубации (т.е. времени блокировки и инкубации Ab) были исследованы периоды времени 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 и 60 минут. Для этапа блокировки 5 или 10 мин было недостаточно, чтобы заблокировать неспецифическую реактивность; 15-минутная инкубация может повысить эффективность блокирования по сравнению с 10-минутной и полностью заблокировать неспецифическую реактивность; 20-минутная и более длительная блокировка имела такую ​​же эффективность блокировки, как и 15-минутная.Таким образом, 15 минут было выбрано как минимальное эффективное время блокировки. Периоды инкубации для первичных и вторичных Ab определяли аналогичным образом. Инкубация в течение 5 минут как для первичных, так и для вторичных Ab не дала достаточного специфического сигнала, 10-минутная инкубация увеличивала силу специфического сигнала; Инкубация в течение 15 минут и более давала аналогичные результаты по сравнению с инкубацией в течение 10 минут. Таким образом, 10-минутная инкубация была выбрана как минимальное эффективное время.

Чтобы оценить качество изображения от различных IFA, мы наблюдали HEL, инфицированный штаммом Towne, через 48 часов после инфицирования.Мы использовали те же разведения Ab. Все изображения были сделаны в одинаковых условиях после окрашивания без какой-либо корректировки. Время экспозиции составляло 30 мс для Hoechst, 30 мс для IE1, 40 мс для UL44 и 80 мс для фазовых изображений. Репрезентативные изображения, полученные с помощью f-IFA (инкубация Abs в течение 5, 10 мин) и традиционного IFA, представлены на рис. . Мнимо зараженные изображения показаны на рис. (A) . Было очевидно, что f-IFA с 10-минутной инкубацией Abs имеет достаточно сильный специфический сигнал и показывает отчетливое окрашивание для фокусов IE1 и UL44 [ Рис.(B) ]; в то время как специфический сигнал не был достаточно сильным при инкубации всего в течение 5 мин [ Рис. (C) ]; но инкубация в течение 15 минут лишь немного усиливает специфический сигнал, чем инкубация в течение 10 минут (данные не показаны). Специфический сигнал от традиционного IFA был немного сильнее, чем от f-IFA с 10-минутной инкубацией Abs, но для инкубации потребовался 1 час [ Рис. (D) ], и этот вид слабого сигнала можно было легко преодолеть путем экспонирования на более долгое время. Основываясь на этих результатах, мы определили, что время инкубации 10 мин для f-IFA было подходящим.

HEL-клетки были ложно инфицированы вирусом штаммом Towne при MOI 5 покровных стекол собирали через 48 часов после инфицирования. С помощью различных способов окрашивания образцы окрашивали антителами против IE1, против UL44 и соответствующими им вторичными антителами (TRITC-конъюгированный козий антимышиный IgG2a и конъюгированный с Alexa 488 козий антимышиный IgG1). Ядра контрастировали красителем Hoechst. (A) Мок-инфицированный HEL, окрашенный f-IFA. (B) Инкубируйте с первичным Ab и вторичным Ab в течение 10 минут, соответственно, что является нашим стандартным f-IFA.(C) Более короткое время инкубации с первичным Ab и вторичным Ab в течение 5 мин. (D) Следуйте традиционной IFA, описанной в [4] и [5]. Вкратце, в 12-луночном планшете блокирование 1 мл BS в течение 10 минут с последующим промыванием дважды PBS, инкубирование с 1 мл первичного раствора Ab в течение 1 часа с последующей промывкой PBS (5 минут три раза при встряхивании), затем инкубирование с 1 мл вторичного раствора Ab в течение 1 ч с последующей промывкой PBS (5 мин трижды при встряхивании). Шкала шкалы = 5 мкм.

Отслеживание проникновения вируса с помощью f-IFA

Фосфор-белок pp65 является наиболее распространенным белком в тегументном слое поступающего вириона HCMV с его собственным сигналом ядерной локализации.pp65 попадает в ядро ​​клетки вместе с геномом вируса. По этой причине pp65 часто используется как индикатор проникновения вируса на ранней стадии [11–14]. Чтобы исследовать процесс естественного проникновения, клетки HEL не были синхронизированы с G0 из-за сывороточного голодания и инфицированы штаммом AD169 с MOI 5. На фигуре показано, что в ложно инфицированных клетках HEL не было сигнала окрашивания pp65. Через 8 часов после начала исследования сигнал pp65 представлял собой более яркие пунктированные пятна в цитоплазме, в то время как он был более слабым и равномерно рассеянным в ядре; через 12 ч после импульса сигналы pp65 оставались пятнистыми в цитоплазме, а ядро ​​демонстрировало отчетливый сигнал окрашивания.

Отслеживание процесса проникновения частиц HCMV путем окрашивания pp65. Клетки HEL инфицированы HCMV (штамм AD169) с MOI 5, и покровные стекла собирают в указанные ранние моменты времени. Образцы окрашивали антителами против pp65. Образец с имитацией заражения показан на верхней панели, образец, инфицированный вирусом, через 8 часов после записи на средней панели и через 12 часов после записи на нижней панели. Ядра окрашены красителем Hoechst на всех изображениях. Шкала шкалы = 10 мкм.

Отслеживание процесса репликации вируса с помощью f-IFA

UL44 является фактором процессивности полимеразы HCMV (UL54) и выражается в E-фазе pi.Он локализуется в центрах репликации вируса в ядрах инфицированных клеток и является очень хорошим маркером для визуализации центра репликации вируса. Чтобы достичь синхронной инфекции, клетки HEL были лишены сыворотки, инфицированы HCMV (штамм AD169) при MOI 5 и окрашены на UL44 ( фиг. ). Фокусы UL44 проявились в виде множества маленьких фокусов (на 24 часа после пи), затем развились и слились, образуя более крупные и биполярные фокусы (на 48 часов после пи), в конце концов превратившись в один большой фокус внутри ядра (на 72 часа после пи), и более 90% очагов были одиночными крупными (на 96 ч пи).По мере того, как инфекция продолжалась, в цитоплазме на фазовых изображениях наблюдалось больше гранулярных частиц, особенно внутри и вокруг комплекса сборки вируса ( фиг. , фазовое изображение на нижней панели), что согласуется с развитием вирусного центра репликации. Образование и развитие очагов UL44 является индикатором формирования и развития вирусных центров репликации, а также индикатором для отслеживания прогресса вирусной инфекции. Увеличение количества гранулярных частиц в цитоплазме указывает на сборку вируса и его доставку из ядра в цитоплазму.Все эти результаты согласуются с наблюдениями за развитием вирусной инфекции, описанными ранее [12,15-17].

После образования и развития центров репликации HCMV путем окрашивания UL44 клетки HEL инфицировали HCMV (штамм AD169) с MOI 5. Показаны очаги UL44 на разных стадиях и в разные моменты времени. Фокусы развиваются из крошечных точек в биполярные фокусы, а затем в один большой фокус в ядре. Шкала шкалы = 5 мкм.

f-IFA чувствителен для выявления инфекции HCMV.

Клетки T98G полупермиссивны для инфекции HCMV, и инфекция в этих клетках является постоянной / латентной.Экспрессия вирусных генов очень низкая, и антиген-положительные клетки T98G продолжают делиться вместо того, чтобы задерживаться на G1 / S или G2 / M [8]. Общее количество клеток и количество антиген-положительных клеток получали из пяти полей на каждом покровном стекле (в центре, слева вверх / вниз, справа вверх / вниз) и подсчитывали для 300–500 клеток. Чтобы избежать систематической ошибки при подсчете клеток, мы сначала подсчитали ядра клеток (контрастное окрашивание по Hoechst), а затем подсчитали антиген-положительные клетки. Процент был рассчитан по следующей формуле:

Множественные микроядра, признак апоптоза клеток, появились в 0.5% HCMV-инфицированных и IE1-положительных клеток T98G на пассаже 3 (P3, день 12 pi). Типичное изображение показано на Рис. (A) . Среди инфицированных клеток T98G 2% имели четко выраженные расширенные фокусы UL44 на P3 [ Рис. (B) ]. Наличие очагов / центров репликации UL44 указывает на возможность производства и высвобождения инфекционного вируса. pp65 синтезируется de novo во время репликации вируса и включается в инфекционные вирионы. Зрелые вирионы перемещаются из ядра через цитоплазму через комплекс сборки вируса, наконец высвобождаясь на плазматической мембране [11–14].Таким образом, отслеживание трафика pp65-положительных вирионов может подтвердить высвобождение вируса. Около 0,5% клеток показали типичное выделение вируса, как визуализированное окрашивание pp65 с помощью f-IFA [ Рис. (C) ]. Все клетки T98G были инфицированы HCMV с использованием вируса, меченного BrdU, как описано ранее [8]. Взятые вместе, эти результаты показывают, что инфекция в клетках T98G отличается от инфицирования в полностью пермиссивных клетках (например, HEL), и только очень небольшая часть инфицированных клеток имела репликацию вируса, которая не наблюдалась в предыдущих исследованиях из-за ограничений в эффективность обнаружения [18].

Окрашивание IE1, UL44 и pp65 в клетках T98G, инфицированных HCMV (штамм Towne). (A) IE1-положительные мульти-микроядра в клетках T98G, инфицированных HCMV, масштабная линейка = 20 мкм. (B) Четкие очаги UL44. (C) Выделение вируса визуализируется окрашиванием pp65. pp65-положительные частицы, собранные в комплексе сборки вируса, который виден как большой агрегат в цитоплазме, прилегающей к ядру (обозначен сплошной белой стрелкой). Масштабная линейка (B) и (C) составляет 5 мкм.

Коллапс цитоскелета у HCMV-инфицированных NPC, захваченных f-IFA

NPC являются наиболее восприимчивыми клетками в головном мозге in vivo и полностью пермиссивными для CMV-инфекции in vitro [6,10,19–21].ЦМВ-инфекция вызывает потерю нервных клеток, что является прямой причиной нарушений развития мозга (например, микроэнцефалии) [21,22]. Однако очень сложно оценить потерю нервных клеток, вызванную инфекцией HCMV, при вскрытии ткани мозга для патологической диагностики. Кислотный белок глиальных филаментов (GFAP), белок цитоскелета, который также является маркером NPC, подавляется как на уровне мРНК, так и на уровне белка [10,23]. Здесь мы использовали f-IFA, чтобы показать изменения GFAP pi ( рис. ). Через 4 ч после начала фазы, когда он находится на очень ранней стадии фазы IE, GFAP был представлен в виде размытых пятен в IE1-положительных клетках, а структура филаментов была не такой четкой, как в IE1-отрицательных клетках [ Рис.(А) ]. По мере прогрессирования инфекции степень разрушения нити GFAP ухудшалась. GFAP выглядел как более крупные агрегированные пятна, а структура филаментов была полностью разрушена до 72 часов после начала исследования [ Рис. (B) ]. Поскольку GFAP является маркером и белком цитоскелета NPC, а изменение GFAP — это CPE, индуцированное инфекцией HCMV, а IE1 является маркером инициации репликации HCMV, коллапс GFAP в IE1-положительных клетках может поэтому использоваться в качестве критерия повреждения нервной системы. инфекцией HCMV.IE1-отрицательные клетки HCMV с отчетливой структурой филаментов GFAP наблюдались в момент, когда клетка находилась в процессе деления, а две дочерние клетки еще не полностью разделились [ Рис. (A) ]. Эти особенности могут помочь в диагностике инфекции HCMV в ткани мозга. Кроме того, клетка делилась асимметрично с большим и меньшим ядром, что указывает на то, что одна дочерняя клетка будет поддерживать статус клеток-предшественников / стволовых клеток, а другая будет участвовать в программе дифференцировки, и дифференцировка может быть вызвана инфекцией HCMV.

HCMV разрушенная структура GFAP в NPC. NPC были инфицированы HCMV (штамм Towne), была определена структура GFAP и экспрессия IE1 HCMV. (A) Через 4 часа после инфицирования в IE1-положительных клетках GFAP является пятнистым, а структура филаментов неясна по сравнению с IE1-отрицательными клетками. (B) Через 72 часа после начала исследования структура волокна GFAP полностью разрушается; общий сигнал резко уменьшается; и большая часть оставшегося сигнала агрегируется. Шкала шкалы = 5 мкм.

Обсуждение

Высококачественные изображения HCMV-инфекции с помощью f-IFA были получены из различных HCMV-инфицированных клеток ( рис.- ), включая полностью разрешающие (HEL, NPC) и полупермиссивные (T98G) ячейки. Основываясь на результатах, представленных здесь и опубликованных ранее [6–8,10,12], f-IFA, по крайней мере, сопоставим с результатами, полученными при помощи IFA [2–5,16,17,24].

Основным преимуществом f-IFA является скорость анализа без потери точности. f-IFA экономит часы [6–8,10,12] по сравнению с другими IFA [2–5,16,17,24]. Экономия времени в первую очередь достигается за счет сокращения времени блокировки (15 минут в f-IFA по сравнению с часами в других IFA) [5,25,26] и этапов первичной и вторичной инкубации антител (вместо 10 минут для каждой инкубации при комнатной температуре). из 0.5–3 ч при 4 ° C в других IFA) [4,5,25,26]. Кроме того, экономия времени достигается за счет эффективных этапов промывки, которые намного быстрее и эффективнее, чем любой другой протокол [2–5,16,17,24].

Второе преимущество заключается в том, что для f-IFA требуется гораздо меньше Abs и, следовательно, он более рентабелен, поскольку для этапов инкубации требуется только 25 мкл разбавленного раствора Abs для каждого покровного стекла, помещая покровные стекла на раствор лицевой стороной вниз. Коэффициенты разведения первичных АТ составляют 1: 1000, а вторичных АТ могут составлять 1: 5000, что очень рентабельно для клинического применения.Все эти экономящие время и рентабельные условия принесут пользу клиническому применению, а высококачественные изображения можно постоянно получать с помощью f-IFA ( Рис. — ).

Еще одно преимущество f-IFA — удобство. Весь процесс выполняется при комнатной температуре, что исключает необходимость в шейкере, камере влажности, инкубаторе 37 ° C или холодильной камере 4 ° C. Наша предыдущая работа показала, что высококачественное флуоресцентное изображение было получено с помощью f-IFA [6–8,10,12], и они сопоставимы с другими опубликованными результатами [2–5,16,17,24].Благодаря преимуществам экономии времени, рентабельности и удобства этот протокол может заменить другие протоколы IFA.

Проникновение вируса и начало репликации вируса являются ключевыми этапами заражения HCMV. Жизненный цикл HCMV включает следующие этапы: вирионы входят в клетки, белки тегумента (например, pp65) и вирусный геном перемещается в ядро; они создают центры репликации вирусов и реплицируются в ядрах; наконец, вирионы потомства собираются в вирусный сборочный комплекс и затем высвобождаются на цитоплазматической мембране посредством отпочкования.Первым событием заражения является проникновение вируса в ядро. pp65 является структурным компонентом вириона, который перемещается и входит в ядро ​​во время проникновения вируса. Таким образом, процесс проникновения вируса можно отслеживать с помощью окрашивания pp65 с помощью f-IFA ( фиг. ). Кроме того, вирус создает центры репликации вируса в ядре, и эти центры можно отслеживать и визуализировать с помощью окрашивания UL44 с помощью f-IFA [ Фиг. и (B) ]. Формирование вирусного центра репликации в ядре указывает на возможность образования потомков инфекционного вируса.Созревание и выход вируса также можно отслеживать с помощью окрашивания pp65 с помощью f-IFA [ Рис. (C) ]. Таким образом, с помощью f-IFA можно четко и конкретно определить процесс заражения и детали проникновения и репликации вируса.

Ранняя и быстрая диагностика — ключевой компонент эффективной терапии инфекционных заболеваний. ИФА — широко используемая научная и диагностическая технология с подтвержденной чувствительностью и специфичностью. При инфекции HCMV, как только двойной линейный вирусный геном входит в ядро, продукты немедленного раннего гена, наиболее часто используемый вирусный специфический маркер для выделения и идентификации вируса, представлены в ядре.IE1 является первым и наиболее распространенным среди продуктов гена IE и явно появляется в ядрах NPC через 4 часа после начала исследования [ Рис. (A) ]. Группа доктора Бритта и другие использовали образцы слюны и мочи новорожденных для диагностики врожденной инфекции HCMV [27]. Образцы высевали на монослой фибробластов и культивировали в течение 16-24 ч с последующим определением IE1 с помощью IFA. Этот метод используется как технология ранней и быстрой диагностики, а также как золотой стандарт диагностики вирусных инфекций в клинике [27].Используя f-IFA, диагноз можно поставить быстрее и раньше, поскольку сигнал IE1 отчетливо отображается через 4 часа пи [ Рис. (A) ]. За исключением потенциального применения f-IFA для ранней и быстрой диагностики вирусной инфекции, это также более чувствительный и специфический метод. Редкие события, такие как множественные микроядра [ Рис. (A), ] и выделение вируса [ Рис. (C), ] в инфицированных HCMV клетках T98G, а также асимметричное деление клеток [ Рис. (A) ] специально захвачены f-IFA.

Таким образом, этот f-IFA представляет собой более быструю, экономичную и удобную технологию с более высокой чувствительностью и специфичностью. Мы отслеживали детали процесса заражения HCMV (проникновение и репликация вируса) с помощью f-IFA, события с низкой заболеваемостью также фиксируются во время инфекции. Все эти результаты предполагают, что f-IFA подходит для ранней, быстрой и точной диагностики вирусной инфекции, особенно инфекции HCMV.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальной программой фундаментальных исследований «973» (2011CB504804), фондом «бай жэнь цзи хуа» (29Y002161YC1) Китайской академии наук, Национальным фондом естественных наук Китая (81071350; , 31170155;, 31000090), и грант от Университета Айдахо (YDP-764) М.L. Эта работа также была поддержана грантами NIH (# RO1- AI51463; и # P20 RR015587COBRE program) для EF

Благодарности

Мы благодарны профессору Чжан Инь (Институт гидробиологии Китайской академии наук) за любезно предоставление флуоресцентного микроскопа.

Ссылки

Результаты анализов по скорости расшифровки хламидиоза. Анализы крови на антитела к хламидиям и их расшифровка. Когда результаты становятся отрицательными после лечения хламидиоза

34 541

Как известно, у каждой болезни есть свои присущие ей признаки.Но к хламидиозу это не имеет никакого отношения.
Хламидиоз — это заболевание, не имеющее четких симптомов, присущих только ей, а иногда протекает бессимптомно. И даже если некоторые проявляются, чаще всего они похожи на признаки других ЗППП.
Следовательно, решающее значение для постановки диагноза имеют лабораторные методы исследования. В отличие от многих других заболеваний, диагностика хламидиоза является чисто лабораторной.

Кого в первую очередь следует обследовать на хламидиоз?

• Мужчины и женщины, имеющие много половых партнеров, особенно случайных.
• Лица, половые партнеры которых обнаружили хламидиоз даже при отсутствии жалоб и симптомов. Ведь осложнения хламидиоза могут развиться даже при бессимптомном его течении. Риск заражения партнера составляет около 90%.
• Женщины, страдающие бесплодием более 2 лет, даже если половой партнер обследован и здоров.
• Женщины с эрозиями матки, цервицитами, воспалениями яичников (особенно при планировании беременности). Причем мазок из влагалища может быть нормальным.
• Женщины с нарушением течения беременности: самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, многовариантность, повышение температуры неясного происхождения при настоящей беременности.

Что вы исследуете?
Чтобы обнаружить хламидиоз, необходимо изготовить забор из материала. Это может быть соскоб, содержащий клетки органа пациента — влагалища, шейки матки, секрета простаты, соскоб уретры, конъюнктивы глаза. Таким материалом также может быть кровь, моча и сперма у мужчин.

Какие анализы назначают при хламидиозе и насколько они могут быть полезны?
Сначала остановимся на возможных методах обследования, а затем сделаем вывод, что они наиболее предпочтительны.

2 . Иммуноцитологический анализ — это прямая реакция иммунофлуоресценции (риф или лицо).
Этот метод обеспечивает прямое определение антигенов хламидия. Для этого материал, полученный при соскобе, обрабатывают специальными антителами, которые непосредственно обрабатывают флуоресцентным веществом.Эти антитела связаны со специфическими антигенами хламидии. Затем с помощью люминесцентной микроскопии хламидийные включения в клетках определяются по зеленому или желто-зеленому свечению.
Иммуноцитологический метод применяется как в острой, так и в хронической фазе заболевания.
Существенным недостатком рифа является большое количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Ложноотрицательные результаты чаще всего связаны с нарушением правил забора биологического материала. Ложноположительные результаты могут быть следствием сочетанных инфекций урогенитального тракта, когда вместе с хламидиозом присутствует другая микробная флора.Помимо прочего, риф очень субъективен, т.к. зависит от опыта и личной оценки лаборанта. Поэтому риф дает очень высокий процент ложноположительных результатов и не может считаться надежным. Минусом рифа является еще и то, что невозможно оценить результаты лечения.
При урогенитальном хламидиозе точность метода около 50%.

3 . Иммуноферментный анализ (ИФА).
IFA — метод косвенной идентификации бактерий, т.е.е. Возбудитель не определяется напрямую, но к нему определяются специфические антитела (IgG, IgA, IgM). Метод основан на способности иммунной системы вырабатывать антитела (иммуноглобулины, Ig) в ответ на введение чужеродных агентов.
Преимущества ELFA в том, что он позволяет не только идентифицировать возбудителя заболевания, но и определять, на какой стадии он находится (острая или хроническая), и оценивать эффективность лечения. Плюсом является также автоматизация метода и скорость его проведения.

Как оцениваются результаты?
При заражении хламидиозом специфические антитела появляются на 5-20 день заболевания. В этом случае появление каждого класса антител происходит на определенной стадии заболевания.

• При первичном заражении сначала появляются Igm, затем IGA, а в последний раз — IgG.
• Первые после первичного заражения (через 5 дней) появляются Igm, защищающие организм от возможного распространения инфекции. Они являются маркерами острой стадии болезни.К 10-му дню количество IGM в крови достигает пика. Затем их уровень начинает снижаться, и появляется IGA. В течение короткого периода времени он может быть обнаружен параллельно с антителами IgM и IGA. Этот период свидетельствует об инфекционном процессе.
• Ига можно найти через 10 дней с момента появления первых симптомов заболевания. Они защищают слизистые оболочки от проникновения бактерий глубоко в ткани. Высокий уровень ИГА в отделяемом со слизистых оболочек говорит о хорошо функционирующем местном иммуните.
• Затем, через 15-20 дней после введения в организм хламидии трахоматис в крови появляется IgG, и уровень IGA снижается.
• Острый первичный процесс характеризуется высоким уровнем (титром) IGM в сочетании с низким титром IGG.
• При повторном заражении отмечается быстрое увеличение титра IGG и IGA и практически полное отсутствие Igm.
• При хроническом течении выявляются специфические IgG и А, концентрации которых длительное время не меняются.
• При излечении через 1,5-2 месяца IgA и IgM в крови не обнаруживаются, а IgG могут сохраняться несколько лет, но их уровень снижается в 4-6 раз.
• Длинно определяемые IgG указывают на перенесенную хламидийную инфекцию.
• При обострении хламидиоза количество IGA и IgG увеличивается в несколько раз.
• Эффективность лечения определяется наличием ИГА. Если через 2 месяца после курса лечения в крови обнаруживается Ига — значит, инфекция осталась.

Следует отметить, что специфические антитела, продуцируемые к хламидиям, не обеспечивают стойкого иммунитета против них.
Точность этого анализа на хламидии составляет около 70%. Это связано с тем, что антитела к хламидиям могут присутствовать и у здоровых людей в результате перенесенного ранее заболевания, а также должны определяться при респираторных и других типах хламидийных инфекций.

4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
С помощью ПЦР выявляется конкретный участок или фрагмент ДНК хламидиоза в исследуемом материале, поэтому по сравнению с другими методами невозможно спутать хламидиоз с какой-либо другой инфекцией.Он эффективен как в острой, так и в хронической фазе заболевания. При этом для анализа нужно совсем немного материала, результаты готовы через 1-2 дня.
Для ПЦР-исследования материалом могут быть соскоб из уретры или цервикального канала, секрет предстательной железы, осадок мочи, соскоб с конъюнктивы глаза, кровь.
При диагностике первичной инфекции более информативным является выявление этой инфекции в областях начальной локализации, т. Е.Материал должен быть из половых путей. Ложноположительные результаты ПЦР могут быть в случае нарушения процесса забора, транспортировки материала и проведения самого анализа.

Важно! Для оценки эффективности лечения ПЦР исследование нельзя проводить раньше, чем через месяц после курса антибактериальной терапии, т.к. можно получить ложноположительные результаты. Это связано с тем, что при обнаружении фрагмента ДНК хламидиоза невозможно оценить, насколько жизнеспособна сама микробная клетка.В этом случае жизнеспособность хламидиоза, а также возможность рецидива заболевания оценивается микробиологическим методом. Если хламид не фокусируется, то, несмотря на присутствие фрагмента ДНК, микробные клетки не будут расти в культуре клеток.
На сегодняшний день точность этого метода самая высокая — до 100%.
Этот метод рекомендуется как предпочтительный при диагностике хламидийной инфекции.

5. Микробиологическое исследование (посевным методом) с определением чувствительности к антибиотикам.
Суть метода в том, что исследуемый материал зашивается в специальной среде и выращивается. Затем возбудитель идентифицируется по природе и другим признакам. Метод культивирования наиболее чувствителен, он позволяет не только выявить жизнеспособные хламидии, но и выбрать антибиотик, чувствительный к этому микроорганизму.
Материалом для исследования может служить соскоб уретры, шейки матки, секрета простаты, соскоб с конъюнктивы глаза.
За месяц до исследования антибиотики применять нельзя.
Микробиологическое исследование предпочтительно проводить в следующих случаях:

• Для оценки эффективности антибактериального лечения.
• Для выявления чувствительности к антибактериальным препаратам.
• Для выявления хламидиоза у лиц с иммунодефицитом (ВИЧ-инфицированные, онкологические пациенты после лучевой и химиотерапии, лица, получающие иммунодепрессанты и т. Д.).

Недостатками культурального метода диагностики хламидиоза являются трудоемкость, дороговизна и длительность исследования.Также необходимо оборудование лаборатории и очень высокая квалификация персонала. К тому же этот способ, как никакой другой, требует безупречного соблюдения правил в ограждении материала, транспортировке и хранении.
Реальный срок получения результатов данным методом не менее семи дней.
Выявляемость хламидий при посевах до 90%.

6. Экспресс-диагностика.
Все методы экспресс-диагностики хламидиоза основаны на ферментоспецифической реакции и иммунохроматографии.При этом используются специальные наборы для быстрой диагностики, которые позволяют визуально оценить результаты уже через 10-15 минут. Это очень быстрый и удобный метод, но его точность составляет всего 20-25%.

Выводы.

• Не существует метода, который бы в 100% случаев выявлял хламидиоз. Поэтому в большинстве случаев лабораторная диагностика должна включать сочетание как минимум двух методов.
• Самые чувствительные тесты на хламидиоз — ПЦР (ДНК-диагностика) и микробиологический анализ.Они являются «юридическим стандартом» в диагностике хламидиоза.
• В случае первичного инфицирования перед применением антибиотиков чаще всего проводится одно ПЦР-исследование.
• При хронических процессах — ПЦР или микробиологический тест, или риф + ИФА.
• С вероятностями перехода возбудителя в L-форму — ИФА.
• Для оценки эффективности лечения используется микробиологическое исследование. Если невозможно — ПЦР + ИФА.
• Для определения стадии заболевания — ИФА.
• У пациентов с иммунодефицитами ИФА неинформативен, в идеале использовать микробиологический метод.
• Не стоит особо полагаться на результаты определения чувствительности хламидиоза к антибиотикам. Ведь, как известно, микроорганизмы по-разному ведут себя в пробирке (in vitro) и в живом организме (in vivo).

Инструкция

С момента заражения до появления первых симптомов может пройти больше месяца. Алкоголь может ускорить их проявление.Есть несколько способов выявить болезнь.

Анализ на хламидиоз можно провести в аптеке. Купите в аптеке специальный тест, который дает достоверный на 20% результат. То есть велика вероятность, что он не покажет надежного результата.

При подозрении на наличие заболевания обратитесь к врачу. Гинеколог даст направление на сдачу анализов в лаборатории и предложит гинекологическое обследование. Стерильными инструментами берут мазок из влагалища женщины, уретры и шейки матки.

Аналогичный анализ сдает уретрауролог. Однако это лишь вспомогательный метод обнаружения. С его помощью можно выявить болезнь с достоверностью 15%. Анализ платный. Следует взять с собой одноразовые подгузники и сменные бахилы или бахилы. Процедура болезненная, возможно, у женщин, кровянистых выделений из влагалища какое-то время не будет. Также он актуален для тех, у кого эрозия шейки матки, во время процедуры она болит, а шея начинает кровоточить.

Иммунофлуоресцентная реакция (риф) поможет идентифицировать болезнь на 70%.Провести его должен профессиональный врач и лаборант. Метод требует высокой точности. С помощью специального состава из уретры берется материал и под микроскопом наблюдается наличие бактерий. В случае положительного результата они начинают светиться.

Иммунохимический анализ, или ИФА — определение антител (IgG, IgA, IgM) к хламидиям в крови. С момента возникновения заболевания в организме человека вырабатываются антитела. Их выявляют специальными препаратами, содержащими хламидийные антигены.Для этого метода нужно отвести кровь из вены. Обычно антитела проявляются через 20 дней после заражения. Кровь следует сдавать натощак в лабораторных условиях. Результат позволяет сделать вывод о том, какая стадия — хроническая или острая. Точность этого анализа не более 60%.

Возможно, врач предложит сдать посев на хламидиоз. (Культурный метод). Это трудоемкий метод, требующий длительного времени, специального оборудования лабораторий. Положительной стороной анализа является то, что с его помощью можно не только узнать, есть болезнь или нет, но и определить, каким антибиотиком ее можно вылечить.Результат придется ждать несколько дней.

Профессиональные анализы на хламидиоз проводятся в медицинских учреждениях, для чего женщинам и мужчинам необходимо посетить профильного специалиста (венеролога, уролога или гинеколога). Врач может выбрать мазки для исследования со стороны шейки матки либо слизистой оболочки влагалища, а также взять кровь на анализ.

Особенности патологии и виды исследований

Развитие патологии начинается с того момента, когда в организме женщины хламидиоз увеличивается до определенного количества.Репродуктивная система подвергается главной опасности — при заражении хламидиозом может развиться бесплодие и ряд не менее серьезных проблем. При заражении хламидиозом образование спаек, выкидыши и преждевременные роды у женщин в положении возможны онкологические проблемы в матке.

У мужчин хламидиоз провоцирует образование простатита и импотенции, возможно появление хламидийной пневмонии.

Современные анализы

При попадании хламидиоза в организм определить заболевание на ранней стадии развития очень сложно.Даже большое количество хламидиоза не является гарантией выраженных симптомов. Возбудители способны длительное время жить внутри клеток, не проявляя себя.

Существует несколько современных методик, у каждого исследования есть свои положительные и отрицательные стороны. Выделяют следующие тесты:

• Экспресс-тестирование, что хорошо тем, что позволяет проводить независимые исследования в домашних условиях.
• Микроскопический анализ на хламидии, когда выбранные биоматериалы исследуются многократно.
• Бактериологический посев, когда кровь или мазок помещают в специально подготовленную среду.
• Реакция иммунной флюоресценции риф — это анализ на хламидии, во время которого наблюдается свечение патогенных возбудителей под микроскопом.
• Иммуноферментное исследование при хламидиях также называется ИФА. Сосредоточившись на количестве антител IGM, IGA и IgG, иммуноферментный анализ определяет стадию развития и тяжесть заболевания.
• Полимеразная цепная реакция, это ПЦР на хламидии, позволяет идентифицировать ДНК возбудителя болезни и является наиболее надежным методом диагностики.

Довольно часто для определения патологии используют несколько методик. Комбинированный подход позволяет добиться большей достоверности диагностики.

IFA

Анализ ИФА на наличие хламидий позволяет определить, есть ли в организме антитела возбудителей в организме. Их наличие в анализе даже при отсутствии патологических микроорганизмов говорит о том, что мужчина в свое время молчал от хламидиоза.

IFA Анализ может быть качественным или количественным.Проведение первого варианта определяет наличие либо отсутствия желаемого вещества и дает однозначный результат. При расшифровке по второму способу цепочка проводимых реакций более сложная и позволяет определить концентрацию имеющихся в крови антител, свидетельствующих о развитии инфекционного процесса.

К преимуществам метода можно отнести:

• Высокая чувствительность к хламидиям даже при низкой концентрации определяемого вещества.
• Специфичность, обеспечивающая точность результата — при положительном значении можно сделать вывод, что это именно предполагаемые микроорганизмы.
• Благодаря высокому уровню технологического анализа на хламидии методом ИФА влияние человеческого фактора сводится к минимуму, соответственно увеличивается процент верных результатов, а вероятность ошибки снижается.

Один отрицательный момент — это стоимость исследования, не относящаяся к дешевым, соответственно прием, исследование и его расшифровку нужно доверить опытным врачам.

Читайте также по теме

Что такое хламидиоз, особенности заражения

Расшифровка ИФА

Давайте посмотрим, как результаты анализов ИФА отображаются в представленной таблице:

Как видите, нормой являются отрицательные показания IgG и IgM к хламидиоз. По второй строчке показатели тоже можно отнести к норме — в любом случае лечение на данном этапе развития болезни не требуется. Последние два варианта указывают на патологию в организме.

Можно составить еще одну таблицу, в которой будут сокращены возможные количественные выражения. При анализе на хламидиоз расшифровка может продемонстрировать следующие результаты:

Если говорить о том, где можно исследовать кровь на хламидиоз с помощью ИФА, вот список доступных организаций:

• Диагностические лаборатории.
• Частные клиники, специализирующиеся на диагностике инфекций, переходящих от носителя к поврежденному половому пути.
• Кожно-венерологические диспансеры.

Доказанный факт. Если сравнивать, какое из исследований является наиболее надежным, то обработка полимеразной цепной реакцией демонстрирует чувствительность на уровне 99%.

Проведение ПЦР-исследования

Как показывает практика, общий анализ мочи и крови не дает полной картины. В исследованиях можно отметить только наличие воспаления или наличие патологических микроорганизмов без уточнения их природы. При проведении полимеразной цепной реакции биоматериал выбирается из очага, в случае хламидиоза это:

• область влагалища;
• уретра и шейка матки;
• эякулят и секрет простаты;
• сдан анализ крови и мочи.

Исследования можно отличить по участкам РНК или ДНК хламидий, вступивших в полимеразную реакцию, которая способствует их развитию и быстрому росту. После этого поставить диагноз не составит труда. Общая картина демонстрирует полную безопасность рассматриваемого метода и отсутствие специальной предварительной подготовки. Со стороны врачей прикладывать особые усилия тоже не нужно, хотя у пациентов повышенный интерес — сколько проводится таких исследований.Обычно требуемые временные результаты могут быть получены через несколько дней после анализа.

Хламидиоз — распространенное инфекционное заболевание, передающееся половым путем. Этим недугом, как правило, болеют молодые люди, ведущие активную половую жизнь. Без лечения это заболевание может привести к серьезным и опасным осложнениям, включая бесплодие.

Бактерия Chlamydia trachomatis считается возбудителем хламидиоза, который обнаруживается как в выделениях из влагалища женщин, так и в сперме мужчин, являющихся носителями этого недуга.Это заболевание от человека к человеку при сексуальных контактах передается очень легко. Кроме того, хламидиоз может перейти от беременной к ее малышу. Заболевание не передается при объятиях, поцелуях, через общую посуду, при использовании обычных полотенец или ванной.

Первые симптомы хламидиоза проявляются, как правило, через одну-три недели после заражения бактериями. У многих пациентов симптомы отсутствуют. Основными признаками хламидиоза у женщин являются: кровотечение или боль в момент полового акта, вагинальное кровотечение после полового акта, боль при мочеиспускании, боль внизу живота, обильная менструация, вагинальные кровотечения и выделения между менструациями.Хламидиоз у мужчин проявляется болью в яичках и водянистыми или мутными выделениями из головки полового члена.

Показания к анализу

Сдать анализы на хламидиоз необходимо в следующих ситуациях:

• Если вы выявили другое инфекционное заболевание, передающееся половым путем.
• Если ваш постоянный половой партнер имел половую связь с другими людьми.
• Если у вашего партнера есть или у вас есть симптомы хламидиоза.
• Если при гинекологическом осмотре обнаружены аномальные выделения или воспаление слизистой оболочки шейки матки.
• Если у вашего партнера инфекционное заболевание, передающееся половым путем.
• Если у вас был половой контакт без презерватива с новым партнером.

Где сдать анализ

Сдать анализы на хламидиоз можно в таких медицинских учреждениях как:

• Женская консультация.
• Частная клиника по лечению инфекций, передаваемых половым путем.
• Клиника планирования семьи.
• Кожно-венерологический диспансер.

Кроме того, в настоящее время существуют анализы на хламидиоз, которые можно проводить в домашних условиях.Но, перед покупкой такого теста в любом случае желательно проконсультироваться со специалистом.

Виды анализов

Диагностика хламидиоза проводится по нескольким направлениям, так как возбудитель этого заболевания имеет уникальный биологический цикл.

Основными анализами на хламидиоз считается:

• Микроскопический анализ (общий мазок).
• Анализ крови на хламидиоз (ИФА — иммуноферментный анализ).
• Риф (реакция иммунофлуоресценции).
• ПЦР (анализ на хламидии методом полимеразной цепной реакции).
• Посев на хламидии (посевной способ).
• Экспресс-тесты.

В настоящее время многие люди с подозрением на хламидиоз прибегают к мини-тестам, которые можно купить практически в любой аптеке. Главный недостаток экспресс-тестов — точность 20%.

Общий мазок (микроскопический анализ) У женщин берут одновременно из наружного отверстия уретры, шейки матки и влагалища, а у мужчин — из уретры.Вероятность выявления таким способом хламида также очень мала — 15-20%. Микроскопический анализ выявляет только воспалительный процесс.

Reef (реакции иммунофлуоресценции) — более точный метод. Материал, взятый из уретры, лаборанты окрашивают специальным веществом, после чего тщательно исследуют под специальным микроскопом. С хламидиозом в линзе микроскопа можно увидеть светящийся хламидиоз. Точность этого метода 60-70%.

ПЦР (анализ с использованием нескольких молекул ДНК) на сегодняшний день является наиболее чувствительным среди всех анализов на хламидиоз. Чувствительность этого метода чрезвычайно высока — 99%.

Культуральный метод Диагностика — это чувствительный и высокоспецифичный способ обнаружения хламидиоза. Посев в среду, MS-SUM — один из самых дорогих анализов, который ограничен продолжительностью варки, оснащением лабораторий и высокой трудоемкостью. Точность этого метода диагностики составляет 70-90%.

Анализ крови на хламидии (иммуноферментный анализ , ) Позволяет выявить в крови антитела (IGM, IGA и IGG) к возбудителю хламидиоза. Данные антитела Организм вырабатывает в ответ на заражение бактериями. Антитела к хламидиозу. Медицинские работники выявляют их путем взаимодействия со специальными препаратами, содержащими хламидийные агенты. Этот метод не только определяет возбудителя вышеуказанного заболевания, но и сообщает врачам, на какой стадии находится болезнь — хронической или острой.

IFA Хламидии — это спектрофотометрический метод диагностики этого заболевания. Главное преимущество этого анализа в том, что он недорогой и простой. Точность ИФА, как правило, не превышает 60%.

В настоящее время хламидиоз является проблемой не только медицинской сферы, но и социальной, прежде всего активно влияющей на способность женщины забеременеть и родить ребенка.

В клетках они сохраняются до наступления благоприятных условий, позже вызывая хронический воспалительный процесс.Самостоятельное лечение хламидиоза вызывает хроническое течение болезни. Хламидийная инфекция может сочетаться с другими инфекциями. Современный анализ на хламидиоз у женщин основан на лабораторных исследованиях.

Сюда входят:

• экспресс-тесты;
• микроскопия;
• иммуноферментный анализ;
• анализ на реакцию иммунной флуоресценции;
• анализ связывания комплемента;
• посев бактериологический.

В целях максимальной эффективности диагностики методы комбинируются в зависимости от наиболее подходящих для анамнеза конкретного пациента.Часто используют несколько методов диагностики. Развитие современной медицины позволяет сегодня проверить свой организм на хламидиоз.

Вы можете самостоятельно сделать экспресс-тест, который можно купить в аптеке. Он основан на методе иммунной хроматографии. При наличии инфекции две тест-полоски окрашиваются в контрастный цвет. Экспресс-тест необходимо проводить не ранее, чем через две недели после незащищенного полового контакта. На ранних стадиях хламидиоз может не проявить себя.На сто процентов доверять результатам мини теста нельзя.

При появлении малейших намеков на инфекцию женщине необходимо срочно посетить гинеколога и сдать анализы. Метод микроскопии основан на заборе мазка со слизистой влагалища, шейки матки и его исследовании. Анализ иммунизации распознает не саму инфекцию, а наличие к ней антител. Анализ на хламидиоз у женщин показывает стадию заражения. Метод ПЦР очень чувствителен — до 99%, но достаточно финансово и трудоустроен.

Результаты готовы не ранее, чем через сутки. Заболевание хламидиозом является не только медицинской, но и социальной проблемой, влияющей на репродуктивную функцию. Диагностировать инфекцию сложно из-за ее вялого характера. Инфекция может долго не проявляться и обнаруживаться случайным образом при плановом медицинском осмотре и лабораторном исследовании.

примечание

Хламидиоз может поражать целые системы органов. Инфекция негативно сказывается на способности ребенка носить, часто развивается вторичное заболевание.

Метод культивирования заключается в внесении биологического материала в чашки с питательной средой и выращивании на них колоний хламидий. Этот вид обследования позволяет определить количественный состав колоний образующих единиц и проверить их чувствительность к антимикробным препаратам. А это, в свою очередь, позволяет правильно назначить медикаментозное лечение.

Во время беременности хламидийная инфекция становится первопричиной инфицирования плода и, как следствие, его возможной потери.Диагностика хламидийной инфекции в наше время стала намного доступнее благодаря множеству передовых методов микробиологических и иммунологических типов тестов. Материалом для исследования беременной являются выделения из уретры, влагалища и шейки матки. Забор материала осуществляется стерильной ватной палочкой.

Кровь забора тоже взята. Для исследования крови его берут утром натощак из вен. В период инструментария плода, в зависимости от срока беременности, диагностика возможна рядом с водами плода.Все анализы заборов для анализа производит гинеколог при осмотре. Обнаружение инфекции хламидиоза у женщины, вынашивающей плод, дает показания к обследованию и лечению всех половых партнеров пациента.

Стоит отметить

Анализ на хламидиоз у беременной крайне важен в связи с возможностью серьезных нарушений развития плода.

Какие анализы на хламидиоз у женщин

Причин сдать анализы на хламидиоз у женщин может быть много:

• странное отделение от половых органов;
• чувство дискомфорта, болезненности в органах малого таза;
• признание заражения половым партнером;
• случайный незащищенный половой контакт;
• планирование беременности;
• бесплодие;
• аборт естественный непонятный;
• профилактика.

При появлении любого из перечисленных симптомов необходимо немедленно обратиться к врачу и сдать анализы на хламидиоз у женщин. Запущенная форма болезни может негативно сказаться на судьбе женщины, лишить ее материнской радости.

Обязательно подготовить осмотр врача гинеколога:

• За двое суток до осмотра необходимо прервать половые контакты.
• Отказаться за 3 дня до осмотра от использования каких-либо химических средств интимной гигиены.

За неделю до осмотра отказаться от применения вагинальных свечей, вагинальных таблеток и спреев.

• Обеспечьте личную гигиену наружных половых органов.
• Для чистоты анализа окрашивание строго запрещено.
• Запрещается мыть в день осмотра, что необходимо для чистоты материала забора.
• За 3 часа до приема гинеколога не мочиться.
• Выбирайте удобную одежду, чтобы можно было легко снимать низ (брюки, юбка, нижнее белье).

При осмотре / отсутствии хламидиоза стоит записаться на прием к врачу. Важно, чтобы материал забора производила не медсестра, а врач. В противном случае вероятность обнаружения заражения падает вдвое. Для исследования утром натощак берется кровь у больных Вены.

Мазок взят в кабинете гинеколога. Фамбер сдается на четвертый день после окончания менструации. Материал для анализа берут из влагалища, уретры, шейки матки с помощью ватных тампонов.Весы выполняются зондом. После удержания прицела женщина может почувствовать боль при мочеиспускании, возможно небольшое кровотечение. Это нормально. В городской гинекологии сдать анализ на хламидиоз к врачу принудительно бесплатно. В частных клиниках стоимость постановки анализа на наличие / отсутствие инфекции у женщин примерно варьируется в рамках единой ценовой политики.

Прайс формируется из стоимости затрат на испытания, амортизацию оборудования, аренду площадей и заработной платы персонала.При выборе лаборатории пациенту следует учитывать репутацию Медового центра или Лаборатории, проводящей опросы.

Ориентировочная стоимость ПЦР QW при хламидиозе от 250 до 300 руб., Посев на хламидиоз — 1800-2100 руб., Артериальное давление на хламидиоз от 500 до 750 руб. Важно знать, что отсутствие клинических проявлений наличия инфекции не означает ее отсутствия, поэтому не следует недооценивать важность современной и комплексной диагностики хламидиоза.

Garmin получает ключ дешифрования после атаки вымогателя | Новости науки и техники

Производитель умных часов Garmin получил ключ дешифрования для восстановления своих компьютерных файлов после атаки вымогателя в прошлый четверг, как стало известно Sky News.

На прошлой неделе сервисов Garmin были отключены от сети после того, как хакеры заразили сети компании вирусом-вымогателем, известным как WastedLocker.

Ряд сервисов компании снова работает, и теперь компания впервые подтвердила «кибератаку», заявив: «Затронутые системы восстанавливаются, и мы ожидаем вернуться к нормальной работе в течение следующих нескольких дней.«

Используйте браузер Chrome для более доступного видеоплеера

На прошлой неделе вредоносное ПО зашифровало файлы в корпоративной сети Garmin и потребовало уплаты выкупа за дешифрование файлов, что фактически остановило весь бизнес компании.

Источники службы безопасности, беседовавшие с Sky News, заявили, что WastedLocker, как полагают, был разработан Evil Corp, хакерской группой, базирующейся в России, в отношении которой были наложены санкции Министерства финансов США в декабре прошлого года.

Санкции означают, что «лицам США, как правило, запрещено совершать сделки» с киберпреступниками, хотя Минфин США не ответил на вопросы о том, применяется ли общий запрет в обстоятельствах вымогательства.

Источники, осведомленные об инциденте с Garmin, которые говорили со Sky News на условиях анонимности, сообщили, что компания — американская транснациональная корпорация, которая публично котируется на NASDAQ — не производила напрямую выплаты хакерам.

Если платеж был произведен через третью сторону, на него также могут распространяться санкции Казначейства, которые предупреждают: «Иностранные лица могут быть подвергнуты вторичным санкциям за сознательное содействие крупной сделке или сделкам с этими назначенными лицами».

Любая выплата выкупа будет относиться только к компании Garmin и будет производиться с использованием контактных данных, оставленных в специальном сообщении, которое вирус включил вместе с зашифрованными файлами, что означает, что компания потенциально может рассматриваться как участвующая в транзакции, если она привлечет для этого третье лицо. от его имени.

Представители Garmin отказались отвечать на неоднократные предложения Sky News оспорить утверждения источников, заявив, что компания «не комментирует слухи и предположения».

На прошлой неделе компания подтвердила клиентам, что она «испытывает сбой, который влияет на Garmin Connect», услугу, которую используют владельцы умных часов компании для отслеживания своих беговых результатов и других целей в области здоровья и фитнеса.

Веб-сайт, мобильное приложение и операторские центры Garmin также были отключены в результате инцидента.

Представитель Garmin сообщил Sky News, что у них нет никакой информации относительно выплаты выкупа.

Они заявили: «Мы работаем над восстановлением наших систем как можно быстрее и приносим извинения за неудобства. Дополнительные обновления будут предоставляться по мере их появления».

В свежем заявлении компании говорится: «У нас нет никаких указаний на то, что какие-либо данные клиентов, включая платежную информацию из Garmin Pay, были доступны, потеряны или украдены.

«Кроме того, функциональность продуктов Garmin не пострадала, кроме возможности доступа к онлайн-сервисам».

Однако Бретт Кэллоу, исследователь кибербезопасности в Emsisoft, сказал Sky News: «Отсутствие индикации не является признаком отсутствия».

Растущая киберпреступная угроза, с которой сталкиваются компании, связана с так называемым шифрованием после вторжения, при котором машины жертвы шифруются после того, как преступники украли данные.

Эти украденные данные затем обычно по частям просачиваются на веб-сайты «имени и позора» преступников, чтобы вымогать у жертвы выкуп.

Жертвами такого вымогательства были , военный подрядчик США по ядерным ракетам и валютная компания Travelex .

Хотя украденная информация не может быть раскрыта после уплаты выкупа, преступники могут владеть ею и потенциально использовать ее для нападения на лиц, которым она принадлежит.

SML.pdf

% PDF-1.5 % 1 0 объект > / Тип / Каталог >> эндобдж 2 0 obj > поток 2016-11-08T04: 48: 31-05: 002016-11-08T04: 48: 31-05: 002016-11-08T04: 48: 31-05: 00Appligent AppendPDF Pro 5.5uuid: 61685d09-a44c-11b2-0a00- 782dad000000uuid: 6168d3bd-a44c-11b2-0a00-80509d71fd7fapplication / pdf

«Лаборатория Касперского» выпускает инструмент для освобождения зашифрованных файлов CryptXXX

«Лаборатория Касперского» разработала инструмент дешифрования, чтобы помочь жертвам CryptXXX восстановить зашифрованные файлы.Особенно вредоносная программа-вымогатель CryptXXX нацелена на устройства Windows, чтобы заблокировать файлы, скопировать данные и украсть биткойны.

Программа-вымогатель CryptXXX распространяется среди пользователей Интернета через спам-сообщения, содержащие зараженные вложения или ссылки на вредоносные веб-сайты. CryptXXX распространяется на веб-страницах, на которых размещен Angler Exploit Kit (EK). После запуска программа-вымогатель шифрует файлы зараженной системы и добавляет к имени файла расширение .crypt. Жертвы информируются о том, что их файлы зашифрованы с помощью RSA-4096 — более надежного алгоритма шифрования — и затем требуется выкуп в биткойнах, если жертвы желают раскрыть свои данные.

В настоящее время существует более 50 семейств программ-вымогателей, поэтому не существует единого универсального алгоритма для противодействия угрозе или влиянию атак. Однако в случае с CryptXXX заявления злоумышленников о RSA-4096 оказались просто хвастовством, и «Лаборатория Касперского» смогла разработать инструмент дешифрования, который теперь доступен на сайте поддержки «Лаборатории Касперского».

Благодаря работе Федора Синицына, старшего аналитика по вредоносным программам в «Лаборатории Касперского», который разработал инструмент, жертвы могут быть уверены, что, если вымогатель CryptXXX проник в их системы, их все еще можно восстановить без выкупа.Для расшифровки зараженных файлов утилите «Лаборатории Касперского» потребуется исходная (не зашифрованная) версия хотя бы одного файла, пострадавшего от CryptXXX.

Пользователи решений «Лаборатории Касперского» дополнительно защищены, так как набор эксплойтов Angler, используемый вымогателем CryptXXX, обнаруживается на ранних стадиях заражения технологией автоматического предотвращения эксплойтов в решениях «Лаборатории Касперского». Продукты «Лаборатории Касперского» детектируют этот эксплойт по следующим вердиктам: HEUR: Exploit.SWF.Agent.gen, PDM: Exploit.Win32.Generic, HEUR: Exploit.Script.Generic.

Для защиты от заражения пользователям необходимо сделать следующее:

1. Регулярное резервное копирование.
2. Установите все критические обновления для вашей ОС и браузеров. Набор эксплойтов Angler, который используется CryptXXX, использует уязвимости программного обеспечения для загрузки и установки вымогателя.
3. Установите защитное решение. Kaspersky Internet Security обеспечивает многоуровневую защиту от программ-вымогателей.Kaspersky Total Security может дополнять комплексную защиту, обеспечивая автоматическое резервное копирование.

Иммунофлуоресцентный анализ образования стрессовых гранул после бактериального заражения клеток млекопитающих

Чтобы объяснить и продемонстрировать протокол, описанный в этой рукописи, мы охарактеризовали изображение индуцированных клотримазолом SG в клетках HeLa, инфицированных или не инфицированных цитозольным патогеном S. flexneri . Схема процедуры представлена ​​на рис. 1 и включает вирулентные и авирулентные S.flexneri нанесены штрихами на чашки Congo Red, подготовка бактерий, инфекция, добавление стресса окружающей среды, фиксация и окрашивание образцов, визуализация и количественный анализ образцов, а также анализ изображений. Для индукции образования SG может использоваться ряд различных напряжений, и для исследования доступны различные маркеры SG. eIF3b представляет собой канонический маркер SG, который также четко окрашивает цитоплазматический компартмент клетки и может использоваться для идентификации краев клеток. G3BP1 — широко используемый маркер SG, который агрегирует в SG без какого-либо фонового окрашивания ( Рисунок 2, A, B и D ).Лучше всего визуализировать клетки с помощью конфокального микроскопа, а стопки, покрывающие всю глубину клетки, загружают в бесплатную программу для анализа изображений ICY (, рис. 2, , , A — C, ). Чтобы лучше идентифицировать инфицированные клетки и поместить клетки либо в инфицированную, либо в неинфицированную группу для последующего анализа, полезно увеличить интенсивность окрашивания нуклеиновой кислотой ( Рисунок 2 D ). Затем в программном обеспечении для анализа изображений точечный детектор используется для идентификации SG в каждой из обозначенных областей интереса (, рисунок 2, , E ), и создается двоичное изображение, которое отображает все идентифицированные SG (, рисунок 2, F ). ).

SG должен быть адаптирован для каждого анализируемого маркера SG, и необходимо тщательно выбирать соответствующие настройки для анализа. Сосредоточение внимания на маркере SG G3BP1, изменение требований к размеру обнаруживаемого пятна или изменение чувствительности параметров обнаружения приведет к различным результатам, как показано на рис. 3 A — C . Выбор шкалы (1–3, хотя шкалы могут быть добавлены) основан на размере пикселя, и, таким образом, при более высоких масштабах меньшие SG не будут учитываться, а количество SG будет уменьшаться ( Рисунок 3, , C ).Чувствительность измеряется от 1 до 100, причем 100 является наиболее чувствительным. При увеличении чувствительности количество обнаруженных SG увеличивается ( Рисунок 3, , C, ). Таким образом, необходимо найти правильные настройки, чтобы свести к минимуму ложные срабатывания и ложные отрицания. Лучше всего это сделать, внимательно проанализировав визуальные эффекты, полученные для каждой настройки. Для G3BP1 шкала 2 с чувствительностью 100 (2 — 100, выделена красным) дала лучший результат. По шкале 2 с более низкой чувствительностью (50 или 25) малые SG не учитывались (см. Оранжевые стрелки).Точно так же шкала 3 оставила неучтенную малую SG, а шкалу 1 — избыточную выборку. Важно отметить, что могут быть добавлены дополнительные шкалы, чтобы сосредоточиться только на больших SG, если это оправдано. Для eIF3b шкала 2 с чувствительностью 55 (2-55) дала лучший результат для eIF3b (выделено красным), хотя красные стрелки выделяют либо недостаточную, либо передискретизацию по шкале 2-50 и 2-55 соответственно.

После того, как параметры для анализа SG будут правильно установлены, данные можно будет анализировать разными способами (, рис. 4, ).Точечный детектор показывает количество SG, обнаруженных в каждой области интереса, чтобы можно было сравнить неинфицированные и инфицированные клетки (, рис. 4, , , A, ). Аналогичным образом задается размер, в данном случае количество пикселей, по которому можно вычислить площадь поверхности (, рис. 4, , , B, ). Графики частотного распределения также полезны для выделения сдвигов в размере SG, обнаруженных в различных популяциях клеток. Здесь полное отсутствие больших SG в инфицированных клетках S. flexneri , а также определенный сдвиг в распределении становится более четким ( Рисунок 4, , C ).Кроме того, интенсивность (здесь показаны минимальная и максимальная интенсивность) предоставляет информацию о качестве анализируемых SG. Для инфицированных клеток S. flexneri SG значительно менее интенсивны. Эти анализы предоставляют статистически значимую информацию как о качественной, так и о количественной природе SG, образующихся в ответ на экзогенный стресс, когда клетки инфицированы S. flexneri или без него.

Рисунок 1 : Схема экспериментальной процедуры заражения клеток S.Flexneri и для анализа влияния образования инфекционных SG. Колония конго-красного цвета и невирулентная колония конго-красного цвета отбираются и выращиваются без промедления в триптическом соевом бульоне. Ночную культуру пересевают на позднюю экспоненциальную фазу до того, как бактерии будут покрыты PLL для повышения адгезии. Клетки-хозяева, выращенные на покровных стеклах в 12-луночных планшетах, заражают бактериями в течение 30 мин. Контрольные клетки не инфицированы. Клетки промывают и обрабатывают индукторами стресса, чтобы вызвать образование SG, либо заменяя среду средой, содержащей стресс, либо подвергая клетки стрессовым условиям, таким как тепло.Затем клетки фиксируют, пермеабилизируют, окрашивают иммунофлуоресцентными SG-специфическими маркерами и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии. Z-проекции сделаны с помощью ImageJ и проанализированы с помощью точечного детектора программного обеспечения для анализа изображений. Затем данные анализируются. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рис. 2 : Точечный детекторный анализ клеток HeLa, инфицированных S. Flexneri в течение 1,5 часов перед добавлением клотримазола на 1 час. А . Иммунофлуоресцентное изображение z-проекции, показывающее клетки, окрашенные маркерами SG eIF3b и G3BP1, DAPI и актином. В . То же изображение, что и в (A), но без пятна актина, чтобы подчеркнуть использование eIF3b для определения границ клеток. С . Снимок экрана программы анализа изображений с модулем точечного детектора. Д . Стробирование инфицированных и незараженных клеток при использовании разных каналов. Чтобы увидеть все бактерии, интенсивность увеличивают.Клетки, в которых присутствует более одной бактерии, помечены красной звездочкой. Е . Результат анализа точечным детектором отдельных областей интереса с указанием названия области, количества точек и их местоположения. Ж . Изображение пятен, обнаруженных в ОИ. Шкала шкалы = 30 мкм. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3 : Сравнение различных настроек шкалы и чувствительности точечного детектора для обнаружения SG с помощью различных маркеров SG. А . Увеличьте изображение клеток HeLa, инфицированных или нет S. flexneri и окрашенных DAPI и маркером SG G3BP1, и проанализированных в различных масштабах (размер пикселя отсечен, 1–3) и чувствительности (1–100). Графическое представление чисел SG в неинфицированных и инфицированных клетках, проанализированных в различных масштабах ( B ) и чувствительности ( C ). Визуальные эффекты ( D ) и графическое представление ( E ) определения номера SG маркера SG eIF3b для одного и того же изображения при изменении предела чувствительности без изменения порогового значения размера пятна.Красные буквы и красные символы указывают на лучшие параметры. Красные стрелки указывают на ложные срабатывания, а оранжевые стрелки — на отсутствие обнаружения SG. Значения включают среднее значение со стандартным отклонением. Лучшие результаты выделены красным. Выбранный статистический анализ включен для ясности с использованием p-значений критерия суммы рангов Вилкоксона слева и F-критерия дисперсии справа. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, нс = несущественно. Шкала шкалы = 10 мкм. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4 : Анализ данных SG, полученных с помощью точечного детектора, полученных из обработанных клотримазолом клеток HeLa, инфицированных S. Flexneri . А . Количество SG G3BP1 на клетку в инфицированных и неинфицированных клетках HeLa. В . Площадь поверхности G3BP1-SG в инфицированных и неинфицированных клетках и частота их процентного распределения ( C ).