Болезнь ящер: Профилактика карантинных болезней животных (ящур и африканская чума свиней).

Содержание

Ящур — Симптомы, лечение — Медицинский справочник АМК

Ящур — вирусная болезнь, которая передается человеку от зараженного животного. Патология проявляется сильной интоксикацией организма и появлением болезненных изъязвлений на слизистых оболочках всех участков тела. Так же пузырьково-язвенные высыпания возникают на коже между пальцами и вокруг ногтей.

Возбудитель ящура — вирус семейства пиконавирусов. Это высокопатогенный микроорганизм, который стойко выдерживает замораживание, но гибнет при обработке дезсредствами и при нагревании выше 60 градусов.

Ящур – это болезнь, которая чаще всего поражает животных (свиней, коз, овец, оленей и коров). Иногда этим недугом могут заразиться даже домашние собаки и кошки. Нередко эта патология становится причиной массового падения скота.

Люди заражаются ящуром чаще всего, употребляя непастеризованное молоко, творог, кефир или сырое мясо зараженных животных. Однако возможна передача инфекции при контакте и через предметы обихода. Более чувствительны к возбудителю дети. Заболевший человек не опасен для окружающих.

Как проявляется ящур?

От периода заражения до появления клинических признаков, как правило, проходит неделя. Начало болезни отмечается следующими признаками:

высокой температурой;
болезненными ощущениями в мышцах;
характерным зудом и жжением во ротовой полости;
сильным выделением слюны;
покраснением глаз;
болезненным ощущением при мочеиспускании;
понос.

При осмотре больного врач определяет отек и покраснение языка, мягкого неба и небных дужек. Отмечается увеличение лимфатических узлов. Через некоторое время на слизистых проявляются мелкие пузырьки. Потом они вскрываются и образуют эрозии, которые сливаются между собой. Эти пораженные участки доставляют сильный дискомфорт. Больные не могут говорить и глотать.

Схожей симптоматикой характеризуется поражение иных слизистых оболочек организма. От других заболеваний ящур отличают высыпания между пальцев и в складках ног и рук.

Острый период заболевания длится в среднем неделю. У детей патология сопровождается тошнотой и поносом.

Лечение ящура

Если был установлен диагноз ящур, больных кладут в больницу не менее, чем на 2 недели. Врач назначает диету, исключающую механическое и химическое раздражение пораженных участков слизистой. Так же больным показано обильное питье. Если заболевший человек не способен глотать пищу, кормление осуществляют через зонд.

Из лекарственных средств показаны противовирусные, иногда противоаллергические, обезболивающие и поддерживающие сердечно-сосудистую систему препараты. Раны на слизистых обрабатывают ускоряющим регенерацию кремами и гелями.

Профилактика ящура

Чтобы избежать заражения в эндемичных районах, следует соблюдать строгие правила личной безопасности.

Обязательными требованиями являются:

кипячение молока;
изготовление творога, масла и других продуктов только из обработанного сырья;
термическая обработка мяса.

ОСТОРОЖНО — ЯЩУР!

Ящур – острая инфекционная болезнь, вызываемая фильтрующимся вирусом, передающаяся человеку от больных животных, характеризующаяся появлением пузырьков и эрозий на слизистой ротовой полости (афтозный стоматит), а также на коже кистей и стоп.

Возбудитель ящура – фильтрующийся ультрамикроскопический вирус относится к семейству Picornoviridae. Вирус ящура характеризуется высокой изменчивостью как в лабораторных, так и в естественных условиях.

Ящур издавна встречается во всех частях земного шара, главным образом в сельскохозяйственных странах. Первые сообщения научного характера о ящуре у людей были опубликованы в Норвегии в 1764 году Сагаром, который наблюдал более 1500 случаев ящура (афтозной ящурной лихорадки). Возбудителем ящура является РНК-содержащий вирус. Ему присуще высокая вирулентность, так же он имеет сходство с эпителиальными структурами слизистых оболочек и кожных покровов. Вирус устойчив во внешней среде. В молоке он сохраняется до 25–30 ч (в условиях холодильника – до 10 дней), в масле – до 2 мес, в колбасах и солонине – до 50 дней, в отрубях – от 2 до 5 мес., в высохшей слюне (на шерсти животных, на одежде) – от 1 до 3 мес. В замороженных тушах вирус сохраняется до 687 дней. Ультрафиолетовые (солнечные) лучи и кипячение (в течение 5 мин) инактивируют вирус.

Резервуаром и источником инфекции являются больные животные, особенно крупный рогатый скот, а также свиньи, овцы и козы. Отмечена восприимчивость к ящуру и диких животных: лосей, косуль, северных оленей, сайгаков и др.

Особенно тяжело болеют молодые животные, среди которых отмечается большая летальность. Кроме перечисленных выше животных к ящуру восприимчивы верблюды. Изредка ящуром болеют лошади, собаки, кошки. Переносчиками могут оказаться восприимчивые к этой болезни грызуны (суслики, крысы, мыши), а также некоторые птицы (сами не болеющие, но выделяющие вирус, попавший с кормом, через кишечник) и овод. Животные заражаются при взаимном контакте на пастбищах, в коровниках и хлевах. Выделяясь из организма больных животных со слюной, молоком, навозом, мочой, содержимым пузырьков, вирус ящура попадает на подстилки, корм, спецодежду обслуживающего персонала, где может длительно сохраняться.

Ящур можно отнести к профессиональному заболеванию. Оно в основном распространяется в сельской местности, и у тех людей, которые работают в сельскохозяйственных животноводческих предприятиях, мясокомбинатов, которые занимаются забоем скота и переработкой животного сырья.

Ящур так же может встретиться и у детей. К детям вирус попадает после употребления зараженных молочных продуктов.

Как можно заразиться ящуром

Основной путь заражения людей – через сырое молоко больных животных и продукты его переработки, реже через мясо. У людей, непосредственно контактирующих с больными животными, возможна прямая передача инфекции (при доении, уходе, лечении, убое), воздушно-капельный путь заражения (при дыхании, кашле животных), а также заражение через предметы, загрязненные выделениями животных. От человека к человеку инфекция не передается. Дети более восприимчивы к ящуру, чем взрослые.

Симптомы ящура

Инкубационный период болезни составляет в среднем от 3 до 4 дней, но болезнь может увеличиться от 10 до 14 дней или наоборот сократиться до двух дней. Процесс заболевания начинается с сильного озноба, при этом температура поднимается до 40 градусов. К этим симптомам добавляются головная боль, снижается аппетит, наблюдаются мышечные боли и особо сильные в области поясницы. На первые сутки течения болезни, инфицированный ощущает чувство жжения и сухости во рту, а так же сильное слюноотделение. После некоторого времени на слизистой оболочке рта начинают высыпать маленькие пузырьки, примерно от 1 до 3 мм. Самое большое их скопление располагается на кончике и по краям языка, так же на деснах, слизистой оболочке щек и губах. Жидкость, которая наполняет образовавшие пузырьки прозрачная, постепенно она мутнеет, диаметр пузырьков увеличивается, при этом образуя эрозии.

Если ящур поразил детей, то они жалуются на затрудненное глотание, а так же боли при разговоре и жевании. Из-за этого они становятся раздражительными и впоследствии вовсе отказываются от приема пищи. Зачастую слюноотделение может быть настолько сильным, что слюна может вытекать струей. Высыпания пузырьков так же могут быть на слизистых оболочках носа, конъюнктиве, желудка. Помимо слизистых оболочек, высыпания могут быть и на коже лица, предплечий, кистей, стоп и голеней, особенно часто они встречаются между пальцами. При условии, что болезнь протекает без осложнений, то лихорадка длится на протяжении от 3 до 6 суток. После этого начинается период выздоровления, который сопровождается быстрым заживлением всех язв. Общее время течения болезни составляет около 2х недель.

Встречаются случаи, когда длительность болезни составляет от 1 до 1,5 лет, с периодическими высыпаниями.

Если вирус проникает через ЖКТ, то стоматит может и не появиться. В таком случае вся болезнь протекает по типу острого гастроэнтерита. Появляются симптомы интоксикации, повышается температура, боли в животе, тошнота, рвота и жидкий стул. Обычно эта форма течения болезни наблюдается у детей, которые заражаются через молоко и молочные продукты.

В большинстве случаев болезнь заканчивается полным выздоровлением, при этом она не оставляет после себя никаких следов. Но совсем другой прогноз имеет тяжело протекающий ящур, которым болеют дети раннего возраста. Некоторые случаи заболевания заканчиваются летальным исходом.

Ящур может вызвать осложнения. Но это происходит довольно редко. Осложнения могут выражаться в виде пневмонии, миокардита, гнойных заболеваний кожи.

Профилактика ящура

1.Санитарно-ветеринарные мероприятия

Основой профилактики ящура является постоянный контроль над различными передвижениями животных и продуктов питания, которые получают от животных. При выявлении заболевания у хотя бы одного животного вводится строжайший карантин. Больное животное изолируют и проводят полную дезинфекцию помещений. Запрещается, какой-либо вывоз и ввоз молока и мяса от больного животного.

Обработке дезинфицирующим средством подлежит все помещение, где содержатся животные, рабочий инвентарь, спецодежда, средства ухода и даже навоз. Для того чтобы не допустить эпидемии также целесообразно проводить плановую вакцинацию среди животных, которая защитит их от внезапной вспышки заболевания.

2.Соблюдение мер личной предосторожности

Чтобы исключить контактный путь заражения при уходе за больными или подозрительными животными, надо строго соблюдать меры индивидуальной профилактики. Люди, которые ухаживают за животными, должны делать это в специальной одежде, работать в перчатках, после работы обязательно надо хорошо вымыть руки с мылом. Не допускаются к работе с больными животными беременные, подростки, лица с микротравмами рук.

Чтобы исключить алиментарный путь заражения необходимо строго придерживаться следующих правил:

1) Не употреблять в пищу сырое молоко, а также молочную продукцию домашнего изготовления (сметана, творог, сыр). Молочные продукты рекомендуется употреблять только после надлежащей термической обработки.

2) Подвергать тщательной термической обработке сырое мясо (хорошо проваривать, прожаривать, тушить, запекать). После приготовления сырого мяса тщательно вымыть руки, хорошо промывать посуду, используемую при приготовлении мяса.

3) Не покупать молочные и мясные продукты в местах несанкционированной торговли: вдоль дорог, на улицах, стихийных рынках.

Если же заражение всё же произошло, необходимо помнить, что люди, у которых диагностировали ящур, обязательно должны быть госпитализированы! Самолечение при данном заболевании недопустимо!

Роспотребнадзор — От человека к человеку ящур не передается

Фото: ИА «Башинформ»

Роспотребнадзор — От человека к человеку ящур не передается Фото: ИА «Башинформ»

Как уберечься от ящура — разъяснения Роспотребнадзора.

Ящур представляет собой острую зоонозную инфекцию, которая передается от больного парнокопытного животного к человеку.

Источником и резервуаром ящура являются домашние и дикие копытные животные. Кроме этого распространителями могут являться и некоторые виды грызунов, инфицированные, больные животные, а также животные-реконвалесценты, которые длительное время могут быть вирусоносителями.

Важно: от человека к человеку ящур не передается.

Основной путь передачи ящура контактно-бытовой, при этом заражение происходит при попадании вируса на поврежденную кожу или слизистую оболочку. Заражение может произойти при уходе за животными, обработке шкур, шерсти, при вдыхании пылевой взвеси, содержащей вирусы. Возможна реализация пищевого пути заражения при употреблении необработанных должным образом молочных и мясных продуктов от больных животных. Инкубационный период: 1-7, реже до 21 суток.

В целях предотвращения заноса вируса ящура необходимо:

— Соблюдать требования зоогигиенических норм и правил содержания животных, приобретать корма из благополучных территорий и проводить их термическую обработку перед скармливанием, оборудовать санитарными пропускниками, дезинфекционными барьерами (ковриками) места въездов (входов) на территорию объектов хозяйства, а также содержать их в рабочем состоянии;

— Обеспечить регулярное проведение дезинфекции мест содержания животных, хранения и приготовления кормов, а также транспортных средств при въезде на территорию хозяйства;

— Усилить охрану животноводческих ферм, установить на них строгий ветеринарно-санитарный режим и режим содержания и эксплуатации животных;

— Систематически проводить дератизацию и дезинсекцию;

— Обеспечить работу хозяйств по закрытому типу, исключить допуск к местам содержания животных посторонних лиц, исключить завоз необработанного инвентаря и заезд на территорию транспортных средств, не прошедших специальную обработку;

— Не приобретать животных и продукцию животного происхождения в местах несанкционированной торговли без ветеринарных сопроводительных документов;

— Всех вновь приобретаемых животных регистрировать в органах ветеринарной службы и сельских администрациях и осуществлять обязательное карантинирование животных перед вводом в основное стадо;

— Обеспечить проведение предубойного осмотра животного ветеринарным специалистом. Обеспечить проведение ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и продуктов убоя ветеринарным специалистом.

При возникновении подозрения на заболевание животных ящуром руководитель хозяйства (владелец животного) и ветеринарный специалист, обслуживающий хозяйство (населенный пункт), обязаны немедленно сообщить о возникшем подозрении специалистам государственной ветеринарной службы и до их прибытия в хозяйство (населенный пункт):

— изолировать больных и подозрительных по заболеванию животных в том же помещении, в котором они находились;

— прекратить убой и реализацию животных всех видов и продуктов их убоя;

— прекратить вывоз с территории хозяйства (фермы) продуктов и сырья животного происхождения, кормов и других грузов.

Профилактика ящура у человека заключается в соблюдении мер личной предосторожности в очаге и санитарно-ветеринарных мероприятиях (при доении, уходе, лечении, убое, при использовании инвентаря и предметов загрязненных выделениями больных животных). Обязательны пастеризация и кипячение молока, приготовление масла из обработанных сливок, а также тщательное соблюдение мер безопасности при уходе за больными животными и возможном контакте с ними (работа в спецодежде, дезинфекция спецодежды).

Ящур у человека внедряется в слизистую рта и (или) верхних дыхательных путей. В этих местах появляются пузырьки, которые разрушаются по истечению инкубационного периода (от трех до восьми дней), вследствие чего вирус ящура попадает уже в кровь. На этой стадии образуются вторичные высыпания на слизистых губ, носа, зева, рта, щек, языка. Следом наступает септическая стадия ящура, которая характеризуется повышенной температурой (до 40°) и появлением пузырьков на кожном покрове (между пальцами рук и около ногтей). Из кровеносных сосудов вирус ящура попадает во внутренние органы и выделяется с калом, мочой, слюной, желчью. Общее состояние больного ящуром в начале болезни тяжелое – повышенная температура, слабость, озноб, пониженное давление, болит голова и учащается пульс. Все это происходит в первые два дня болезни, причем наиболее ярко и болезненно выражены симптомы ящура в первые сутки: у человека болезненны слизистые носа, языка, рта, он может ощущать жжение во рту, испытывать мышечные и поясничные боли.

При появлении этих симптомов следует обязательно обращаться у врачу.

О выявлении на территории Владимирской области заболевания крупного рогатого скота ящуром

Комитет ветеринарии города Москвы (далее — Комитет) информирует о выявлении на территории Владимирской области заболевания крупного рогатого скота ящуром.

Ящур — вирусная, остро протекающая и быстро распространяющаяся болезнь парнокопытных животных. Ящуром может болеть и человек.

Источником инфекции являются больные ящуром животные, в том числе находящиеся в инкубационном (скрытом) периоде болезни, который обычно длится от 1 до 7 дней, а иногда до 21 дня. Такие животные выделяют вирус во внешнюю среду с содержимым и стенками афт, молоком, слюной, выдыхаемым воздухом, мочой и фекалиями.

Отдельные животные, переболевшие ящуром, а также иммунизированные против ящура и содержавшиеся совместно с больными, длительное время могут быть вирусоносителями и являться потенциальным источником инфекции.

Факторами передачи возбудителя ящура являются необеззараженные продукты и сырье, полученные от больных ящуром животных, а также загрязненные выделениями больных животных корма, вода, подстилка, предметы ухода, одежда и обувь людей, транспортные средства, на которых вирус ящура способен длительно сохраняться. Инфицированные вирусом ящура мелкие частицы кормов, почвы, подстилки и др. могут переноситься ветром на расстояние нескольких километров.

Особенно благоприятными условиями для сохранения вируса во внешней среде являются низкая температура, повышенная влажность и нейтральная среда объектов.

В целях недопущения заноса на территорию административных округов города Москвы возбудителя ящура, исключения рисков, связанных с распространением инфицированной продукции, предотвращения угрозы причинения вреда здоровью животных и гражданам, необходимо принять неотложные меры в случае возникновения заразных болезней или подозрения в их возникновении, а именно:

— Охрану хозяйства (предприятия) от заноса вируса ящура, исключение хозяйственных связей с неблагополучными по ящуру хозяйствами (предприятиями) и населенными пунктами.

— Закрепление за восприимчивыми животными постоянного обслуживающего персонала в необходимом количестве, исключение общения персонала, с лицами, обслуживающими животных в неблагополучных по ящуру хозяйствах (предприятиях) и населенных пунктах, а также запрещение посещения хозяйств (предприятий) посторонними лицами.

— Перевод хозяйства (предприятия) на строгий ветеринарно-санитарный режим содержания и эксплуатации животных, исключение контакта восприимчивых животных благополучных по ящуру хозяйств (предприятий) с животными, происходящими и (или) содержащимися в неблагополучных по ящуру хозяйствах (предприятиях) и населенных пунктах.

Закрепление за восприимчивыми животными постоянных пастбищных участков, мест поения и путей перегона, или перевод хозяйств на работу в режиме без выгульного содержания или закрытого типа.

— Проведение периодических обследований всего имеющегося поголовья восприимчивых животных с целью своевременного выявления животных с клиническими признаками, характерными для ящура.

— Ввоз в хозяйство продукции животноводства, включая молоко, кормов, фуража, инвентаря и зооветатрибутов, произведенных только из местности благополучной по ящуру и других заразных болезней животных.

Сбор, утилизацию (уничтожение) биологических отходов в соответствии с Ветеринарно-санитарными правилами сбора, утилизации и уничтожения биологических отходов, утвержденными Главным государственным ветеринарным инспектором Российской Федерации 4 декабря 1995 г. № 13-7-2/469 (на специализированных предприятиях под контролем государственной ветеринарной службы).

Немедленно извещать ветеринарных специалистов о всех случаях внезапного падежа, заболевания животных с подозрением на заразные болезни (потеря упитанности, признаки воспаления, повышение температуры тела, высыпания, афты и эрозии на слизистой оболочке ротовой полости, на коже венчика и межкопытной щели, носового зеркальца, вымени, увеличение поверхностных лимфатических узлов) или одновременного массового заболевания животных, а также об их необычном поведении (телефон «горячей линии» ГБУ «Мосветстанция» 8 (495) 612-12-12 – круглосуточно).

Ящур. Памятка населению по профилактике.

Ящур.

Памятка населению по профилактике.

Ящур — вирусная, остро протекающая болезнь домашних и диких парнокопытных животных, характеризующаяся лихорадкой и афтозными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, кожи вымени и конечностей. Чаще всего болеют крупный рогатый скот и свиньи, менее восприимчивы овцы, козы и дикие парнокопытные. Молодые животные более восприимчивы и переболевают тяжелее, чем взрослые.
Заболеть ящуром могут и люди.

Возбудитель ящура — вирус, не устойчивый к высоким температурам, быстро погибает при нагревании до 60 С, воздействий УФ лучей и обычных дезинфицирующих веществ. Особенно благоприятными условиями для сохранения вируса во внешней среде являются низкая температура, повышенная влажность и нейтральная среда объектов.
Животные, переболевшие вирусом одного типа, могут заболеть в случае заражения вирусом другого типа.

ИСТОЧНИК БОЛЕЗНИ — больные животные, в том числе находящиеся в инкубационном (скрытом) периоде болезни, который обычно длится от 1 до 7 дней, а иногда до 21 дня. Такие животные выделяют вирус во внешнюю среду с содержимым и стенками афт, молоком, слюной, выдыхаемым воздухом, мочой и фекалиями, в результате чего происходит заражение пастбищ, помещений, инвентаря, водоисточников, кормов, транспортных средств. Заражение происходит через слизистые оболочки ротовой полости, при поедании кормов и питья, облизывании различных инфицированных предметов.
Отдельные животные, переболевшие ящуром, а также иммунизированные против ящура и содержавшиеся совместно с больными, длительное время могут быть вирусоносителями и являться потенциальным источником инфекции.

Передача заболевания здоровым животным может осуществляться через необеззараженные продукты и сырье, полученные от больных ящуром животных, а также загрязненные выделениями больных животных корма, воду, подстилку, предметы ухода, одежду и обувь людей, транспортные средства, на которых вирус ящура способен длительно сохраняться. Инфицированные вирусом ящура мелкие частицы кормов, почвы, подстилки и др. могут переноситься ветром на расстояние нескольких километров.
ВАЖНО!!!

Основной путь инфицирования людей – через сырое молоко больных животных и продукты его переработки, реже через мясо. У лиц, непосредственно контактирующих с больными животными, возможна прямая передача инфекции (при доении, уходе, лечении, убое), воздушно-капельный путь заражения (при дыхании, кашле животных), а также через предметы, загрязненные их выделениями. От человека к человеку инфекция не передается. Дети более восприимчивы к ящуру, чем взрослые.

СИМПТОМЫ ЯЩУРА У ЧЕЛОВЕКА.

После непосредственного заражения человека вирусом ящура начинается инкубационный бессимптомный период, который длится от трех до десяти дней. Затем происходит активация вируса в крови зараженного человека, которая проявляется себя богатой симптоматикой. Начало болезни, как правило, острое. У больного диагностируют резкое повышение температуры, сильную слабость, ломоту в суставах, головную боль, отсутствие аппетита. Также присутствует боль в мышцах, особо ощутимая в области поясницы. По истечению 2-3 дней к указанным симптомам ящура присоединяется светобоязнь, усиленное слюноотделение, появляются болезненные ощущения при мочеиспускании. Затем появляются признаки на слизистых оболочках и коже. Так, на внутренней стороне щек образуются небольшие пузырьки белого цвета, которые называют афтами. В некоторых случаях, при осложненном течении болезни они появляются также и на слизистой части губ, глаз, носа, на поверхности языка. Встречаются также афты, расположенные на кончиках пальцев, в межпальцевых складках. Через небольшой промежуток времени афты разрываются и на их месте остаются язвочки с сероватым дном и красной каемкой. После того, как афты вскрылись, температура тела у больного немного падает, однако слюноотделение повышается, становится тяжело пережевывать и глотать пищу.

ПРОФИЛАКТИКА ЯЩУРА У ЧЕЛОВЕКА

Профилактика ящура состоит, в первую очередь, в недопущении появления эпидемиологической ситуации в животноводческих сельских хозяйствах. При выявлении заболевания у хотя бы одного животного вводится строжайший карантин. Больное животное изолируют и проводят полную дезинфекцию помещений. Делает это специальная санитарно-эпидемиологическая служба. Обработке дезинфицирующим средством подлежат все помещения, где содержатся животные, рабочий инвентарь, спецодежда и другие средства ухода. Для того чтобы не допустить эпидемии также целесообразно проводить плановую вакцинацию среди животных, которая защитит их от внезапной вспышки заболевания. Кроме того, для предотвращения заражения людей, надо строго придерживаться инструкций по технике безопасности при работе на ферме. Люди, которые ухаживают за животными, должны делать это в специальной одежде, после работы обязательно надо хорошо вымыть руки с мылом. Так как люди чаще всего заражаются вирусом ящура через молочные продукты, то врачи рекомендуют употреблять их только после надлежащей термической обработке. Также следует с осторожностью подходить к приготовлению сырого мяса. Оно обязательно должно быть хорошо прожаренным, а после готовки надо тщательно вымыть руки и посуду, в которой готовилась пища.

При появлении симптомов ящура незамедлительно обратитесь к врачу!!!

БУДЬТЕ ЗДОРОВЫ!

Официальный сайт Администрации города Южно-Сахалинска

Государственное бюджетное учреждение «Станция по борьбе с болезнями животных №1»

Ящур (афтозная лихорадка) — острое инфекционное заболевание животных, главным образом крупного рогатого скота, коз и свиней, выражающееся в лихорадке и образовании сыпи в виде пузырьков (афт) на слизистой полости рта, на коже в области копытец, на коже вымени.

В определенных условиях ящур может передаваться и человеку (при доении, уходе, лечении, убое), особенно лицам, контактирующим с больными животными, или детям, потребляющим сырое молоко от ящурных коров, воздушно-капельный путь заражения (при дыхании, кашле животных), а также через предметы, загрязненные их выделениями. Дети более восприимчивы к ящуру, чем взрослые.

Переносчиком инфекции могут быть и невосприимчивые к ящуру животные, такие как собаки, кошки, лошади, а иногда и птицы.

Источником инфекции являются больные ящуром животные, в том числе находящиеся в скрытом периоде течения болезни, который обычно длится от 1 до 7 дней, иногда до 21 дня. Больные животные выделяют вирус во внешнюю среду с содержимым и стенками афт, молоком, слюной, выдыхаемым воздухом, мочой и фекалиями, в результате чего происходит заражение пастбищ, помещений, инвентаря, водоисточников, кормов, транспортных средств. Кроме того, источником возникновения заболевания животных ящуром являются необезвреженные продукты и сырье, полученные от больных ящуром животных, а также загрязненные выделениями больных животных корма, вода, подстилка, предметы ухода, одежда и обувь людей, транспортные средства, на которых вирус ящура способен длительно сохраняться и передвигаться на значительные расстояния. Инфицированные вирусом ящура мелкие частицы кормов, почвы, подстилки и др. могут переноситься ветром на расстояние нескольких километров.

Клинические признаки заболевания

При остром течении болезни — у крупного рогатого скота отмечаются ухудшение аппетита, вялая жвачка, повышенное слюноотделение. Затем повышение температуры тела до 40,5-41,5⁰С, угнетение, отказ от корма, прекращение жвачки. На 2-3 день забощлевания на внутренней поверхности нижней и верхней губ, на беззубом крае нижней челюсти, на языке и слизистой оболочке щек появляются афты, заполненные вначале прозрачной, затем мутноватой жидкостью, у некоторых животных — в межкопытцевой щели и на вымени. Образование афт в полости рта сопровождается сильным слюнотечением, развитие афт на конечностях вызывает нарушение походки, хромоту, появление панарициев, залёживание животных. Через 12-24 часа стенки афт разрываются, образуются эрозии, в это время температура тела понижается до нормальной, наступает обильное слюнотечение. У лактирующих животных резко понижается молочная продуктивность. Беременные животные часто абортируют. У телят ящур протекает в безафтозной форме с явлениями острого гастроэнтерита. На течение болезни большое влияние оказывают различные стрессовые воздействия, сопутствующие болезни и др. Смерть взрослых животных наступает через 5-14 суток, молодняка — через 1-2 суток.

У свиней отмечаются лихорадка, угнетение, ухудшение аппетита. На коже конечностей, в области межкопытцевой щели, венчика и мякишей появляются красные болезненные припухлости, затем афты, которые, разрываясь, образуют эрозии. Заболевание конечностей сопровождается хромотой, иногда спаданием копытец. Чаще афты появляются на пятачке, сосках и редко на слизистой ротовой полости. У взрослых свиней ящур длится 8-25 дней, у поросят-сосунов протекает в септической форме и в первые 2-3 дня болезнь вызывает гибель 60-80% животных.

У овец характерным симптомом является хромота, чаще поражаются конечности, реже -ротовая полость.

Специфическая профилактика

Основой профилактики ящура является поголовная вакцинация восприимчивых животных. Формирование иммунитета проходит в первые четыре дня после вакцинации (иммунитет, невосприимчивость животных к заражению длится в течении одного года при условии соблюдения схемы вакцинации).

Основные мероприятия по профилактике ящура:

1.Обеспечение работы хозяйств в режиме «закрытого типа», исключение допуска к местам содержания животных посторонних лиц, исключение завоза необработанного инвентаря и заезда на территорию, где содержатся животные, транспортных средств, не прошедших специальной обработки; Обязательно проводить огораживание и оканавливание территории хозяйства;

2.Оборудование санитарными пропускниками, дезинфекционными барьерами (ковриками) въездов (входов) на территорию животноводческого предприятия, а также поддержание их в рабочем состоянии;

3. Исключить доступ на территорию хозяйства (предприятия) бродячих собак и диких животных, а также других видов животных, не свойственных данному хозяйству;

4. Запретить бесконтрольный выгул и пастьбу животных. Не осуществлять пастьбу в непосредственной близости от федеральных трасс и железнодорожных путей, железнодорожных вокзалов и аэропортов;

5. Соблюдать зоогигиенические и ветеринарные требования содержания животных, приобретение кормов только в благополучных по заболеванию животных территориях с обязательным проведением их термической обработки перед скармливанием, подтверждение их безопасности в ветеринарно-санитарном отношении;

6. Покупку, продажу, сдачу на убой, выгон, размещение на пастбище и все другие перемещения и перегруппировки животных, реализацию животноводческой продукции проводить только с ведома и разрешения государственной ветеринарной службы;

7. Приобретать животных и продукцию животного происхождения в местах санкционированной торговли с наличием ветеринарных сопроводительных документов, подтверждающих благополучие места вывоза животных;

8. Лицам, обслуживающим животных, строго соблюдать правила личной гигиены, иметь запас спецодежды, средств индивидуальной защиты, запас дезинфекционных средств;

9. Систематически в животноводческих помещениях (в т.ч в помещениях для хранения и приготовления кормов) проводить дезинфекцию, дератизацию и дезинсекцию;

10.Вновь приобретаемых животных регистрировать в сельских администрациях, проводить обязательное биркование и осуществлять обязательное карантинирование перед вводом в основное стадо;

11. Не допускать употребление сырого молока, приобретенного у частных лиц;

12. ОБЯЗАТЕЛЬНО ВАКЦИНИРОВАТЬ КРС начиная с 4-х месячного возраста, МРС начиная с 3-х месячного возраста с обязательной ревакцинацией;

13. Обеспечение доступа к обслуживанию животных ветеринарными специалистами (проведение вакцинации и необходимых клинических исследований, периодическое осуществление ветеринарных осмотров животных и др. с измерением температуры тела;

14. Убой животных производить только на специализированных бойнях, не допускать подворного убоя; Не допускать убоя животных, в том числе и вынужденного убоя без предварительного осмотра ветеринарным специалистом, а после убоя обязательное проведение ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и продуктов убоя ветеринарным специалистом;

15. Не допускать незаконной торговли, в несанкционированных местах торговли;

16. Строго выполнять требование Правил по сбору, утилизации и уничтожения биологических отходов;

17. Ввоз и перемещение животных осуществлять по согласованию с государственным ветеринарным учреждением;

18. Создать резерв горюче-смазочных материалов в случае ликвидации ЧС;

19. При возникновении подозрения на заболевание животных руководитель хозяйства (владелец животного) и ветеринарный специалист, обслуживающий хозяйство (населенный пункт), обязаны немедленно сообщить о возникшем подозрении специалистам государственной ветеринарной службы, ГБУ «Станция по борьбе с болезнями животных №1», по тел. 77-02-02, 77-23-36 и до их прибытия в хозяйство (населенный пункт) обязаны:

изолировать больных и подозрительных по заболеванию животных в том же помещении, в котором они находились; закрепить за ними отдельный обслуживающий персонал, исключив контакт его с лицами, ухаживающими за другими животными. Остальных животных оставить на месте, и не допускать их перевода в другие помещения и на другие участки пастбищ;
домашнюю птицу на территории неблагополучного пункта содержать в закрытых помещениях, а собак — на привязи;
не допускать передвижения людей за пределы неблагополучного пункта без соблюдения мер и порядка, установленных местными ветеринарными органами и комиссией по борьбе с ящуром;
лица, обслуживающие больной или подозрительный в заболевании ящуром скот должны быть обеспечены сменной одеждой и обувью, полотенцами, мылом и дезрастворами для обработки рук, а также аптечкой первой медицинской помощи;
прекратить убой и реализацию животных всех видов и продуктов их убоя;
прекратить вывоз с территории хозяйства (фермы) продуктов и сырья животного происхождения, кормов и других грузов;
необходимо прекратить любые хозяйственные связи с неблагополучной по ящуру территории.

Выполнение указанных мер обеспечит надежную сохранность принадлежащих Вам животных, сохранит Ваше здоровье!

ГБУ РО «Ростовская облСББЖ с ПО»

Ящур – высококонтагиозная, остро протекающая вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, появлением пузырьков (афт) и эрозий на слизистой оболочке ротовой, носовой полостей, а также на коже сосков вымени, в межкопытной щели. Ящуром может болеть и человек.

Возбудитель (вирус) обладает высокой устойчивостью в окружающей среде, хорошо переносит высушивание и замораживание. На одежде персонала, ухаживающего за больными животными, сохраняется до 3-х месяцев, на шерсти животных до 1 месяца. Длительно остается жизнеспособным в молоке, мясе, а также в навозе.

Основной источник возбудителя инфекции – больные животные (крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, причем последние болеют особенно тяжело).

Инкубационный (скрытый) период обычно длится от одного до 7 дней, а иногда до 21 дня. Зараженные животные выделяют вирус во внешнюю среду с содержимым и стенками пузырьков, молоком, слюной, выдыхаемым воздухом, мочой и фекалиями. Факторами передачи возбудителя ящура являются не обеззараженные продукты и сырье, полученные от больных ящуром животных, а также загрязненные выделениями больных животных, корма, вода, подстилка, предметы ухода, транспортные средства. Инфицированные вирусом ящура мелкие частицы корма, почвы, подстилки могут переноситься ветром на расстояние нескольких километров.

Характерными клиническими признаками болезни является кратковременная лихорадка, образование афт и эрозии на слизистой оболочке ротовой полости, на коже венчика и межкопытной щели, носового зеркальца, вымени. Животные отказываются от корма, хромают, наблюдается обильное слюноотделение. Возможно переболевание животных со стертыми клиническими признаками. У новорожденного молодняка, ящур может протекать в сверх острой форме со смертельным исходом без образования афт.

На протяжении более 30 лет данное заболевание не регистрировалось на территории Ростовской области и прилегающих областях.

Ветеринарная служба Ростовской области напоминает владельцам животных о необходимости соблюдения следующих правил по недопущения возникновения инфекционных заболеваний среди домашних животных:

Все домашние животные должны быть зарегистрированы в территориальных отделах и в ветеринарной станции по борьбе с болезнями животных.
Любое перемещение животных (продажа, покупка, убой) должны осуществляться с ведома государственной ветеринарной службы при наличии ветеринарных сопроводительных документов.
Все животные дважды в год должны быть подвергнуты плановым диагностическим исследованиям и профилактическим вакцинациям.
Не допускать посещение мест содержания животных посторонними лицами.
Не допускать реализацию животноводческой продукции без проведения ветеринарно-санитарной экспертизы.
При первых признаках заболевания животных обращаться в ветеринарную службу

Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов ящура

Панголины могли заразить людей

Есть много вопросов о новом коронавирусе, которые остаются без ответа, например «как распространяется вирус?» и «откуда это взялось?» Теперь китайские исследователи говорят, что, по их мнению, панголин — чешуйчатое, в остальном безобидное млекопитающее, питающееся муравьями, — мог распространить вирус среди людей.

Поделиться на Pinterest Исследователи указывают на панголина как на потенциального носителя нового коронавируса.

Когда коронавирусы передаются людям, это обычно происходит через контакт с животным, которое является носителем вируса.

Medical News Today недавно опубликовал обширную статью о новом вирусе, объясняя, что одними из наиболее распространенных переносчиков коронавирусов являются летучие мыши.

Однако маловероятно, что летучие мыши передают вирус напрямую человеку, поэтому, как и в случае с большинством подобных вирусов, таких как SARS и MERS, обычно ответственным является животное-посредник. Для SARS это была циветта, а дромадеры способствовали распространению MERS.

Несколько дней назад Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) связалась с MNT и заявила, что еще не знает конкретного источника нового коронавируса.

«Исследователи в Китае изучают это, но еще не определили источник», — заявили они тогда.

Всего несколько дней спустя исследователи Шен Юнъи и Сяо Лихуа из Южно-Китайского сельскохозяйственного университета в Гуанчжоу объявили на пресс-конференции, что они могли идентифицировать панголина как источник вируса.

Объявление «Ящер обнаружен как потенциальный промежуточный хозяин нового коронавируса в Южном Китае» можно найти на веб-сайте университета.

Ранее исследователи показали, что новый коронавирус больше всего похож на два других вируса летучих мышей; Фактически, его геномное сходство с этими вирусами составляет 88%, что заставило ученых поверить в то, что летучие мыши были носителями нового вируса.

Теперь два исследователя использовали геномное секвенирование, чтобы сравнить ДНК нового коронавируса у людей с ДНК животных, и обнаружили совпадение с ящерами на 99%.

«Это чрезвычайно интересное наблюдение. Хотя нам нужно увидеть больше деталей, это имеет смысл, поскольку сейчас появляются некоторые другие данные о том, что панголины несут вирусы, которые тесно связаны с 2019-nCoV », — сказал Эдвард Холмс, вирусолог-эволюционист Сиднейского университета, Австралия престижный журнал Nature .

«Это последнее открытие будет иметь большое значение для предотвращения и контроля происхождения нового коронавируса», — говорится на веб-сайте китайского университета.

Лю Яхонг, президент Южно-Китайского сельскохозяйственного университета, объявил на конференции, что вскоре они опубликуют результаты, чтобы помочь контролировать вирус.

Панголины — родственники броненосцев и муравьедов — чешуйчатые млекопитающие, питающиеся роющими насекомыми, такими как термиты и муравьи.

Панголины также являются вымирающим видом, и предыдущие исследования показали, что коронавирус, вероятно, ответственен за убийство большого количества малайских панголинов.

В Китае закон защищает животных, и продажа панголинов может привести к 10 годам тюремного заключения. Тем не менее, животное является жертвой незаконного оборота — на самом деле, исследователи описывают его как «самое браконьерское и продаваемое млекопитающее в мире».

Китайцы используют чешую животного для лечения таких заболеваний, как артрит, менструальная боль и кожные заболевания.Также люди продают мясо животного и считают его деликатесом.

Пытаясь отследить источник нового коронавируса, исследователи предположили, что инфекция возникла на рынке морепродуктов и диких животных в Ухане, Китай.

Хотя официально этот рынок не продавал ящеров, люди могли продавать животных там незаконно.

Панголины могли передать болезнь людям

Однако маловероятно, что летучие мыши передают вирус напрямую человеку, поэтому, как и в случае с большинством подобных вирусов, таких как SARS и MERS, обычно ответственным является животное-посредник.Для SARS это была циветта, а дромадеры способствовали распространению MERS.

«Исследователи в Китае изучают это, но еще не определили источник», — заявили они тогда.

Китайцы используют чешую животного для лечения таких заболеваний, как артрит, менструальная боль и кожные заболевания. Также люди продают мясо животного и считают его деликатесом.

Хотя официально этот рынок не продавал ящеров, люди могли продавать животных там незаконно.

Недавно идентифицированные вирусные геномы ящеров со смертельным исходом

Virus Evol. 2020 Янв; 6 (1): veaa020.

, ^v1 , ^v2 , ^v1, ^v3 , ^v4, ^v1, ^v5, ^v4, 901 901 901 901 , ^v3

Wen-Hua Gao

^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай

Xian-Dan Lin

^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай

Ян-Мэй Чен

^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай

Chun-Gang Xie

^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай

Чжи-Чжоу Тан

^v1 Отдел зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай

Цзя-Цзюнь Чжоу

^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай

Шуай Чен

^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай

Эдвард С. Холмс

^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006, Австралия

Yong-Zhen Zhang

^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай

^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай

^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай

Вен-Хуа Гао, Сиань-Дан Линь и Ян-Мей Чен внесли равный вклад к этой работе.

Авторские права © Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/). 4.0 /), который разрешает некоммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь по адресу [email protected]. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Дополнительные материалы

veaa020_Supplementary_Data.

GUID: 9C1C82C7-9CA4-4D6E-83E6-59A44C7915D7

Заявление о доступности данных: Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и mt- были депонированы в этом исследовании генов последовательностей генов b. под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MK636874-MK636884», «start_term»: «MK636874», «end_term»: «MK636884», «start_term_id» «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365828-MN365832 «,» start_term » : «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117», «end_term_id»: «1812622121»}} MN365828-MN365832 и {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.

Abstract

Эпизоотические патогены представляют серьезную угрозу для многих видов диких животных, особенно в контексте быстро меняющейся окружающей среды. Панголины (отряд Pholidota) — млекопитающие, находящиеся под большой угрозой, в значительной степени из-за незаконной торговли дикими животными и растениями. В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера (три Manis javanica и один Manis pentadactyla ) с различными клиническими симптомами были спасены станцией защиты дикой природы Цзиньхуа в провинции Чжэцзян, Китай.Хотя трое из этих животных погибли, к счастью, одно выздоровело после 2 недель симптоматического лечения. Используя мета-транскриптомику в сочетании с полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), мы идентифицировали два новых РНК-вируса у двух мертвых ящеров. Геномный анализ показал, что эти вирусы были наиболее близки к пестивирусам и колтивирусам, хотя все еще генетически отличны друг от друга, с расхождением последовательностей более чем на 48 и 25 процентов на аминокислотном уровне, соответственно.Мы назвали эти вирус панголина Дунъян (DYPV) и вирус панголина Лишуй (LSPV) на основе места отбора проб и хозяев. Хотя известно, что колвивирусы (LSPV) передаются клещами, мы не обнаружили доказательств LSPV у клещей, взятых близко к месту сбора панголинов. Кроме того, хотя DYPV присутствовал в личинках клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у больных панголинов, они не были обнаружены в местной популяции клещей. Эпидемиологическое расследование показало, что оба новых вируса могли быть импортированы в результате незаконной международной торговли панголинами.Следовательно, эти данные указывают на то, что незаконный оборот дикой природы не только угрожает статусу популяций панголинов, но также может распространять эпизоотические патогены.

Ключевые слова: Ящеры, смертельная болезнь, пестивирус, колвирус, незаконная торговля дикими животными

1. Введение

Ящеры, также известные как чешуйчатые муравьеды (семейство: Manidae, отряд: Pholidota), уникальны среди млекопитающих из-за их перекрывающиеся чешуйки (сделанные из кератина) и имеют географическое распространение, которое включает части Азии и Африки (Gaudin et al.2009 г.). Во всем мире обитает всего восемь видов панголинов, четыре — в Азии, включая Китай, и четыре — в Африке. Растет интерес к благополучию панголинов, включая угрозы, связанные с браконьерством и вырубкой лесов в их естественной среде обитания (Hua et al. 2015). Самое главное, что панголины стали неудачными символами международной и внутренней незаконной торговли дикими животными и растениями, а также являются наиболее продаваемыми млекопитающими (Gaubert et al. 2018). Из восьми видов четыре занесены в список уязвимых, два находятся под угрозой исчезновения, а оставшиеся два находятся под угрозой исчезновения в Красном списке видов, находящихся под угрозой исчезновения Международного союза охраны природы (du Toit et al.2017).

Пестивирусы (семейство: Flaviviridae ) представляют собой оболочечные РНК-вирусы с сильно вариабельными одноцепочечными геномами положительно-смысловой РНК размером ~ 12,3 т.п.н., которые содержат одну большую открытую рамку считывания (ORF), кодирующую полипротеин из примерно 3900 аминокислот (аминокислотные остатки). ) по длине (Постел и др., 2015; Таутц и др., 2015). Некоторые пестивирусы (например, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус пограничной болезни, вирус классической чумы свиней) являются хорошо известными патогенами животных, вызывающими тяжелые заболевания, включая контагиозное геморрагическое заболевание у свиней и респираторное и репродуктивное заболевание крупного рогатого скота и овец (Vilcek and Nettleton 2006; Valdazo). -Gonzalez et al.2007; Менниг и Бехер 2015). Сообщалось также о заболеваниях диких животных (например, кабанов и оленей), вызываемых пестивирусами (Ridpath et al., 2008; Blome et al., 2017). После применения молекулярных и геномных методов обнаружения вирусов в последние годы был идентифицирован ряд новых пестивирусов, в том числе от летучих мышей, грызунов и морских свиней (Wu et al. 2012; Firth et al. 2014; Smith et al. 2017; Джо и др., 2019). Наконец, пестивирусоподобные вирусы также идентифицированы у членистоногих (Shi et al.2016a) и членистоногих, собранных у млекопитающих (Harvey et al. 2018). Вместе эти данные подчеркивают циркуляцию разнообразного диапазона пестивирусов в широком диапазоне животных-хозяев.

Колвирусы (род: Coltivirus , семейство: Reoviridae ) представляют собой двухцепочечные сегментированные РНК-вирусы. В настоящее время в этот род определены только два вируса: вирус колорадской клещевой лихорадки (CTFV), обнаруженный в Северной Америке, и вирус Eyach (EYAV) из Европы. Их геном РНК состоит из двенадцати сегментов.Оба вируса могут вызывать тяжелые заболевания у людей (Attoui et al. 2005; Moutailler et al. 2016) и передаются клещами (Attoui et al. 2002). Недавно было охарактеризовано несколько новых колтивирусов, в том числе вирус клещей Тарумизу от клещей Haemaphysalis flava в Японии (Fujita et al.2017), вирус Кундала от клещей Hyalomma anatolicum в Индии (Yadav et al.2019), вирус Шелли-Хедленд. (SHLV) от клещей Ixodes holocyclus в Австралии (Harvey et al.2018) и реовирус Тайского леса (TFRV) от летучих мышей со свободным хвостом ( Chaereophon aloysiisabaudiae ) в Кот-д’Ивуаре (Weiss et al., 2017). Следовательно, очевидно, что в природе существует большое разнообразие колтивирусов, и, вероятно, будет идентифицировано гораздо больше. Однако на сегодняшний день неизвестно, связаны ли колвирусы с болезнями диких животных.

Здесь мы выполнили мета-транскриптомный (то есть полное секвенирование РНК) анализ четырех больных панголинов, спасенных станцией защиты дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян в Китае в 2018 году.От этих животных мы идентифицировали и охарактеризовали новые вирусные агенты — пестивирус и колтивирус — от двух ящеров. Кроме того, мы проанализировали клинические особенности и патологические изменения, связанные с заболеванием у этих животных.

2. Материалы и методы

2.1 Больные ящеры и сбор образцов

В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). На станции эти панголины прошли лабораторное и клиническое обследование с последующим лечением.Хотя трое животных погибли, одно выздоровело через 2 недели лечения. Образцы крови и тканей были собраны у всех четырех животных, а клещи были собраны у двух (дополнительная таблица S1). Первоначально ящеры и клещи были идентифицированы до уровня видов опытными полевыми биологами, а затем подтверждены анализом последовательностей гена митохондриального цитохрома b (mt- cyt b) или митохондриального гена 16S рДНК, как описано ранее (Chen et al.2012; Guo и др., 2013).

Места отбора проб (красные кружки) больных ящеров из провинции Чжэцзян, Китай.

Это исследование было рассмотрено и одобрено этическим комитетом Национального института контроля и профилактики инфекционных заболеваний Китайского центра контроля и профилактики заболеваний (CDC). Все процедуры вскрытия и взятия проб строго соответствовали руководству по использованию и уходу за лабораторными животными Китайского центра контроля заболеваний (SYXK (Jing) 2017-0021).

2.2 Построение библиотеки РНК, секвенирование и анализ данных

Общая РНК была извлечена из образцов крови, тканей органов и фекалий, а также из клещей с использованием Nucleo Spin RNA Blood (MN, Düren, Германия), RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) и TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) соответственно, следуя инструкциям производителя.ДНК экстрагировали с помощью набора DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Для конструирования библиотеки РНК аликвоты раствора РНК объединяли в равных количествах (дополнительная таблица S2). Набор SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 (TaKaRa, Далянь, Китай) и набор KAPA RNA HyperPrep с RiboErase (HMR; KAPA, Уилмингтон, Массачусетс, США) использовали для создания библиотек РНК из образцов крови, тканей органов и фекалий. соответственно. Рибосомную (r) РНК удаляли с использованием набора Ribo-Zero-Gold (HMR) (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).Секвенирование парных концов (150 п.н.) каждой библиотеки РНК проводили на платформе HiSeqX10 (Illumina).

Биоинформатический анализ считываний секвенирования был проведен, как описано ранее (Shi et al. 2016a). Вкратце, считывания секвенирования с фильтрацией адаптера и качеством были собраны de novo с использованием программы Trinity (версия 2.5.1). Вирусные контиги были идентифицированы путем сравнения (с использованием blastn и Diamond blastx) с базой данных неизбыточных нуклеотидов (nt) и белков (nr) NCBI со значениями e- , установленными на 1 × 10 ^— ¹⁰ и 1 × 10 ^— ⁴ соответственно.Вероятно контаминирующие вирусные последовательности были исключены из мета-транскриптомных данных (дополнительная таблица S2) с использованием методов, описанных ранее (Asplund et al.2019). Кроме того, была исключена высокая частота последовательностей ретровирусов, поскольку большинство из них, вероятно, были генами хозяина, а некоторые из них могли загрязнять вирусные последовательности, такие как последовательности альфаретровирусов и гаммаретровирусов, вероятно, связанные с лабораторными компонентами (Asplund et al., 2019 ). Наконец, предполагаемые вирусы, присутствующие в образцах крови, печени, селезенки, легких и почек, были подтверждены с помощью ПЦР.Количество транскриптов, сопоставленных с каждым вирусным контигом, определяли с помощью программы RSEM (Li et al. 2010), реализованной в Trinity.

2.3 ПЦР и секвенирование

Суммарную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР (TaKaRa). Вирусная РНК у клещей была обнаружена с помощью вложенной ПЦР, нацеленной на консервативные области гена РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) как пестивируса, так и колтивируса. Для восстановления полных вирусных геномов были сконструированы праймеры на основе собранных контигов пестивируса и колвируса, полученных с помощью мета-транскриптомики (дополнительная таблица S3).Концы генома определяли с помощью наборов 5ʹ / 3ʹ RACE (TaKaRa).

Набор для экстракции геля QIAquick (Qiagen) использовали для очистки продуктов ПЦР перед секвенированием. Очищенную ДНК длиной <700 п.н. секвенировали напрямую, а ДНК длиной более 700 п.н. сначала клонировали в вектор pMD18-T (TaKaRa), а затем трансформировали в компетентные клетки JM109-143. Для каждого образца было отобрано не менее трех клонов для секвенирования.

2.4 Филогенетический анализ

Вирусные последовательности были выровнены с использованием алгоритма E-INS-i, реализованного в MAFFT версии 7 (Katoh and Standley 2013).Затем неоднозначно выровненные области удаляли с помощью программы TrimAl (Capella-Gutierrez et al. 2009). Модель наилучшего соответствия (LG + Γ) эволюции последовательности аминокислот была оценена с использованием MEGA версии 7.0 (Kumar et al., 2016). Затем филогенетические деревья оценивались с использованием метода максимального правдоподобия (ML), реализованного в PhyML версии 3.0 (Guindon et al. 2010) со значениями поддержки бутстрапа, рассчитанными на основе 1000 повторяющихся деревьев. Значения начальной загрузки> 70% считались значимыми. Идентичность между последовательностями nt и aa рассчитывалась с помощью программы MegAlign, реализованной в программном пакете Lasergene v5.0 (ДНКстар).

3. Результаты

3.1 Болезнь и клинические особенности больных ящеров

В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). Для простоты они были названы здесь «1-Дунъян», «2-Лишуй», «3-Жуйан» и «4-Учэн» в зависимости от найденного местоположения. Морфологическое исследование и молекулярная идентификация показали, что эти панголины принадлежат к панголинам зонд, Manis javanica (1-Dongyang, 2-Lishui и 4-Wucheng) и китайскому панголину Manis pentadactyla (3-Ruian).Детали и клинические признаки этих ящеров описаны в. Все четыре панголина проявляли анорексию при отправке на спасательную станцию, а у 1-Дунъян и 2-Лишуй наблюдались подергивания и слюнки. Кровоизлияния и поражения кожи были очевидны у 1-Дунъян, тогда как у 2-Лишуй были обнаружены отеки на передних ногах. Наконец, панголин 4-Wucheng проявлял лихорадку и содержал кожные поражения, тогда как панголин 3-Ruian демонстрировал относительно легкие клинические признаки.

Таблица 1.

Справочная информация, клинические особенности и обследование спасенных ящеров.

Pangolin ID	Вид	Пол / возраст	Штат	Клинические особенности	Клинический осмотр
Pangolin ID	Вид	Пол / возраст	Штат	Клинические особенности	Рентген		Гематологический анализ

Гематологический анализ	М. Яваница	Мужчина / взрослый	Мертвый	Анорексия, подергивание, слюнотечение, кровоизлияние, ^a и поражения кожи ^b	Нормальный	PLT ↓, GLU ↓, холестерин ↓ и амилаза	↑	↑ Лишуй	М.Яваника	Женский / взрослый	Мертвый	Анорексия, подергивание, слюноотделение и отек ^c	Большая область тени на левом легком	АЛТ ↑, АСТ ↑, амилаза ↑ и общий билирубин ↑	3-Руян	M. pentadactyla	Самка / несовершеннолетняя	Живой	Анорексия, беспокойство и отек ^c	—	—
4-Wucheng	М.Яваника	Женский / взрослый	Мертвый	Анорексия, лихорадка и кожные поражения ^b	Камни в желудке	PLT ↓, ALP ↑, BUN ↑

Рентгенологические тесты показали большую площадь тень в левом легком панголина 2-Лишуй, указывающая на пневмонию (дополнительный рис. S1). Из-за отсутствия здоровых панголинов в качестве контроля в этом исследовании мы использовали биохимические показатели крови здоровых формозанских панголинов (Chin et al. 2015) в качестве эталона.1-Dongyang показал значительное снижение количества тромбоцитов, глюкозы и холестерина, тогда как 2-Lishui продемонстрировал значительное увеличение уровней аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и амилазы, но снижение общего билирубина. Кроме того, в 4-Wucheng (и в дополнительной таблице S4) наблюдались более низкое количество PLT и более высокие уровни щелочных фосфатаз и азота мочевины крови. Хотя этих панголинов тщательно реанимировали на спасательной станции, только панголин 3-Руян выздоровел.Панголины 1-Дунъян, 2-Лишуй и 4-Учэн умерли на 3, 16 и 5 дней после поступления соответственно.

3.2 Патологические изменения у мертвых ящеров

После вскрытия наблюдали застой в печени и легких панголина 1-Дунъян, хотя в других внутренних органах явных патологических изменений не наблюдалось. В соответствии с очевидной гиперемией, гистологические тесты выявили кровоизлияние в печень и легкие (дополнительный рисунок S2). Кроме того, наблюдались пикнотическое ядро печеночных клеток, пикноз лимфоцитов в селезенке, некроз печеночной пластинки и некроз клубочков.Наконец, дегенерация коллагеновых волокон наблюдалась в печени, селезенке и легких (дополнительный рис. S2).

Для панголина 2-Lishui, очевидный некроз наблюдался в легких, почках и селезенке, а застойные явления наблюдались в печени (дополнительный рис. S2) в дополнение к мезентериальной лимфаденопатии. Примечательно, что в обоих легких присутствовало много молочно-белых поражений, особенно в левой нижней доле (1 × 2 см). Гистологические тесты выявили некроз печени, селезенки, легких, почек, трахеи и тонкого кишечника, а также кровоизлияние в легкое (дополнительный рис.S2).

3.3 Идентификация вирусных агентов с помощью мета-транскриптомики и ПЦР

Для идентификации возможных этиологических агентов заболевания у четырех ящеров были созданы восемь мета-транскриптомных библиотек из образцов крови, печени, селезенки, легких, почек и фекалий. генерируя в общей сложности 306 908 179 считываний последовательностей с парными концами. Сборка De novo выявила высокую распространенность пестивирусного и колвирусоподобного вируса во всех мета-транскриптомных библиотеках панголина 1-Dongyang и 2-Lishui, что составляет 6–80 и 1–29 процентов от общего числа вирусных контигов. соответственно (дополнительная таблица S2).Примечательно, что, несмотря на присутствие других предполагаемых вирусов (дополнительная таблица S2), только пестивирусный и колвирусоподобный вирус можно было успешно идентифицировать с помощью ПЦР. Поскольку эти предполагаемые вирусные последовательности не могли быть подтверждены с помощью ПЦР и, вероятно, были результатом контаминации; следовательно, они не были возможными этиологическими агентами заболевания у четырех ящеров. Дополнительные анализы показали, что новый пестивирус присутствует только в 1-Dongyang, тогда как новый колтивирус присутствует только в 2-Lishui. В библиотеках, созданных из 1-Dongyang и 2-Lishui, не было обнаружено потенциальных бактериальных и грибковых патогенов.Наконец, не было обнаружено обильных вирусных, бактериальных и грибковых последовательностей в библиотеках, созданных из образцов крови и тканей 3-Ruian и 4-Wucheng (дополнительная таблица S2).

Генетический анализ показал, что новый пестивирус имел <57% сходства с известными пестивирусами, тогда как новый колвирус показал <68% сходства с известными колвирусами. Учитывая, что они родственны, но явно генетически отличаются от известных представителей Pestivirus и Coltivirus (см. Ниже), мы обозначили эти два недавно идентифицированных вируса как вирус панголина Dongyang (DYPV) и вирус панголина Lishui (LSPV), соответственно. , отражающие их виды-хозяева и географическое положение выборки.Попытки выделения вируса культурой клеток (BHK-21, Vero-E6 и DH82) и инокуляции мышей-сосунков оказались безуспешными.

Чтобы определить распределение вновь идентифицированных вирусов, каждый орган был протестирован с помощью ПЦР. Следовательно, DYPV был идентифицирован в сердце, печени, селезенке, легких, почках, головном мозге, крови, мазке из горла и фекалиях, взятых у панголина 1-Dongyang, а также у нимфных клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у этого животного. Интересно, что вирус не был идентифицирован у взрослых клещей, взятых также из 1-Dongyang.Аналогичным образом, LSPV также был идентифицирован в широком диапазоне тканевых органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки, кровь, мазок из горла и фекальные массы 2-Lishui.

3.4 Генетические особенности DYPV и LSPV

Для дальнейшей характеристики обоих вирусов были разработаны праймеры на основе последовательностей, полученных здесь, и последовательностей родственных вирусов, описанных ранее. Таким образом мы смогли восстановить полные геномы DYPV от 1-Dongyang и клещей ( A. javanense ), собранные от этого животного.Генетические особенности DYPV описаны в. Примечательно, что вирусы, полученные от ящеров и клещей, были тесно связаны друг с другом, хотя все же имели почти 2-процентное различие в последовательностях нуклеотидов. Кроме того, оба вируса были генетически и филогенетически отличными от известных вирусов рода Pestivirus , с отличиями> 43% nt и> 48% aa (дополнительная таблица S5). Как и в случае классических пестивирусов, геном DYPV кодирует двенадцать белков. Все известные сайты расщепления протеазы NS3 наблюдались в DYPV (дополнительный рис.S3). Кроме того, сайт расщепления NS4A-NS4B, расположенный в позиции L ₂₄₂₆ / A ₂₄₂₇ в BVDV1 и L ₂₃₃₆ / A ₂₃₃₇ в CSFV, появился в позиции L ₂₃₁₅ / K ₂₃₁₆ сайт. в DYPV (дополнительный рисунок S3).

Схема аннотированных геномов DYPV и LSPV. (а) Сравнение генома DYPV и известных пестивирусов. (b) Сравнение генома между LSPV и известными колтивирусами.

Примечательно, что, несмотря на использование как мета-транскриптомных методов, так и методов ПЦР, только девять сегментов генома (1–5 и 8–11) были получены от нового колвируса — у животного 2-Lishui — и наша попытка восстановить сегменты 6, 7 и 12 не удалось.Подробно генетические особенности LSPV описаны в. Все восстановленные сегменты имели консенсусные последовательности (GAG / AUU / A) на 5ʹ-конце и (G / CAGUC) и 3ʹ-конце () соответственно. Однако последовательности генома LSPV отличались от таковых у признанных колтивирусов, с сходством <75% (дополнительная таблица S6). Как и другие колвирусы, сегмент 9 LSPV также содержал две ORF. Однако последовательности, примыкающие к стоп-кодону UGA, которые являются сигналом считывания, отличались от известных колтивирусов.Примечательно, однако, что похожая картина наблюдалась у SHLV (), ближайшего родственника LSPV, который был взят от клещей в Австралии.

Характеристики генома LSPV. (а) Консервация последовательности 5ʹ- и 3ʹ-концевых 10 нт в геномных сегментах генома LSPV была проанализирована и визуализирована с помощью Weblogo. (b) Информация о последовательности вокруг стоп-кодона сегмента VP9 LSPV и известного колвируса.

3.4 Филогенетические отношения вновь идентифицированных вирусов

Чтобы определить эволюционные отношения между вновь идентифицированными и ранее признанными вирусами, мы оценили филогенетические деревья ML на основе последовательностей aa ().

деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей (полипротеина) и генов NS3 DYPV и других известных пестивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.

В филогении, основанном на последовательностях аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей и генов NS3, DYPV сформировал четко различимый клон, подтверждая, что он представляет собой новый пестивирус.Примечательно, что линия DYPV занимала базовое положение внутри линии парнокопытных, при этом пестивирусы, присутствующие у грызунов и летучих мышей, образуют более расходящиеся линии. В филогенезе, основанном на аминокислотных последовательностях гена RdRp и предполагаемого гена метилтрансферазы РНК (VP2;), LSPV также образовали отдельную линию в пределах рода Coltivirus . Интересно, однако, что вирус был наиболее тесно связан с мысом Шелли, идентифицированным у клещей ( I. holocyclus ), взятых у длинноносого бандикут (сумчатое животное) в Австралии (Harvey et al.2018).

деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей генов RdRp и предполагаемых генов РНК-метилтрансферазы (VP2) LSPV и других известных колтивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.

3.5 Филогенетический анализ последовательностей панголинов

Зондский панголин ( M. javanica ) географически широко распространен в Юго-Восточной Азии, включая Индонезию (Ява, Суматра, Борнео и Малые Зондские острова), Малайзию, Сингапур и др. Филиппины, Таиланд, Вьетнам, Лаос и Камбоджа (Zhang et al.2015), тогда как китайские панголины ( M. pentadactyla ) относительно обычны в Южном Китае (Choo et al. 2016). Чтобы определить вероятное географическое происхождение этих больных ящеров, последовательности гена mt- cyt b были амплифицированы из их тканей. Генетический анализ показал, что все последовательности, полученные от зондских ящеров в этом исследовании, попали в группу M. javanica , в то время как китайские ящеры сгруппированы с последовательностями M. pentadactyla . Примечательно, что три отобранных здесь зондских панголина были очень близки к панголинам из Индонезии, Малайзии, Таиланда и Сингапура — 99.9, 99,7 и 99,9% идентичности последовательностей нуклеотидов соответственно, что указывает на то, что они, скорее всего, были (незаконно) импортированы в Китай из-за границы. Напротив, панголин 3-Ruian ( M. pentadactyla ) сгруппировался вместе с панголином из Тайваня / Китая с идентичностью последовательностей на 99,1%, что позволяет предположить, что это животное не было импортировано. Поскольку последовательности, относящиеся к митохондриальной 16S рДНК A. javanense , не были доступны, мы не смогли определить происхождение клещей A. javanense , собранных у больных зондских ящеров.Следовательно, следует рассмотреть системные усилия по созданию всеобъемлющих баз данных для определения видов членистоногих-переносчиков и в качестве инструмента для определения географического происхождения собранных членистоногих.

3.6 Молекулярное исследование DYPV и LSPV у местных клещей

Поскольку DYPV был идентифицирован у клещей ( A. javanense ), собранных у панголина 1-Dongyang, и LSPV был тесно связан с SHLV, также идентифицированным у клещей ( I . holocyclus ) из Австралии, мы собирали клещей в местах, где были обнаружены больные ящеры.Следовательно, было собрано 452 клеща, представляющих 7 видов, в том числе 220 Haemaphysalis hystricis , 147 Rhipicephalus microplus , 49 Haemaphysalis longicornis , 11 Ixodes granulatus , 11 Ranguicephalus Haemaphysalis mageshimaensis . К сожалению, ни DYPV, ни LSPV не были идентифицированы у этих клещей с помощью мета-транскриптомики и вложенной ОТ-ПЦР.

4.Обсуждение

Ящеры насекомоядны, ведут преимущественно ночной образ жизни и питаются почти исключительно муравьями и термитами, с сильным предпочтением определенных видов насекомых (Lin et al. 2015; Choo et al. 2016). Восемь видов ящеров обитают в Африке и Азии, утрата среды обитания и изменения в их среде обитания серьезно сказываются на статусе их популяции. Что наиболее важно, на панголинов сильно повлияла незаконная международная и внутренняя торговля дикими животными и растениями для традиционной медицины или мяса (Zhang et al.2015). Следовательно, панголины занесены в Красный список исчезающих видов МСОП как уязвимые, находящиеся под угрозой исчезновения или находящиеся в критическом состоянии (du Toit et al., 2017). Примечательно, что панголинам также могут угрожать эпизоотические патогены, присутствующие либо в их первоначальной среде обитания, либо в новой среде после перемещения. Действительно, перемещение или торговля домашними и дикими животными играет важную роль в распространении многих эпизоотических патогенов (Lin et al. 2012; Kosmider et al. 2013; Peeler et al.2015).

В этом исследовании было обнаружено, что четыре панголина — три M. javanica , вероятно, из Индонезии, Малайзии и Таиланда, и один M. pentadactyla , вероятно местного происхождения, — страдали болезнью и были отправлены в местную спасательную станцию. для лечения. К сожалению, трое животных погибли, а одно выздоровело. На сегодняшний день сообщения о болезни панголина редки и в основном ограничиваются болезнями, вызываемыми бактериями и паразитами (Mohapatra et al., 2016; Jabin et al., 2019). Нет доступной литературы по вирусным инфекциям панголинов до недавнего выявления вируса парагриппа 5, вируса Сендай и коронавируса зондских панголинов в Китае (Liu et al.2019; Wang et al. 2019). Используя комбинацию мета-транскриптомных и ПЦР-методов, мы идентифицировали два новых РНК-вируса — пестивирус и колвирус — у двух мертвых ящеров. Судя по клиническим признакам (), все четыре панголина страдали инфекционным заболеванием. Однако, поскольку у этих животных не было получено полных клинических данных и лабораторных параметров, мы не могли четко определить заболевание, которым они страдали.

Пестивирусы — хорошо известные патогены животных, которые наносят значительный экономический ущерб, заражая как домашних (например,грамм. свиньи, крупный рогатый скот, овцы и козы) и диких (например, кабанов и жвачных) животных (Vilcek and Nettleton 2006). Пестивирусные инфекции могут быть субклиническими или вызывать ряд клинических признаков, включая острую диарею, острый геморрагический синдром, острое смертельное заболевание, а также болезнь истощения. Здесь новый пестивирус, обозначенный как DYPV, был идентифицирован во многих органах одного из больных ящеров [1-Dongyang ( M. javanica )], который имел явные патологические изменения. Филогенетический анализ показывает, что он представляет нового представителя рода Pestivirus .Хотя требуются более подробные подтверждающие результаты, эти данные предполагают, что DYPV-подобные пестивирусы могут быть ответственны за геморрагическое заболевание, наблюдаемое у ящеров.

На сегодняшний день принято считать, что позвоночные животные, а не беспозвоночные, являются основными хозяевами пестивирусов (Smith et al. 2017). Однако недавно у клещей был обнаружен новый пестивирус, названный вирусом Fairfax Lookout ( Ixodes trichosuri ). Однако, учитывая его филогенетическое положение рядом с пестивирусами млекопитающих, а также его чрезвычайно низкую численность, было высказано предположение, что вирус был связан с позвоночным хозяином, а не с самим клещом (Harvey et al.2018). В этом исследовании DYPV был идентифицирован не только у ящеров, но и у нимфных клещей, собранных у ящеров. Однако DYPV не был обнаружен у взрослых клещей, взятых также у панголина 1-Dongyang. Интересно, что хотя DYPV от клещей был тесно связан с образцом, взятым от панголинов, в вирусном геноме имелось около 2% различий нуклеотидов, что позволяет предположить, что они разделены несколькими событиями передачи. Филогенетический анализ показал, что панголины Sunda, включая панголина 1-Dongyang, скорее всего, были импортированы в Китай из Индонезии, Малайзии и Филиппин ().Кроме того, клещей A. javanense не были обнаружены в провинции Чжэцзян (Chen et al. 2010), DYPV не был идентифицирован у местных собранных клещей, и мы не наблюдали этот вирус в предыдущих крупномасштабных исследованиях выборки клещей (Li et al. 2015; Ши и др., 2016a, b, 2018). В совокупности эти наблюдения предполагают, что вирус, вероятно, был завезен из-за границы с ящерами, незаконно проданными.

ML-дерево на основе последовательностей нуклеотидов гена mt- cyt b четырех панголинов и других известных панголинов.Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значимыми и отображались на деревьях.

Колвирусы — хорошо известные клещевые патогены, которые могут вызывать болезни человека. Например, CTFV вызывает легкое лихорадочное заболевание или более тяжелое заболевание, включая инфекцию центральной нервной системы и / или геморрагическую лихорадку (Goodpasture et al. 1978; Attoui et al. 2005). Кроме того, инфекции EYAV были связаны с неврологическими заболеваниями человека (Moutailler et al.2016). Примечательно, что хотя некоторые колвирусы (например, CTFV, EYAV, TFRV) были обнаружены в дикой природе (например, летучие мыши и грызуны), нет четких доказательств того, что эти вирусы могут вызывать заболевания у животных (Moutailler et al.2016; Weiss et al. 2017; Уильямсон и др., 2019). В этом исследовании новый колвирус, названный LSPV, был идентифицирован у одного из больных ящеров [2-Lishui ( M. javanica )]. Учитывая высокое содержание LSPV в мета-транскриптомных данных в сочетании с клиническими признаками и патологическими изменениями, появившимися у панголина (2-Lishui), а также обнаружение LSPV в нескольких органах, наши данные позволяют предположить, что LSPV, возможно, вызвала системная инфекция и гибель рассматриваемого панголина, хотя это необходимо будет подтвердить дополнительными данными.

Принято считать, что геном колвируса состоит из двенадцати сегментов линейной двухцепочечной РНК (Fujita et al. 2017). Недавно у летучих мышей со свободным хвостом был обнаружен новый колвирус, лесной реовирус (TFRV) ( C. aloysiisabaudiae ; Weiss et al.2017). Интересно, что в геноме вируса отсутствуют сегменты 6, 7 и 12, и было высказано предположение, что эти отсутствующие сегменты не были идентифицированы, вероятно, из-за низкого сходства между TFRV и известными колтивирусами (Weiss et al.2017). Поразительно, как и в случае с TFRV, мы не смогли идентифицировать вирусные сегменты 6, 7 и 12 в LSPV, несмотря на использование методов, которые ранее позволили получить полный геном сильно дивергентного вируса клещей Jingmen (Qin et al. 2014). Следовательно, очевидно, что необходимы дополнительные исследования, чтобы сделать вывод, действительно ли эти сегменты отсутствуют в LSPV и TFRV. Наконец, поскольку панголин 2-Lishui мог быть импортирован из Индонезии (), возможно, что LSPV, как и DYPV, также был импортирован в Китай.

Наконец, несмотря на некоторую дискуссию о роли ящеров в возникновении нового коронавируса (тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2, SARS-CoV-2; Wahba et al.2020; Wong et al. 2020), являющейся причиной вспышки коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) (Wu et al.2020; Zhou et al.2020), мы не обнаружили коронавирусов у этих ящеров метатранскриптомными методами и методами ПЦР. Следовательно, необходимы дополнительные усилия, чтобы сделать вывод о роли ящеров в передаче SARS-CoV-2.

Доступность данных

Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и последовательности гена mt- cyt b, созданные в этом исследовании, депонированы в GenBank под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MK636874-MK636884 «,» start_term «:» MK636874 «,» end_term «:» MK636884 «,» start_term_id «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MN365828-MN365832», «start_term»: «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117 «,» end_term_id «:» 1812622121 «}} MN365828-MN365832 и {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81861138003, 31930001 и 81672057) и Специального национального проекта по изучению основных ресурсов Китая (2019ФГ) 101500. E.C.H. был профинансирован стипендией австралийского лауреата ARC (FL170100022).

Конфликт интересов: Нет конфликта интересов.

Дополнительные материалы

veaa020_Supplementary_Data

Ссылки

Асплунд М.и другие. (2019) «Загрязнение вирусных последовательностей при высокопроизводительном секвенировании вирусов: исследование связи 700 библиотек для секвенирования», Clinical Microbiology and Infection, 25: 1277–85. [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие. (2002) «Genus Coltivirus (Family Reoviridae ): Genomic and Morphologic Characterization of Old World and New World Viruses», Archives of Virology, 147: 533–61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие.(2005) «Колвирусы и сеадорнавирусы в Северной Америке, Европе и Азии», Новые инфекционные заболевания, 11: 1673–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Бломе С. и другие. (2017) «Классическая чума свиней — обновленный обзор», Вирусы, 9: 86. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Капелла-Гутьеррес С. и другие. (2009) «trimAl: Инструмент для автоматического выравнивания выравнивания в крупномасштабных филогенетических анализах», Bioinformatics, 25: 1972–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чен З.и другие. (2010) «Клещи (Acari: Ixodoidea: Argasidae, Ixodidae) из Китая», Experimental and Applied Acarology, 51: 393–404. [PubMed] [Google Scholar]
Чен З. и другие. (2012) «Морфологические, биологические и молекулярные характеристики бисексуальных и партеногенетических Haemaphysalis longicornis », Ветеринарная паразитология, 189: 344–52. [PubMed] [Google Scholar]
Чин С.С. и другие. (2015) «Гематологические и сывороточные биохимические параметры явно здоровых спасенных формозановых панголинов ( Manis pentadactyla pentadactyla )», Journal of Zoo and Wildlife Medicine, 46: 68–76.[PubMed] [Google Scholar]
Чу С. В. и другие. (2016) «Геномы панголинов и эволюция чешуек млекопитающих и иммунитет», Genome Research, 26: 1312–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
du Toit Z. и другие. (2017) «Митохондриальные геномы африканских панголинов и понимание эволюционных закономерностей и филогении семейства Manidae», BMC Genomics, 18: 746. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ферт К. и другие. (2014) «Обнаружение зоонозных патогенов и характеристика новых вирусов, переносимых Commensal Rattus norvegicus в Нью-Йорке», mBio, 5: e01933–01914.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Фуджита Р. и другие. (2017) «Выделение и характеристика вируса клещей Тарумизу: новый колвирус от клещей Haemaphysalis flava в Японии», Virus Research, 242: 131–40. [PubMed] [Google Scholar]
Гобер П. и другие. (2018) «Полная филогения панголинов: увеличение ресурсов для молекулярного отслеживания наиболее пострадавших млекопитающих на Земле», Journal of Heredity, 109: 347–59. [PubMed] [Google Scholar]
Годен Т.Дж. и другие. (2009) «Филогения живых и вымерших панголинов (Mammalia, Pholidota) и связанных таксонов: анализ на основе морфологии», Journal of Mammalian Evolution, 16: 235–305. [Google Scholar]
Goodpasture H.C. (1978) «Колорадская клещевая лихорадка: клинические, эпидемиологические и лабораторные аспекты 228 случаев заболевания в Колорадо в 1973–1974 годах», Annals of Internal Medicine, 88: 303–10. [PubMed] [Google Scholar]
Гиндон С. и другие. (2010) «Новые алгоритмы и методы оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0 ’, Систематическая биология, 59: 307–21. [PubMed] [Google Scholar]
Го В. П. и другие. (2013) «Филогения и происхождение хантавирусов, обитающих у летучих мышей, насекомоядных и грызунов», PLoS Pathogens, 9: e1003159. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Харви Э. и другие. (2018) «Обширное разнообразие РНК-вирусов у австралийских клещей», Журнал вирусологии, 93: e01358–18. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Хуа Л. и другие. (2015) «Разведение панголинов в неволе: текущее состояние, проблемы и перспективы на будущее», ZooKeys, 507: 99–114.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джабин Г. и другие. (2019) «Идентификация клеща Amblyomma javanense (Acari: Ixodidae) из китайского панголина: создание штрих-кода видов, филогенетический статус и его значение в судебной экспертизе дикой природы», Экспериментальная и прикладная акарология, 78: 461–7. [PubMed] [Google Scholar]
Джо В. К. и другие. (2019) «Эволюционно расходящийся пестивирус, лишенный гена N (Pro), системно заражает виды китов», Emerging Microbes & Infections, 8: 1383–92.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Като К., Стэндли Д. М. (2013) «Программное обеспечение для выравнивания множественных последовательностей MAFFT, версия 7: Улучшения в производительности и удобстве использования», Молекулярная биология и эволюция, 30: 772–80. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Космидер Р. и другие. (2013) « Echinococcus multilocularis Интродукция и распространение в дикой природе через импортированных бобров», Veterinary Record, 172: 606.2. [PubMed] [Google Scholar]
Кумар С.и другие. (2016) «MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets», Molecular Biology and Evolution, 33: 1870–4. [PubMed] [Google Scholar]
Ли Б. и другие. (2010) «Оценка экспрессии гена RNA-Seq с неопределенностью картирования считывания», Bioinformatics, 26: 493–500. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ли К. X. и другие. (2015) «Беспрецедентное геномное разнообразие РНК-вирусов у членистоногих выявляет происхождение РНК-вирусов с отрицательным смыслом», eLife, 4: e05378.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линь М. Ф. и другие. (2015) «Аспекты пищеварительной анатомии, потребления корма и пищеварения у китайского панголина ( Manis pentadactyla ) в зоопарке Тайбэя», Zoo Biology, 34: 262–70. [PubMed] [Google Scholar]
Лин Х. Д. и другие. (2012) «Миграция норвежских крыс привела к глобальному распространению сеульского хантавируса сегодня», Journal of Virology, 86: 972–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Лю П. и другие.(2019) «Вирусная метагеномика выявила вирус Сендай и коронавирусную инфекцию малайских панголинов ( Manis javanica )», Вирусы, 11: 979. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моенниг В., Бехер П. (2015) «Программы борьбы с пестивирусами: как далеко мы продвинулись и куда мы идем?», Обзоры исследований здоровья животных, 16: 83–7. [PubMed] [Google Scholar]
Мохапатра Р. К. и другие. (2016) «Контрольный список паразитов и бактерий, зарегистрированных у ящеров ( Manis sp.) ’, Journal of Parasitic Diseases, 40: 1109–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моутайлер С. и другие. (2016) «Разнообразие вирусов в Ixodes ricinus и характеристика нейротропного штамма вируса Eyach», Новые микробы и новые инфекции, 11: 71–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Пилер Э. Дж. и другие. (2015) «Анализ рисков импорта болезней животных — Обзор текущих методов и практики», Трансграничные и новые болезни, 62: 480–90.[PubMed] [Google Scholar]
Постель А. и другие. (2015) «Тесная связь пестивирусов жвачных животных и вируса классической чумы свиней», Emerging Infectious Diseases, 21: 668–72. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Цинь X. С. и другие. (2014) «Клещевой сегментированный РНК-вирус, содержащий сегменты генома, полученные от несегментированных вирусных предков», Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111: 6744–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ридпат Дж.Ф. и другие. (2008) «Заболевание репродуктивного тракта, связанное с инокуляцией беременных белохвостых оленей вирусом бычьей вирусной диареи», Американский журнал ветеринарных исследований, 69: 1630–6. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2016a) «Дивергентные вирусы, обнаруженные у членистоногих и позвоночных, пересматривают историю эволюции Flaviviridae и родственных вирусов», Journal of Virology, 90: 659–69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие.(2016b) «Новое определение виросферы РНК беспозвоночных», Nature, 540: 539–43. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2018) «Эволюционная история РНК-вирусов позвоночных», Nature, 556: 197–202. [PubMed] [Google Scholar]
Смит Д. Б. и другие. (2017) «Предлагаемый пересмотр таксономии рода Pestivirus , семейства Flaviviridae », Журнал общей вирусологии, 98: 2106–12. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Тауц Н. и другие.(2015) «Молекулярная биология пестивирусов», «Достижения в вирусных исследованиях», 93: 47–160. [PubMed] [Google Scholar]
Вальдазо-Гонсалес Б. и другие. (2007) «Генетическое и антигенное типирование изолятов вируса пограничных заболеваний у овец Пиренейского полуострова», Ветеринарный журнал, 174: 316–24. [PubMed] [Google Scholar]
Вилчек С., Нетлтон П. Ф. (2006) «Пестивирусы у диких животных», Ветеринарная микробиология, 116: 1–12. [PubMed] [Google Scholar]
Вахба Л. и другие. (2020) «Идентификация ниши панголина для коронавируса, подобного 2019-nCoV, с помощью обширного мета-метагеномного поиска», bioRxiv, doi: 10.1101 / 2020.02.08.939660. [Google Scholar]
Ван Х. и другие. (2019) «Полная последовательность генома вируса парагриппа 5 (PIV5) зондского панголина ( Manis Javanica ) в Китае», Journal of Wildlife Diseases, 55: 947–50. [PubMed] [Google Scholar]
Вайс С. и другие. (2017) «Новый связанный с колтивирусом вирус, выделенный из летучих мышей со свободным хвостом из Кот-д’Ивуара, способен инфицировать клетки человека in vitro», Virology Journal, 14: 181. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Уильямсон Б.Н. и другие. (2019) «Распространенность и штаммы вируса колорадской клещевой лихорадки у лесных клещей Скалистых гор в долине Биттеррут, штат Монтана», Трансмиссивные и зоонозные заболевания, 19: 694–702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Вонг М. и другие. (2020) «Доказательства рекомбинации коронавирусов, указывающие на происхождение nCoV-2019 у панголинов», bioRxiv , DOI: 10.1101 / 2020.02.07.939207.
Ву Ф. и другие. (2020) «Новый коронавирус, связанный с респираторным заболеванием человека в Китае», Nature, 579: 265–9.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
У З. и другие. (2012) «Анализ виромов для идентификации новых вирусов млекопитающих у видов летучих мышей из провинций Китая», Journal of Virology, 86: 10999–1012. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ядав П. Д. и другие. (2019) «Характеристика новых реовирусов Вируса Вад Медани (орбивирус) и вируса Кундала (колвирус), собранных из клещей Hyalomma anatolicum в Индии во время эпиднадзора за геморрагической лихорадкой Крымского Конго», Журнал вирусологии, 93: e00106–19.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чжан Х. и другие. (2015) «Молекулярное отслеживание конфискованных чешуек панголинов для сохранения и мониторинга незаконной торговли в Юго-Восточной Азии», Глобальная экология и сохранение, 4: 414–22. [Google Scholar]
Чжоу П. и другие. (2020) «Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом вероятного происхождения летучих мышей», Nature, 579: 270–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Недавно идентифицированные вирусные геномы у ящеров со смертельным исходом

Virus Evol.2020 Янв; 6 (1): veaa020.

, ^v1 , ^v2 , ^v1, ^v3 , ^v4, ^v1, ^v5, ^v4, 901 901 901 901 , ^v3
Wen-Hua Gao
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
Xian-Dan Lin
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
Ян-Мэй Чен
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
Chun-Gang Xie
^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай
Чжи-Чжоу Тан
^v1 Отдел зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
Цзя-Цзюнь Чжоу
^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай
Шуай Чен
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
Эдвард С. Холмс
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006, Австралия
Yong-Zhen Zhang
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай
^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай
^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006 год, Австралия
Вен-Хуа Гао, Сиань-Дан Линь и Ян-Мей Чен внесли равный вклад к этой работе.
Авторские права © Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/). 4.0 /), который разрешает некоммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь по адресу [email protected]. Эта статья цитируется в других статьях PMC.
Дополнительные материалы
veaa020_Supplementary_Data.
GUID: 9C1C82C7-9CA4-4D6E-83E6-59A44C7915D7
Заявление о доступности данных
Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и mt- были депонированы в этом исследовании генов последовательностей генов b. под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MK636874-MK636884», «start_term»: «MK636874», «end_term»: «MK636884», «start_term_id» «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365828-MN365832 «,» start_term » : «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117», «end_term_id»: «1812622121»}} MN365828-MN365832 и {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.
Abstract
Эпизоотические патогены представляют серьезную угрозу для многих видов диких животных, особенно в контексте быстро меняющейся окружающей среды. Панголины (отряд Pholidota) — млекопитающие, находящиеся под большой угрозой, в значительной степени из-за незаконной торговли дикими животными и растениями. В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера (три Manis javanica и один Manis pentadactyla ) с различными клиническими симптомами были спасены станцией защиты дикой природы Цзиньхуа в провинции Чжэцзян, Китай.Хотя трое из этих животных погибли, к счастью, одно выздоровело после 2 недель симптоматического лечения. Используя мета-транскриптомику в сочетании с полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), мы идентифицировали два новых РНК-вируса у двух мертвых ящеров. Геномный анализ показал, что эти вирусы были наиболее близки к пестивирусам и колтивирусам, хотя все еще генетически отличны друг от друга, с расхождением последовательностей более чем на 48 и 25 процентов на аминокислотном уровне, соответственно.Мы назвали эти вирус панголина Дунъян (DYPV) и вирус панголина Лишуй (LSPV) на основе места отбора проб и хозяев. Хотя известно, что колвивирусы (LSPV) передаются клещами, мы не обнаружили доказательств LSPV у клещей, взятых близко к месту сбора панголинов. Кроме того, хотя DYPV присутствовал в личинках клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у больных панголинов, они не были обнаружены в местной популяции клещей. Эпидемиологическое расследование показало, что оба новых вируса могли быть импортированы в результате незаконной международной торговли панголинами.Следовательно, эти данные указывают на то, что незаконный оборот дикой природы не только угрожает статусу популяций панголинов, но также может распространять эпизоотические патогены.
Ключевые слова: Ящеры, смертельная болезнь, пестивирус, колвирус, незаконная торговля дикими животными
1. Введение
Ящеры, также известные как чешуйчатые муравьеды (семейство: Manidae, отряд: Pholidota), уникальны среди млекопитающих из-за их перекрывающиеся чешуйки (сделанные из кератина) и имеют географическое распространение, которое включает части Азии и Африки (Gaudin et al.2009 г.). Во всем мире обитает всего восемь видов панголинов, четыре — в Азии, включая Китай, и четыре — в Африке. Растет интерес к благополучию панголинов, включая угрозы, связанные с браконьерством и вырубкой лесов в их естественной среде обитания (Hua et al. 2015). Самое главное, что панголины стали неудачными символами международной и внутренней незаконной торговли дикими животными и растениями, а также являются наиболее продаваемыми млекопитающими (Gaubert et al. 2018). Из восьми видов четыре занесены в список уязвимых, два находятся под угрозой исчезновения, а оставшиеся два находятся под угрозой исчезновения в Красном списке видов, находящихся под угрозой исчезновения Международного союза охраны природы (du Toit et al.2017).
Пестивирусы (семейство: Flaviviridae ) представляют собой оболочечные РНК-вирусы с сильно вариабельными одноцепочечными геномами положительно-смысловой РНК размером ~ 12,3 т.п.н., которые содержат одну большую открытую рамку считывания (ORF), кодирующую полипротеин из примерно 3900 аминокислот (аминокислотные остатки). ) по длине (Постел и др., 2015; Таутц и др., 2015). Некоторые пестивирусы (например, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус пограничной болезни, вирус классической чумы свиней) являются хорошо известными патогенами животных, вызывающими тяжелые заболевания, включая контагиозное геморрагическое заболевание у свиней и респираторное и репродуктивное заболевание крупного рогатого скота и овец (Vilcek and Nettleton 2006; Valdazo). -Gonzalez et al.2007; Менниг и Бехер 2015). Сообщалось также о заболеваниях диких животных (например, кабанов и оленей), вызываемых пестивирусами (Ridpath et al., 2008; Blome et al., 2017). После применения молекулярных и геномных методов обнаружения вирусов в последние годы был идентифицирован ряд новых пестивирусов, в том числе от летучих мышей, грызунов и морских свиней (Wu et al. 2012; Firth et al. 2014; Smith et al. 2017; Джо и др., 2019). Наконец, пестивирусоподобные вирусы также идентифицированы у членистоногих (Shi et al.2016a) и членистоногих, собранных у млекопитающих (Harvey et al. 2018). Вместе эти данные подчеркивают циркуляцию разнообразного диапазона пестивирусов в широком диапазоне животных-хозяев.
Колвирусы (род: Coltivirus , семейство: Reoviridae ) представляют собой двухцепочечные сегментированные РНК-вирусы. В настоящее время в этот род определены только два вируса: вирус колорадской клещевой лихорадки (CTFV), обнаруженный в Северной Америке, и вирус Eyach (EYAV) из Европы. Их геном РНК состоит из двенадцати сегментов.Оба вируса могут вызывать тяжелые заболевания у людей (Attoui et al. 2005; Moutailler et al. 2016) и передаются клещами (Attoui et al. 2002). Недавно было охарактеризовано несколько новых колтивирусов, в том числе вирус клещей Тарумизу от клещей Haemaphysalis flava в Японии (Fujita et al.2017), вирус Кундала от клещей Hyalomma anatolicum в Индии (Yadav et al.2019), вирус Шелли-Хедленд. (SHLV) от клещей Ixodes holocyclus в Австралии (Harvey et al.2018) и реовирус Тайского леса (TFRV) от летучих мышей со свободным хвостом ( Chaereophon aloysiisabaudiae ) в Кот-д’Ивуаре (Weiss et al., 2017). Следовательно, очевидно, что в природе существует большое разнообразие колтивирусов, и, вероятно, будет идентифицировано гораздо больше. Однако на сегодняшний день неизвестно, связаны ли колвирусы с болезнями диких животных.
Здесь мы выполнили мета-транскриптомный (то есть полное секвенирование РНК) анализ четырех больных панголинов, спасенных станцией защиты дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян в Китае в 2018 году.От этих животных мы идентифицировали и охарактеризовали новые вирусные агенты — пестивирус и колтивирус — от двух ящеров. Кроме того, мы проанализировали клинические особенности и патологические изменения, связанные с заболеванием у этих животных.
2. Материалы и методы
2.1 Больные ящеры и сбор образцов
В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). На станции эти панголины прошли лабораторное и клиническое обследование с последующим лечением.Хотя трое животных погибли, одно выздоровело через 2 недели лечения. Образцы крови и тканей были собраны у всех четырех животных, а клещи были собраны у двух (дополнительная таблица S1). Первоначально ящеры и клещи были идентифицированы до уровня видов опытными полевыми биологами, а затем подтверждены анализом последовательностей гена митохондриального цитохрома b (mt- cyt b) или митохондриального гена 16S рДНК, как описано ранее (Chen et al.2012; Guo и др., 2013).
Места отбора проб (красные кружки) больных ящеров из провинции Чжэцзян, Китай.
Это исследование было рассмотрено и одобрено этическим комитетом Национального института контроля и профилактики инфекционных заболеваний Китайского центра контроля и профилактики заболеваний (CDC). Все процедуры вскрытия и взятия проб строго соответствовали руководству по использованию и уходу за лабораторными животными Китайского центра контроля заболеваний (SYXK (Jing) 2017-0021).
2.2 Построение библиотеки РНК, секвенирование и анализ данных
Общая РНК была извлечена из образцов крови, тканей органов и фекалий, а также из клещей с использованием Nucleo Spin RNA Blood (MN, Düren, Германия), RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) и TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) соответственно, следуя инструкциям производителя.ДНК экстрагировали с помощью набора DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Для конструирования библиотеки РНК аликвоты раствора РНК объединяли в равных количествах (дополнительная таблица S2). Набор SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 (TaKaRa, Далянь, Китай) и набор KAPA RNA HyperPrep с RiboErase (HMR; KAPA, Уилмингтон, Массачусетс, США) использовали для создания библиотек РНК из образцов крови, тканей органов и фекалий. соответственно. Рибосомную (r) РНК удаляли с использованием набора Ribo-Zero-Gold (HMR) (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).Секвенирование парных концов (150 п.н.) каждой библиотеки РНК проводили на платформе HiSeqX10 (Illumina).
Биоинформатический анализ считываний секвенирования был проведен, как описано ранее (Shi et al. 2016a). Вкратце, считывания секвенирования с фильтрацией адаптера и качеством были собраны de novo с использованием программы Trinity (версия 2.5.1). Вирусные контиги были идентифицированы путем сравнения (с использованием blastn и Diamond blastx) с базой данных неизбыточных нуклеотидов (nt) и белков (nr) NCBI со значениями e- , установленными на 1 × 10 ^— ¹⁰ и 1 × 10 ^— ⁴ соответственно.Вероятно контаминирующие вирусные последовательности были исключены из мета-транскриптомных данных (дополнительная таблица S2) с использованием методов, описанных ранее (Asplund et al.2019). Кроме того, была исключена высокая частота последовательностей ретровирусов, поскольку большинство из них, вероятно, были генами хозяина, а некоторые из них могли загрязнять вирусные последовательности, такие как последовательности альфаретровирусов и гаммаретровирусов, вероятно, связанные с лабораторными компонентами (Asplund et al., 2019 ). Наконец, предполагаемые вирусы, присутствующие в образцах крови, печени, селезенки, легких и почек, были подтверждены с помощью ПЦР.Количество транскриптов, сопоставленных с каждым вирусным контигом, определяли с помощью программы RSEM (Li et al. 2010), реализованной в Trinity.
2.3 ПЦР и секвенирование
Суммарную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР (TaKaRa). Вирусная РНК у клещей была обнаружена с помощью вложенной ПЦР, нацеленной на консервативные области гена РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) как пестивируса, так и колтивируса. Для восстановления полных вирусных геномов были сконструированы праймеры на основе собранных контигов пестивируса и колвируса, полученных с помощью мета-транскриптомики (дополнительная таблица S3).Концы генома определяли с помощью наборов 5ʹ / 3ʹ RACE (TaKaRa).
Набор для экстракции геля QIAquick (Qiagen) использовали для очистки продуктов ПЦР перед секвенированием. Очищенную ДНК длиной <700 п.н. секвенировали напрямую, а ДНК длиной более 700 п.н. сначала клонировали в вектор pMD18-T (TaKaRa), а затем трансформировали в компетентные клетки JM109-143. Для каждого образца было отобрано не менее трех клонов для секвенирования.
2.4 Филогенетический анализ
Вирусные последовательности были выровнены с использованием алгоритма E-INS-i, реализованного в MAFFT версии 7 (Katoh and Standley 2013).Затем неоднозначно выровненные области удаляли с помощью программы TrimAl (Capella-Gutierrez et al. 2009). Модель наилучшего соответствия (LG + Γ) эволюции последовательности аминокислот была оценена с использованием MEGA версии 7.0 (Kumar et al., 2016). Затем филогенетические деревья оценивались с использованием метода максимального правдоподобия (ML), реализованного в PhyML версии 3.0 (Guindon et al. 2010) со значениями поддержки бутстрапа, рассчитанными на основе 1000 повторяющихся деревьев. Значения начальной загрузки> 70% считались значимыми. Идентичность между последовательностями nt и aa рассчитывалась с помощью программы MegAlign, реализованной в программном пакете Lasergene v5.0 (ДНКстар).
3. Результаты
3.1 Болезнь и клинические особенности больных ящеров
В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). Для простоты они были названы здесь «1-Дунъян», «2-Лишуй», «3-Жуйан» и «4-Учэн» в зависимости от найденного местоположения. Морфологическое исследование и молекулярная идентификация показали, что эти панголины принадлежат к панголинам зонд, Manis javanica (1-Dongyang, 2-Lishui и 4-Wucheng) и китайскому панголину Manis pentadactyla (3-Ruian).Детали и клинические признаки этих ящеров описаны в. Все четыре панголина проявляли анорексию при отправке на спасательную станцию, а у 1-Дунъян и 2-Лишуй наблюдались подергивания и слюнки. Кровоизлияния и поражения кожи были очевидны у 1-Дунъян, тогда как у 2-Лишуй были обнаружены отеки на передних ногах. Наконец, панголин 4-Wucheng проявлял лихорадку и содержал кожные поражения, тогда как панголин 3-Ruian демонстрировал относительно легкие клинические признаки.
Таблица 1.
Справочная информация, клинические особенности и обследование спасенных ящеров.
Pangolin ID Вид Пол / возраст Штат Клинические особенности Клинический осмотр
Рентген Гематологический анализ
Гематологический анализ М. Яваница Мужчина / взрослый Мертвый Анорексия, подергивание, слюнотечение, кровоизлияние, ^a и поражения кожи ^b Нормальный PLT ↓, GLU ↓, холестерин ↓ и амилаза ↑ ↑ Лишуй М.Яваника Женский / взрослый Мертвый Анорексия, подергивание, слюноотделение и отек ^c Большая область тени на левом легком АЛТ ↑, АСТ ↑, амилаза ↑ и общий билирубин ↑ 3-Руян M. pentadactyla Самка / несовершеннолетняя Живой Анорексия, беспокойство и отек ^c — —
4-Wucheng М.Яваника Женский / взрослый Мертвый Анорексия, лихорадка и кожные поражения ^b Камни в желудке PLT ↓, ALP ↑, BUN ↑
Рентгенологические тесты показали большую площадь тень в левом легком панголина 2-Лишуй, указывающая на пневмонию (дополнительный рис. S1). Из-за отсутствия здоровых панголинов в качестве контроля в этом исследовании мы использовали биохимические показатели крови здоровых формозанских панголинов (Chin et al. 2015) в качестве эталона.1-Dongyang показал значительное снижение количества тромбоцитов, глюкозы и холестерина, тогда как 2-Lishui продемонстрировал значительное увеличение уровней аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и амилазы, но снижение общего билирубина. Кроме того, в 4-Wucheng (и в дополнительной таблице S4) наблюдались более низкое количество PLT и более высокие уровни щелочных фосфатаз и азота мочевины крови. Хотя этих панголинов тщательно реанимировали на спасательной станции, только панголин 3-Руян выздоровел.Панголины 1-Дунъян, 2-Лишуй и 4-Учэн умерли на 3, 16 и 5 дней после поступления соответственно.
3.2 Патологические изменения у мертвых ящеров
После вскрытия наблюдали застой в печени и легких панголина 1-Дунъян, хотя в других внутренних органах явных патологических изменений не наблюдалось. В соответствии с очевидной гиперемией, гистологические тесты выявили кровоизлияние в печень и легкие (дополнительный рисунок S2). Кроме того, наблюдались пикнотическое ядро печеночных клеток, пикноз лимфоцитов в селезенке, некроз печеночной пластинки и некроз клубочков.Наконец, дегенерация коллагеновых волокон наблюдалась в печени, селезенке и легких (дополнительный рис. S2).
Для панголина 2-Lishui, очевидный некроз наблюдался в легких, почках и селезенке, а застойные явления наблюдались в печени (дополнительный рис. S2) в дополнение к мезентериальной лимфаденопатии. Примечательно, что в обоих легких присутствовало много молочно-белых поражений, особенно в левой нижней доле (1 × 2 см). Гистологические тесты выявили некроз печени, селезенки, легких, почек, трахеи и тонкого кишечника, а также кровоизлияние в легкое (дополнительный рис.S2).
3.3 Идентификация вирусных агентов с помощью мета-транскриптомики и ПЦР
Для идентификации возможных этиологических агентов заболевания у четырех ящеров были созданы восемь мета-транскриптомных библиотек из образцов крови, печени, селезенки, легких, почек и фекалий. генерируя в общей сложности 306 908 179 считываний последовательностей с парными концами. Сборка De novo выявила высокую распространенность пестивирусного и колвирусоподобного вируса во всех мета-транскриптомных библиотеках панголина 1-Dongyang и 2-Lishui, что составляет 6–80 и 1–29 процентов от общего числа вирусных контигов. соответственно (дополнительная таблица S2).Примечательно, что, несмотря на присутствие других предполагаемых вирусов (дополнительная таблица S2), только пестивирусный и колвирусоподобный вирус можно было успешно идентифицировать с помощью ПЦР. Поскольку эти предполагаемые вирусные последовательности не могли быть подтверждены с помощью ПЦР и, вероятно, были результатом контаминации; следовательно, они не были возможными этиологическими агентами заболевания у четырех ящеров. Дополнительные анализы показали, что новый пестивирус присутствует только в 1-Dongyang, тогда как новый колтивирус присутствует только в 2-Lishui. В библиотеках, созданных из 1-Dongyang и 2-Lishui, не было обнаружено потенциальных бактериальных и грибковых патогенов.Наконец, не было обнаружено обильных вирусных, бактериальных и грибковых последовательностей в библиотеках, созданных из образцов крови и тканей 3-Ruian и 4-Wucheng (дополнительная таблица S2).
Генетический анализ показал, что новый пестивирус имел <57% сходства с известными пестивирусами, тогда как новый колвирус показал <68% сходства с известными колвирусами. Учитывая, что они родственны, но явно генетически отличаются от известных представителей Pestivirus и Coltivirus (см. Ниже), мы обозначили эти два недавно идентифицированных вируса как вирус панголина Dongyang (DYPV) и вирус панголина Lishui (LSPV), соответственно. , отражающие их виды-хозяева и географическое положение выборки.Попытки выделения вируса культурой клеток (BHK-21, Vero-E6 и DH82) и инокуляции мышей-сосунков оказались безуспешными.
Чтобы определить распределение вновь идентифицированных вирусов, каждый орган был протестирован с помощью ПЦР. Следовательно, DYPV был идентифицирован в сердце, печени, селезенке, легких, почках, головном мозге, крови, мазке из горла и фекалиях, взятых у панголина 1-Dongyang, а также у нимфных клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у этого животного. Интересно, что вирус не был идентифицирован у взрослых клещей, взятых также из 1-Dongyang.Аналогичным образом, LSPV также был идентифицирован в широком диапазоне тканевых органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки, кровь, мазок из горла и фекальные массы 2-Lishui.
3.4 Генетические особенности DYPV и LSPV
Для дальнейшей характеристики обоих вирусов были разработаны праймеры на основе последовательностей, полученных здесь, и последовательностей родственных вирусов, описанных ранее. Таким образом мы смогли восстановить полные геномы DYPV от 1-Dongyang и клещей ( A. javanense ), собранные от этого животного.Генетические особенности DYPV описаны в. Примечательно, что вирусы, полученные от ящеров и клещей, были тесно связаны друг с другом, хотя все же имели почти 2-процентное различие в последовательностях нуклеотидов. Кроме того, оба вируса были генетически и филогенетически отличными от известных вирусов рода Pestivirus , с отличиями> 43% nt и> 48% aa (дополнительная таблица S5). Как и в случае классических пестивирусов, геном DYPV кодирует двенадцать белков. Все известные сайты расщепления протеазы NS3 наблюдались в DYPV (дополнительный рис.S3). Кроме того, сайт расщепления NS4A-NS4B, расположенный в позиции L ₂₄₂₆ / A ₂₄₂₇ в BVDV1 и L ₂₃₃₆ / A ₂₃₃₇ в CSFV, появился в позиции L ₂₃₁₅ / K ₂₃₁₆ сайт. в DYPV (дополнительный рисунок S3).
Схема аннотированных геномов DYPV и LSPV. (а) Сравнение генома DYPV и известных пестивирусов. (b) Сравнение генома между LSPV и известными колтивирусами.
Примечательно, что, несмотря на использование как мета-транскриптомных методов, так и методов ПЦР, только девять сегментов генома (1–5 и 8–11) были получены от нового колвируса — у животного 2-Lishui — и наша попытка восстановить сегменты 6, 7 и 12 не удалось.Подробно генетические особенности LSPV описаны в. Все восстановленные сегменты имели консенсусные последовательности (GAG / AUU / A) на 5ʹ-конце и (G / CAGUC) и 3ʹ-конце () соответственно. Однако последовательности генома LSPV отличались от таковых у признанных колтивирусов, с сходством <75% (дополнительная таблица S6). Как и другие колвирусы, сегмент 9 LSPV также содержал две ORF. Однако последовательности, примыкающие к стоп-кодону UGA, которые являются сигналом считывания, отличались от известных колтивирусов.Примечательно, однако, что похожая картина наблюдалась у SHLV (), ближайшего родственника LSPV, который был взят от клещей в Австралии.
Характеристики генома LSPV. (а) Консервация последовательности 5ʹ- и 3ʹ-концевых 10 нт в геномных сегментах генома LSPV была проанализирована и визуализирована с помощью Weblogo. (b) Информация о последовательности вокруг стоп-кодона сегмента VP9 LSPV и известного колвируса.
3.4 Филогенетические отношения вновь идентифицированных вирусов
Чтобы определить эволюционные отношения между вновь идентифицированными и ранее признанными вирусами, мы оценили филогенетические деревья ML на основе последовательностей aa ().
деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей (полипротеина) и генов NS3 DYPV и других известных пестивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.
В филогении, основанном на последовательностях аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей и генов NS3, DYPV сформировал четко различимый клон, подтверждая, что он представляет собой новый пестивирус.Примечательно, что линия DYPV занимала базовое положение внутри линии парнокопытных, при этом пестивирусы, присутствующие у грызунов и летучих мышей, образуют более расходящиеся линии. В филогенезе, основанном на аминокислотных последовательностях гена RdRp и предполагаемого гена метилтрансферазы РНК (VP2;), LSPV также образовали отдельную линию в пределах рода Coltivirus . Интересно, однако, что вирус был наиболее тесно связан с мысом Шелли, идентифицированным у клещей ( I. holocyclus ), взятых у длинноносого бандикут (сумчатое животное) в Австралии (Harvey et al.2018).
деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей генов RdRp и предполагаемых генов РНК-метилтрансферазы (VP2) LSPV и других известных колтивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.
3.5 Филогенетический анализ последовательностей панголинов
Зондский панголин ( M. javanica ) географически широко распространен в Юго-Восточной Азии, включая Индонезию (Ява, Суматра, Борнео и Малые Зондские острова), Малайзию, Сингапур и др. Филиппины, Таиланд, Вьетнам, Лаос и Камбоджа (Zhang et al.2015), тогда как китайские панголины ( M. pentadactyla ) относительно обычны в Южном Китае (Choo et al. 2016). Чтобы определить вероятное географическое происхождение этих больных ящеров, последовательности гена mt- cyt b были амплифицированы из их тканей. Генетический анализ показал, что все последовательности, полученные от зондских ящеров в этом исследовании, попали в группу M. javanica , в то время как китайские ящеры сгруппированы с последовательностями M. pentadactyla . Примечательно, что три отобранных здесь зондских панголина были очень близки к панголинам из Индонезии, Малайзии, Таиланда и Сингапура — 99.9, 99,7 и 99,9% идентичности последовательностей нуклеотидов соответственно, что указывает на то, что они, скорее всего, были (незаконно) импортированы в Китай из-за границы. Напротив, панголин 3-Ruian ( M. pentadactyla ) сгруппировался вместе с панголином из Тайваня / Китая с идентичностью последовательностей на 99,1%, что позволяет предположить, что это животное не было импортировано. Поскольку последовательности, относящиеся к митохондриальной 16S рДНК A. javanense , не были доступны, мы не смогли определить происхождение клещей A. javanense , собранных у больных зондских ящеров.Следовательно, следует рассмотреть системные усилия по созданию всеобъемлющих баз данных для определения видов членистоногих-переносчиков и в качестве инструмента для определения географического происхождения собранных членистоногих.
3.6 Молекулярное исследование DYPV и LSPV у местных клещей
Поскольку DYPV был идентифицирован у клещей ( A. javanense ), собранных у панголина 1-Dongyang, и LSPV был тесно связан с SHLV, также идентифицированным у клещей ( I . holocyclus ) из Австралии, мы собирали клещей в местах, где были обнаружены больные ящеры.Следовательно, было собрано 452 клеща, представляющих 7 видов, в том числе 220 Haemaphysalis hystricis , 147 Rhipicephalus microplus , 49 Haemaphysalis longicornis , 11 Ixodes granulatus , 11 Ranguicephalus Haemaphysalis mageshimaensis . К сожалению, ни DYPV, ни LSPV не были идентифицированы у этих клещей с помощью мета-транскриптомики и вложенной ОТ-ПЦР.
4.Обсуждение
Ящеры насекомоядны, ведут преимущественно ночной образ жизни и питаются почти исключительно муравьями и термитами, с сильным предпочтением определенных видов насекомых (Lin et al. 2015; Choo et al. 2016). Восемь видов ящеров обитают в Африке и Азии, утрата среды обитания и изменения в их среде обитания серьезно сказываются на статусе их популяции. Что наиболее важно, на панголинов сильно повлияла незаконная международная и внутренняя торговля дикими животными и растениями для традиционной медицины или мяса (Zhang et al.2015). Следовательно, панголины занесены в Красный список исчезающих видов МСОП как уязвимые, находящиеся под угрозой исчезновения или находящиеся в критическом состоянии (du Toit et al., 2017). Примечательно, что панголинам также могут угрожать эпизоотические патогены, присутствующие либо в их первоначальной среде обитания, либо в новой среде после перемещения. Действительно, перемещение или торговля домашними и дикими животными играет важную роль в распространении многих эпизоотических патогенов (Lin et al. 2012; Kosmider et al. 2013; Peeler et al.2015).
В этом исследовании было обнаружено, что четыре панголина — три M. javanica , вероятно, из Индонезии, Малайзии и Таиланда, и один M. pentadactyla , вероятно местного происхождения, — страдали болезнью и были отправлены в местную спасательную станцию. для лечения. К сожалению, трое животных погибли, а одно выздоровело. На сегодняшний день сообщения о болезни панголина редки и в основном ограничиваются болезнями, вызываемыми бактериями и паразитами (Mohapatra et al., 2016; Jabin et al., 2019). Нет доступной литературы по вирусным инфекциям панголинов до недавнего выявления вируса парагриппа 5, вируса Сендай и коронавируса зондских панголинов в Китае (Liu et al.2019; Wang et al. 2019). Используя комбинацию мета-транскриптомных и ПЦР-методов, мы идентифицировали два новых РНК-вируса — пестивирус и колвирус — у двух мертвых ящеров. Судя по клиническим признакам (), все четыре панголина страдали инфекционным заболеванием. Однако, поскольку у этих животных не было получено полных клинических данных и лабораторных параметров, мы не могли четко определить заболевание, которым они страдали.
Пестивирусы — хорошо известные патогены животных, которые наносят значительный экономический ущерб, заражая как домашних (например,грамм. свиньи, крупный рогатый скот, овцы и козы) и диких (например, кабанов и жвачных) животных (Vilcek and Nettleton 2006). Пестивирусные инфекции могут быть субклиническими или вызывать ряд клинических признаков, включая острую диарею, острый геморрагический синдром, острое смертельное заболевание, а также болезнь истощения. Здесь новый пестивирус, обозначенный как DYPV, был идентифицирован во многих органах одного из больных ящеров [1-Dongyang ( M. javanica )], который имел явные патологические изменения. Филогенетический анализ показывает, что он представляет нового представителя рода Pestivirus .Хотя требуются более подробные подтверждающие результаты, эти данные предполагают, что DYPV-подобные пестивирусы могут быть ответственны за геморрагическое заболевание, наблюдаемое у ящеров.
На сегодняшний день принято считать, что позвоночные животные, а не беспозвоночные, являются основными хозяевами пестивирусов (Smith et al. 2017). Однако недавно у клещей был обнаружен новый пестивирус, названный вирусом Fairfax Lookout ( Ixodes trichosuri ). Однако, учитывая его филогенетическое положение рядом с пестивирусами млекопитающих, а также его чрезвычайно низкую численность, было высказано предположение, что вирус был связан с позвоночным хозяином, а не с самим клещом (Harvey et al.2018). В этом исследовании DYPV был идентифицирован не только у ящеров, но и у нимфных клещей, собранных у ящеров. Однако DYPV не был обнаружен у взрослых клещей, взятых также у панголина 1-Dongyang. Интересно, что хотя DYPV от клещей был тесно связан с образцом, взятым от панголинов, в вирусном геноме имелось около 2% различий нуклеотидов, что позволяет предположить, что они разделены несколькими событиями передачи. Филогенетический анализ показал, что панголины Sunda, включая панголина 1-Dongyang, скорее всего, были импортированы в Китай из Индонезии, Малайзии и Филиппин ().Кроме того, клещей A. javanense не были обнаружены в провинции Чжэцзян (Chen et al. 2010), DYPV не был идентифицирован у местных собранных клещей, и мы не наблюдали этот вирус в предыдущих крупномасштабных исследованиях выборки клещей (Li et al. 2015; Ши и др., 2016a, b, 2018). В совокупности эти наблюдения предполагают, что вирус, вероятно, был завезен из-за границы с ящерами, незаконно проданными.
ML-дерево на основе последовательностей нуклеотидов гена mt- cyt b четырех панголинов и других известных панголинов.Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значимыми и отображались на деревьях.
Колвирусы — хорошо известные клещевые патогены, которые могут вызывать болезни человека. Например, CTFV вызывает легкое лихорадочное заболевание или более тяжелое заболевание, включая инфекцию центральной нервной системы и / или геморрагическую лихорадку (Goodpasture et al. 1978; Attoui et al. 2005). Кроме того, инфекции EYAV были связаны с неврологическими заболеваниями человека (Moutailler et al.2016). Примечательно, что хотя некоторые колвирусы (например, CTFV, EYAV, TFRV) были обнаружены в дикой природе (например, летучие мыши и грызуны), нет четких доказательств того, что эти вирусы могут вызывать заболевания у животных (Moutailler et al.2016; Weiss et al. 2017; Уильямсон и др., 2019). В этом исследовании новый колвирус, названный LSPV, был идентифицирован у одного из больных ящеров [2-Lishui ( M. javanica )]. Учитывая высокое содержание LSPV в мета-транскриптомных данных в сочетании с клиническими признаками и патологическими изменениями, появившимися у панголина (2-Lishui), а также обнаружение LSPV в нескольких органах, наши данные позволяют предположить, что LSPV, возможно, вызвала системная инфекция и гибель рассматриваемого панголина, хотя это необходимо будет подтвердить дополнительными данными.
Принято считать, что геном колвируса состоит из двенадцати сегментов линейной двухцепочечной РНК (Fujita et al. 2017). Недавно у летучих мышей со свободным хвостом был обнаружен новый колвирус, лесной реовирус (TFRV) ( C. aloysiisabaudiae ; Weiss et al.2017). Интересно, что в геноме вируса отсутствуют сегменты 6, 7 и 12, и было высказано предположение, что эти отсутствующие сегменты не были идентифицированы, вероятно, из-за низкого сходства между TFRV и известными колтивирусами (Weiss et al.2017). Поразительно, как и в случае с TFRV, мы не смогли идентифицировать вирусные сегменты 6, 7 и 12 в LSPV, несмотря на использование методов, которые ранее позволили получить полный геном сильно дивергентного вируса клещей Jingmen (Qin et al. 2014). Следовательно, очевидно, что необходимы дополнительные исследования, чтобы сделать вывод, действительно ли эти сегменты отсутствуют в LSPV и TFRV. Наконец, поскольку панголин 2-Lishui мог быть импортирован из Индонезии (), возможно, что LSPV, как и DYPV, также был импортирован в Китай.
Наконец, несмотря на некоторую дискуссию о роли ящеров в возникновении нового коронавируса (тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2, SARS-CoV-2; Wahba et al.2020; Wong et al. 2020), являющейся причиной вспышки коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) (Wu et al.2020; Zhou et al.2020), мы не обнаружили коронавирусов у этих ящеров метатранскриптомными методами и методами ПЦР. Следовательно, необходимы дополнительные усилия, чтобы сделать вывод о роли ящеров в передаче SARS-CoV-2.
Доступность данных
Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и последовательности гена mt- cyt b, созданные в этом исследовании, депонированы в GenBank под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MK636874-MK636884 «,» start_term «:» MK636874 «,» end_term «:» MK636884 «,» start_term_id «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MN365828-MN365832», «start_term»: «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117 «,» end_term_id «:» 1812622121 «}} MN365828-MN365832 и {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81861138003, 31930001 и 81672057) и Специального национального проекта по изучению основных ресурсов Китая (2019ФГ) 101500. E.C.H. был профинансирован стипендией австралийского лауреата ARC (FL170100022).
Конфликт интересов: Нет конфликта интересов.
Дополнительные материалы
veaa020_Supplementary_Data
Ссылки
Асплунд М.и другие. (2019) «Загрязнение вирусных последовательностей при высокопроизводительном секвенировании вирусов: исследование связи 700 библиотек для секвенирования», Clinical Microbiology and Infection, 25: 1277–85. [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие. (2002) «Genus Coltivirus (Family Reoviridae ): Genomic and Morphologic Characterization of Old World and New World Viruses», Archives of Virology, 147: 533–61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие.(2005) «Колвирусы и сеадорнавирусы в Северной Америке, Европе и Азии», Новые инфекционные заболевания, 11: 1673–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Бломе С. и другие. (2017) «Классическая чума свиней — обновленный обзор», Вирусы, 9: 86. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Капелла-Гутьеррес С. и другие. (2009) «trimAl: Инструмент для автоматического выравнивания выравнивания в крупномасштабных филогенетических анализах», Bioinformatics, 25: 1972–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чен З.и другие. (2010) «Клещи (Acari: Ixodoidea: Argasidae, Ixodidae) из Китая», Experimental and Applied Acarology, 51: 393–404. [PubMed] [Google Scholar]
Чен З. и другие. (2012) «Морфологические, биологические и молекулярные характеристики бисексуальных и партеногенетических Haemaphysalis longicornis », Ветеринарная паразитология, 189: 344–52. [PubMed] [Google Scholar]
Чин С.С. и другие. (2015) «Гематологические и сывороточные биохимические параметры явно здоровых спасенных формозановых панголинов ( Manis pentadactyla pentadactyla )», Journal of Zoo and Wildlife Medicine, 46: 68–76.[PubMed] [Google Scholar]
Чу С. В. и другие. (2016) «Геномы панголинов и эволюция чешуек млекопитающих и иммунитет», Genome Research, 26: 1312–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
du Toit Z. и другие. (2017) «Митохондриальные геномы африканских панголинов и понимание эволюционных закономерностей и филогении семейства Manidae», BMC Genomics, 18: 746. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ферт К. и другие. (2014) «Обнаружение зоонозных патогенов и характеристика новых вирусов, переносимых Commensal Rattus norvegicus в Нью-Йорке», mBio, 5: e01933–01914.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Фуджита Р. и другие. (2017) «Выделение и характеристика вируса клещей Тарумизу: новый колвирус от клещей Haemaphysalis flava в Японии», Virus Research, 242: 131–40. [PubMed] [Google Scholar]
Гобер П. и другие. (2018) «Полная филогения панголинов: увеличение ресурсов для молекулярного отслеживания наиболее пострадавших млекопитающих на Земле», Journal of Heredity, 109: 347–59. [PubMed] [Google Scholar]
Годен Т.Дж. и другие. (2009) «Филогения живых и вымерших панголинов (Mammalia, Pholidota) и связанных таксонов: анализ на основе морфологии», Journal of Mammalian Evolution, 16: 235–305. [Google Scholar]
Goodpasture H.C. (1978) «Колорадская клещевая лихорадка: клинические, эпидемиологические и лабораторные аспекты 228 случаев заболевания в Колорадо в 1973–1974 годах», Annals of Internal Medicine, 88: 303–10. [PubMed] [Google Scholar]
Гиндон С. и другие. (2010) «Новые алгоритмы и методы оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0 ’, Систематическая биология, 59: 307–21. [PubMed] [Google Scholar]
Го В. П. и другие. (2013) «Филогения и происхождение хантавирусов, обитающих у летучих мышей, насекомоядных и грызунов», PLoS Pathogens, 9: e1003159. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Харви Э. и другие. (2018) «Обширное разнообразие РНК-вирусов у австралийских клещей», Журнал вирусологии, 93: e01358–18. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Хуа Л. и другие. (2015) «Разведение панголинов в неволе: текущее состояние, проблемы и перспективы на будущее», ZooKeys, 507: 99–114.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джабин Г. и другие. (2019) «Идентификация клеща Amblyomma javanense (Acari: Ixodidae) из китайского панголина: создание штрих-кода видов, филогенетический статус и его значение в судебной экспертизе дикой природы», Экспериментальная и прикладная акарология, 78: 461–7. [PubMed] [Google Scholar]
Джо В. К. и другие. (2019) «Эволюционно расходящийся пестивирус, лишенный гена N (Pro), системно заражает виды китов», Emerging Microbes & Infections, 8: 1383–92.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Като К., Стэндли Д. М. (2013) «Программное обеспечение для выравнивания множественных последовательностей MAFFT, версия 7: Улучшения в производительности и удобстве использования», Молекулярная биология и эволюция, 30: 772–80. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Космидер Р. и другие. (2013) « Echinococcus multilocularis Интродукция и распространение в дикой природе через импортированных бобров», Veterinary Record, 172: 606.2. [PubMed] [Google Scholar]
Кумар С.и другие. (2016) «MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets», Molecular Biology and Evolution, 33: 1870–4. [PubMed] [Google Scholar]
Ли Б. и другие. (2010) «Оценка экспрессии гена RNA-Seq с неопределенностью картирования считывания», Bioinformatics, 26: 493–500. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ли К. X. и другие. (2015) «Беспрецедентное геномное разнообразие РНК-вирусов у членистоногих выявляет происхождение РНК-вирусов с отрицательным смыслом», eLife, 4: e05378.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линь М. Ф. и другие. (2015) «Аспекты пищеварительной анатомии, потребления корма и пищеварения у китайского панголина ( Manis pentadactyla ) в зоопарке Тайбэя», Zoo Biology, 34: 262–70. [PubMed] [Google Scholar]
Лин Х. Д. и другие. (2012) «Миграция норвежских крыс привела к глобальному распространению сеульского хантавируса сегодня», Journal of Virology, 86: 972–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Лю П. и другие.(2019) «Вирусная метагеномика выявила вирус Сендай и коронавирусную инфекцию малайских панголинов ( Manis javanica )», Вирусы, 11: 979. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моенниг В., Бехер П. (2015) «Программы борьбы с пестивирусами: как далеко мы продвинулись и куда мы идем?», Обзоры исследований здоровья животных, 16: 83–7. [PubMed] [Google Scholar]
Мохапатра Р. К. и другие. (2016) «Контрольный список паразитов и бактерий, зарегистрированных у ящеров ( Manis sp.) ’, Journal of Parasitic Diseases, 40: 1109–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моутайлер С. и другие. (2016) «Разнообразие вирусов в Ixodes ricinus и характеристика нейротропного штамма вируса Eyach», Новые микробы и новые инфекции, 11: 71–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Пилер Э. Дж. и другие. (2015) «Анализ рисков импорта болезней животных — Обзор текущих методов и практики», Трансграничные и новые болезни, 62: 480–90.[PubMed] [Google Scholar]
Постель А. и другие. (2015) «Тесная связь пестивирусов жвачных животных и вируса классической чумы свиней», Emerging Infectious Diseases, 21: 668–72. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Цинь X. С. и другие. (2014) «Клещевой сегментированный РНК-вирус, содержащий сегменты генома, полученные от несегментированных вирусных предков», Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111: 6744–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ридпат Дж.Ф. и другие. (2008) «Заболевание репродуктивного тракта, связанное с инокуляцией беременных белохвостых оленей вирусом бычьей вирусной диареи», Американский журнал ветеринарных исследований, 69: 1630–6. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2016a) «Дивергентные вирусы, обнаруженные у членистоногих и позвоночных, пересматривают историю эволюции Flaviviridae и родственных вирусов», Journal of Virology, 90: 659–69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие.(2016b) «Новое определение виросферы РНК беспозвоночных», Nature, 540: 539–43. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2018) «Эволюционная история РНК-вирусов позвоночных», Nature, 556: 197–202. [PubMed] [Google Scholar]
Смит Д. Б. и другие. (2017) «Предлагаемый пересмотр таксономии рода Pestivirus , семейства Flaviviridae », Журнал общей вирусологии, 98: 2106–12. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Тауц Н. и другие.(2015) «Молекулярная биология пестивирусов», «Достижения в вирусных исследованиях», 93: 47–160. [PubMed] [Google Scholar]
Вальдазо-Гонсалес Б. и другие. (2007) «Генетическое и антигенное типирование изолятов вируса пограничных заболеваний у овец Пиренейского полуострова», Ветеринарный журнал, 174: 316–24. [PubMed] [Google Scholar]
Вилчек С., Нетлтон П. Ф. (2006) «Пестивирусы у диких животных», Ветеринарная микробиология, 116: 1–12. [PubMed] [Google Scholar]
Вахба Л. и другие. (2020) «Идентификация ниши панголина для коронавируса, подобного 2019-nCoV, с помощью обширного мета-метагеномного поиска», bioRxiv, doi: 10.1101 / 2020.02.08.939660. [Google Scholar]
Ван Х. и другие. (2019) «Полная последовательность генома вируса парагриппа 5 (PIV5) зондского панголина ( Manis Javanica ) в Китае», Journal of Wildlife Diseases, 55: 947–50. [PubMed] [Google Scholar]
Вайс С. и другие. (2017) «Новый связанный с колтивирусом вирус, выделенный из летучих мышей со свободным хвостом из Кот-д’Ивуара, способен инфицировать клетки человека in vitro», Virology Journal, 14: 181. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Уильямсон Б.Н. и другие. (2019) «Распространенность и штаммы вируса колорадской клещевой лихорадки у лесных клещей Скалистых гор в долине Биттеррут, штат Монтана», Трансмиссивные и зоонозные заболевания, 19: 694–702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Вонг М. и другие. (2020) «Доказательства рекомбинации коронавирусов, указывающие на происхождение nCoV-2019 у панголинов», bioRxiv , DOI: 10.1101 / 2020.02.07.939207.
Ву Ф. и другие. (2020) «Новый коронавирус, связанный с респираторным заболеванием человека в Китае», Nature, 579: 265–9.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
У З. и другие. (2012) «Анализ виромов для идентификации новых вирусов млекопитающих у видов летучих мышей из провинций Китая», Journal of Virology, 86: 10999–1012. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ядав П. Д. и другие. (2019) «Характеристика новых реовирусов Вируса Вад Медани (орбивирус) и вируса Кундала (колвирус), собранных из клещей Hyalomma anatolicum в Индии во время эпиднадзора за геморрагической лихорадкой Крымского Конго», Журнал вирусологии, 93: e00106–19.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чжан Х. и другие. (2015) «Молекулярное отслеживание конфискованных чешуек панголинов для сохранения и мониторинга незаконной торговли в Юго-Восточной Азии», Глобальная экология и сохранение, 4: 414–22. [Google Scholar]
Чжоу П. и другие. (2020) «Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом вероятного происхождения летучих мышей», Nature, 579: 270–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Недавно идентифицированные вирусные геномы у ящеров со смертельным исходом
Virus Evol.2020 Янв; 6 (1): veaa020.
, ^v1 , ^v2 , ^v1, ^v3 , ^v4, ^v1, ^v5, ^v4, 901 901 901 901 , ^v3
Wen-Hua Gao
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
Xian-Dan Lin
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
Ян-Мэй Чен
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
Chun-Gang Xie
^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай
Чжи-Чжоу Тан
^v1 Отдел зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
Цзя-Цзюнь Чжоу
^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай
Шуай Чен
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
Эдвард С. Холмс
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006, Австралия
Yong-Zhen Zhang
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай
^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай
^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006 год, Австралия
Вен-Хуа Гао, Сиань-Дан Линь и Ян-Мей Чен внесли равный вклад к этой работе.
Авторские права © Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/). 4.0 /), который разрешает некоммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь по адресу [email protected]. Эта статья цитируется в других статьях PMC.
Дополнительные материалы
veaa020_Supplementary_Data.
GUID: 9C1C82C7-9CA4-4D6E-83E6-59A44C7915D7
Заявление о доступности данных
Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и mt- были депонированы в этом исследовании генов последовательностей генов b. под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MK636874-MK636884», «start_term»: «MK636874», «end_term»: «MK636884», «start_term_id» «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365828-MN365832 «,» start_term » : «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117», «end_term_id»: «1812622121»}} MN365828-MN365832 и {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.
Abstract
Эпизоотические патогены представляют серьезную угрозу для многих видов диких животных, особенно в контексте быстро меняющейся окружающей среды. Панголины (отряд Pholidota) — млекопитающие, находящиеся под большой угрозой, в значительной степени из-за незаконной торговли дикими животными и растениями. В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера (три Manis javanica и один Manis pentadactyla ) с различными клиническими симптомами были спасены станцией защиты дикой природы Цзиньхуа в провинции Чжэцзян, Китай.Хотя трое из этих животных погибли, к счастью, одно выздоровело после 2 недель симптоматического лечения. Используя мета-транскриптомику в сочетании с полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), мы идентифицировали два новых РНК-вируса у двух мертвых ящеров. Геномный анализ показал, что эти вирусы были наиболее близки к пестивирусам и колтивирусам, хотя все еще генетически отличны друг от друга, с расхождением последовательностей более чем на 48 и 25 процентов на аминокислотном уровне, соответственно.Мы назвали эти вирус панголина Дунъян (DYPV) и вирус панголина Лишуй (LSPV) на основе места отбора проб и хозяев. Хотя известно, что колвивирусы (LSPV) передаются клещами, мы не обнаружили доказательств LSPV у клещей, взятых близко к месту сбора панголинов. Кроме того, хотя DYPV присутствовал в личинках клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у больных панголинов, они не были обнаружены в местной популяции клещей. Эпидемиологическое расследование показало, что оба новых вируса могли быть импортированы в результате незаконной международной торговли панголинами.Следовательно, эти данные указывают на то, что незаконный оборот дикой природы не только угрожает статусу популяций панголинов, но также может распространять эпизоотические патогены.
Ключевые слова: Ящеры, смертельная болезнь, пестивирус, колвирус, незаконная торговля дикими животными
1. Введение
Ящеры, также известные как чешуйчатые муравьеды (семейство: Manidae, отряд: Pholidota), уникальны среди млекопитающих из-за их перекрывающиеся чешуйки (сделанные из кератина) и имеют географическое распространение, которое включает части Азии и Африки (Gaudin et al.2009 г.). Во всем мире обитает всего восемь видов панголинов, четыре — в Азии, включая Китай, и четыре — в Африке. Растет интерес к благополучию панголинов, включая угрозы, связанные с браконьерством и вырубкой лесов в их естественной среде обитания (Hua et al. 2015). Самое главное, что панголины стали неудачными символами международной и внутренней незаконной торговли дикими животными и растениями, а также являются наиболее продаваемыми млекопитающими (Gaubert et al. 2018). Из восьми видов четыре занесены в список уязвимых, два находятся под угрозой исчезновения, а оставшиеся два находятся под угрозой исчезновения в Красном списке видов, находящихся под угрозой исчезновения Международного союза охраны природы (du Toit et al.2017).
Пестивирусы (семейство: Flaviviridae ) представляют собой оболочечные РНК-вирусы с сильно вариабельными одноцепочечными геномами положительно-смысловой РНК размером ~ 12,3 т.п.н., которые содержат одну большую открытую рамку считывания (ORF), кодирующую полипротеин из примерно 3900 аминокислот (аминокислотные остатки). ) по длине (Постел и др., 2015; Таутц и др., 2015). Некоторые пестивирусы (например, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус пограничной болезни, вирус классической чумы свиней) являются хорошо известными патогенами животных, вызывающими тяжелые заболевания, включая контагиозное геморрагическое заболевание у свиней и респираторное и репродуктивное заболевание крупного рогатого скота и овец (Vilcek and Nettleton 2006; Valdazo). -Gonzalez et al.2007; Менниг и Бехер 2015). Сообщалось также о заболеваниях диких животных (например, кабанов и оленей), вызываемых пестивирусами (Ridpath et al., 2008; Blome et al., 2017). После применения молекулярных и геномных методов обнаружения вирусов в последние годы был идентифицирован ряд новых пестивирусов, в том числе от летучих мышей, грызунов и морских свиней (Wu et al. 2012; Firth et al. 2014; Smith et al. 2017; Джо и др., 2019). Наконец, пестивирусоподобные вирусы также идентифицированы у членистоногих (Shi et al.2016a) и членистоногих, собранных у млекопитающих (Harvey et al. 2018). Вместе эти данные подчеркивают циркуляцию разнообразного диапазона пестивирусов в широком диапазоне животных-хозяев.
Колвирусы (род: Coltivirus , семейство: Reoviridae ) представляют собой двухцепочечные сегментированные РНК-вирусы. В настоящее время в этот род определены только два вируса: вирус колорадской клещевой лихорадки (CTFV), обнаруженный в Северной Америке, и вирус Eyach (EYAV) из Европы. Их геном РНК состоит из двенадцати сегментов.Оба вируса могут вызывать тяжелые заболевания у людей (Attoui et al. 2005; Moutailler et al. 2016) и передаются клещами (Attoui et al. 2002). Недавно было охарактеризовано несколько новых колтивирусов, в том числе вирус клещей Тарумизу от клещей Haemaphysalis flava в Японии (Fujita et al.2017), вирус Кундала от клещей Hyalomma anatolicum в Индии (Yadav et al.2019), вирус Шелли-Хедленд. (SHLV) от клещей Ixodes holocyclus в Австралии (Harvey et al.2018) и реовирус Тайского леса (TFRV) от летучих мышей со свободным хвостом ( Chaereophon aloysiisabaudiae ) в Кот-д’Ивуаре (Weiss et al., 2017). Следовательно, очевидно, что в природе существует большое разнообразие колтивирусов, и, вероятно, будет идентифицировано гораздо больше. Однако на сегодняшний день неизвестно, связаны ли колвирусы с болезнями диких животных.
Здесь мы выполнили мета-транскриптомный (то есть полное секвенирование РНК) анализ четырех больных панголинов, спасенных станцией защиты дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян в Китае в 2018 году.От этих животных мы идентифицировали и охарактеризовали новые вирусные агенты — пестивирус и колтивирус — от двух ящеров. Кроме того, мы проанализировали клинические особенности и патологические изменения, связанные с заболеванием у этих животных.
2. Материалы и методы
2.1 Больные ящеры и сбор образцов
В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). На станции эти панголины прошли лабораторное и клиническое обследование с последующим лечением.Хотя трое животных погибли, одно выздоровело через 2 недели лечения. Образцы крови и тканей были собраны у всех четырех животных, а клещи были собраны у двух (дополнительная таблица S1). Первоначально ящеры и клещи были идентифицированы до уровня видов опытными полевыми биологами, а затем подтверждены анализом последовательностей гена митохондриального цитохрома b (mt- cyt b) или митохондриального гена 16S рДНК, как описано ранее (Chen et al.2012; Guo и др., 2013).
Места отбора проб (красные кружки) больных ящеров из провинции Чжэцзян, Китай.
Это исследование было рассмотрено и одобрено этическим комитетом Национального института контроля и профилактики инфекционных заболеваний Китайского центра контроля и профилактики заболеваний (CDC). Все процедуры вскрытия и взятия проб строго соответствовали руководству по использованию и уходу за лабораторными животными Китайского центра контроля заболеваний (SYXK (Jing) 2017-0021).
2.2 Построение библиотеки РНК, секвенирование и анализ данных
Общая РНК была извлечена из образцов крови, тканей органов и фекалий, а также из клещей с использованием Nucleo Spin RNA Blood (MN, Düren, Германия), RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) и TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) соответственно, следуя инструкциям производителя.ДНК экстрагировали с помощью набора DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Для конструирования библиотеки РНК аликвоты раствора РНК объединяли в равных количествах (дополнительная таблица S2). Набор SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 (TaKaRa, Далянь, Китай) и набор KAPA RNA HyperPrep с RiboErase (HMR; KAPA, Уилмингтон, Массачусетс, США) использовали для создания библиотек РНК из образцов крови, тканей органов и фекалий. соответственно. Рибосомную (r) РНК удаляли с использованием набора Ribo-Zero-Gold (HMR) (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).Секвенирование парных концов (150 п.н.) каждой библиотеки РНК проводили на платформе HiSeqX10 (Illumina).
Биоинформатический анализ считываний секвенирования был проведен, как описано ранее (Shi et al. 2016a). Вкратце, считывания секвенирования с фильтрацией адаптера и качеством были собраны de novo с использованием программы Trinity (версия 2.5.1). Вирусные контиги были идентифицированы путем сравнения (с использованием blastn и Diamond blastx) с базой данных неизбыточных нуклеотидов (nt) и белков (nr) NCBI со значениями e- , установленными на 1 × 10 ^— ¹⁰ и 1 × 10 ^— ⁴ соответственно.Вероятно контаминирующие вирусные последовательности были исключены из мета-транскриптомных данных (дополнительная таблица S2) с использованием методов, описанных ранее (Asplund et al.2019). Кроме того, была исключена высокая частота последовательностей ретровирусов, поскольку большинство из них, вероятно, были генами хозяина, а некоторые из них могли загрязнять вирусные последовательности, такие как последовательности альфаретровирусов и гаммаретровирусов, вероятно, связанные с лабораторными компонентами (Asplund et al., 2019 ). Наконец, предполагаемые вирусы, присутствующие в образцах крови, печени, селезенки, легких и почек, были подтверждены с помощью ПЦР.Количество транскриптов, сопоставленных с каждым вирусным контигом, определяли с помощью программы RSEM (Li et al. 2010), реализованной в Trinity.
2.3 ПЦР и секвенирование
Суммарную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР (TaKaRa). Вирусная РНК у клещей была обнаружена с помощью вложенной ПЦР, нацеленной на консервативные области гена РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) как пестивируса, так и колтивируса. Для восстановления полных вирусных геномов были сконструированы праймеры на основе собранных контигов пестивируса и колвируса, полученных с помощью мета-транскриптомики (дополнительная таблица S3).Концы генома определяли с помощью наборов 5ʹ / 3ʹ RACE (TaKaRa).
Набор для экстракции геля QIAquick (Qiagen) использовали для очистки продуктов ПЦР перед секвенированием. Очищенную ДНК длиной <700 п.н. секвенировали напрямую, а ДНК длиной более 700 п.н. сначала клонировали в вектор pMD18-T (TaKaRa), а затем трансформировали в компетентные клетки JM109-143. Для каждого образца было отобрано не менее трех клонов для секвенирования.
2.4 Филогенетический анализ
Вирусные последовательности были выровнены с использованием алгоритма E-INS-i, реализованного в MAFFT версии 7 (Katoh and Standley 2013).Затем неоднозначно выровненные области удаляли с помощью программы TrimAl (Capella-Gutierrez et al. 2009). Модель наилучшего соответствия (LG + Γ) эволюции последовательности аминокислот была оценена с использованием MEGA версии 7.0 (Kumar et al., 2016). Затем филогенетические деревья оценивались с использованием метода максимального правдоподобия (ML), реализованного в PhyML версии 3.0 (Guindon et al. 2010) со значениями поддержки бутстрапа, рассчитанными на основе 1000 повторяющихся деревьев. Значения начальной загрузки> 70% считались значимыми. Идентичность между последовательностями nt и aa рассчитывалась с помощью программы MegAlign, реализованной в программном пакете Lasergene v5.0 (ДНКстар).
3. Результаты
3.1 Болезнь и клинические особенности больных ящеров
В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). Для простоты они были названы здесь «1-Дунъян», «2-Лишуй», «3-Жуйан» и «4-Учэн» в зависимости от найденного местоположения. Морфологическое исследование и молекулярная идентификация показали, что эти панголины принадлежат к панголинам зонд, Manis javanica (1-Dongyang, 2-Lishui и 4-Wucheng) и китайскому панголину Manis pentadactyla (3-Ruian).Детали и клинические признаки этих ящеров описаны в. Все четыре панголина проявляли анорексию при отправке на спасательную станцию, а у 1-Дунъян и 2-Лишуй наблюдались подергивания и слюнки. Кровоизлияния и поражения кожи были очевидны у 1-Дунъян, тогда как у 2-Лишуй были обнаружены отеки на передних ногах. Наконец, панголин 4-Wucheng проявлял лихорадку и содержал кожные поражения, тогда как панголин 3-Ruian демонстрировал относительно легкие клинические признаки.
Таблица 1.
Справочная информация, клинические особенности и обследование спасенных ящеров.
Pangolin ID Вид Пол / возраст Штат Клинические особенности Клинический осмотр
Рентген Гематологический анализ
Гематологический анализ М. Яваница Мужчина / взрослый Мертвый Анорексия, подергивание, слюнотечение, кровоизлияние, ^a и поражения кожи ^b Нормальный PLT ↓, GLU ↓, холестерин ↓ и амилаза ↑ ↑ Лишуй М.Яваника Женский / взрослый Мертвый Анорексия, подергивание, слюноотделение и отек ^c Большая область тени на левом легком АЛТ ↑, АСТ ↑, амилаза ↑ и общий билирубин ↑ 3-Руян M. pentadactyla Самка / несовершеннолетняя Живой Анорексия, беспокойство и отек ^c — —
4-Wucheng М.Яваника Женский / взрослый Мертвый Анорексия, лихорадка и кожные поражения ^b Камни в желудке PLT ↓, ALP ↑, BUN ↑
Рентгенологические тесты показали большую площадь тень в левом легком панголина 2-Лишуй, указывающая на пневмонию (дополнительный рис. S1). Из-за отсутствия здоровых панголинов в качестве контроля в этом исследовании мы использовали биохимические показатели крови здоровых формозанских панголинов (Chin et al. 2015) в качестве эталона.1-Dongyang показал значительное снижение количества тромбоцитов, глюкозы и холестерина, тогда как 2-Lishui продемонстрировал значительное увеличение уровней аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и амилазы, но снижение общего билирубина. Кроме того, в 4-Wucheng (и в дополнительной таблице S4) наблюдались более низкое количество PLT и более высокие уровни щелочных фосфатаз и азота мочевины крови. Хотя этих панголинов тщательно реанимировали на спасательной станции, только панголин 3-Руян выздоровел.Панголины 1-Дунъян, 2-Лишуй и 4-Учэн умерли на 3, 16 и 5 дней после поступления соответственно.
3.2 Патологические изменения у мертвых ящеров
После вскрытия наблюдали застой в печени и легких панголина 1-Дунъян, хотя в других внутренних органах явных патологических изменений не наблюдалось. В соответствии с очевидной гиперемией, гистологические тесты выявили кровоизлияние в печень и легкие (дополнительный рисунок S2). Кроме того, наблюдались пикнотическое ядро печеночных клеток, пикноз лимфоцитов в селезенке, некроз печеночной пластинки и некроз клубочков.Наконец, дегенерация коллагеновых волокон наблюдалась в печени, селезенке и легких (дополнительный рис. S2).
Для панголина 2-Lishui, очевидный некроз наблюдался в легких, почках и селезенке, а застойные явления наблюдались в печени (дополнительный рис. S2) в дополнение к мезентериальной лимфаденопатии. Примечательно, что в обоих легких присутствовало много молочно-белых поражений, особенно в левой нижней доле (1 × 2 см). Гистологические тесты выявили некроз печени, селезенки, легких, почек, трахеи и тонкого кишечника, а также кровоизлияние в легкое (дополнительный рис.S2).
3.3 Идентификация вирусных агентов с помощью мета-транскриптомики и ПЦР
Для идентификации возможных этиологических агентов заболевания у четырех ящеров были созданы восемь мета-транскриптомных библиотек из образцов крови, печени, селезенки, легких, почек и фекалий. генерируя в общей сложности 306 908 179 считываний последовательностей с парными концами. Сборка De novo выявила высокую распространенность пестивирусного и колвирусоподобного вируса во всех мета-транскриптомных библиотеках панголина 1-Dongyang и 2-Lishui, что составляет 6–80 и 1–29 процентов от общего числа вирусных контигов. соответственно (дополнительная таблица S2).Примечательно, что, несмотря на присутствие других предполагаемых вирусов (дополнительная таблица S2), только пестивирусный и колвирусоподобный вирус можно было успешно идентифицировать с помощью ПЦР. Поскольку эти предполагаемые вирусные последовательности не могли быть подтверждены с помощью ПЦР и, вероятно, были результатом контаминации; следовательно, они не были возможными этиологическими агентами заболевания у четырех ящеров. Дополнительные анализы показали, что новый пестивирус присутствует только в 1-Dongyang, тогда как новый колтивирус присутствует только в 2-Lishui. В библиотеках, созданных из 1-Dongyang и 2-Lishui, не было обнаружено потенциальных бактериальных и грибковых патогенов.Наконец, не было обнаружено обильных вирусных, бактериальных и грибковых последовательностей в библиотеках, созданных из образцов крови и тканей 3-Ruian и 4-Wucheng (дополнительная таблица S2).
Генетический анализ показал, что новый пестивирус имел <57% сходства с известными пестивирусами, тогда как новый колвирус показал <68% сходства с известными колвирусами. Учитывая, что они родственны, но явно генетически отличаются от известных представителей Pestivirus и Coltivirus (см. Ниже), мы обозначили эти два недавно идентифицированных вируса как вирус панголина Dongyang (DYPV) и вирус панголина Lishui (LSPV), соответственно. , отражающие их виды-хозяева и географическое положение выборки.Попытки выделения вируса культурой клеток (BHK-21, Vero-E6 и DH82) и инокуляции мышей-сосунков оказались безуспешными.
Чтобы определить распределение вновь идентифицированных вирусов, каждый орган был протестирован с помощью ПЦР. Следовательно, DYPV был идентифицирован в сердце, печени, селезенке, легких, почках, головном мозге, крови, мазке из горла и фекалиях, взятых у панголина 1-Dongyang, а также у нимфных клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у этого животного. Интересно, что вирус не был идентифицирован у взрослых клещей, взятых также из 1-Dongyang.Аналогичным образом, LSPV также был идентифицирован в широком диапазоне тканевых органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки, кровь, мазок из горла и фекальные массы 2-Lishui.
3.4 Генетические особенности DYPV и LSPV
Для дальнейшей характеристики обоих вирусов были разработаны праймеры на основе последовательностей, полученных здесь, и последовательностей родственных вирусов, описанных ранее. Таким образом мы смогли восстановить полные геномы DYPV от 1-Dongyang и клещей ( A. javanense ), собранные от этого животного.Генетические особенности DYPV описаны в. Примечательно, что вирусы, полученные от ящеров и клещей, были тесно связаны друг с другом, хотя все же имели почти 2-процентное различие в последовательностях нуклеотидов. Кроме того, оба вируса были генетически и филогенетически отличными от известных вирусов рода Pestivirus , с отличиями> 43% nt и> 48% aa (дополнительная таблица S5). Как и в случае классических пестивирусов, геном DYPV кодирует двенадцать белков. Все известные сайты расщепления протеазы NS3 наблюдались в DYPV (дополнительный рис.S3). Кроме того, сайт расщепления NS4A-NS4B, расположенный в позиции L ₂₄₂₆ / A ₂₄₂₇ в BVDV1 и L ₂₃₃₆ / A ₂₃₃₇ в CSFV, появился в позиции L ₂₃₁₅ / K ₂₃₁₆ сайт. в DYPV (дополнительный рисунок S3).
Схема аннотированных геномов DYPV и LSPV. (а) Сравнение генома DYPV и известных пестивирусов. (b) Сравнение генома между LSPV и известными колтивирусами.
Примечательно, что, несмотря на использование как мета-транскриптомных методов, так и методов ПЦР, только девять сегментов генома (1–5 и 8–11) были получены от нового колвируса — у животного 2-Lishui — и наша попытка восстановить сегменты 6, 7 и 12 не удалось.Подробно генетические особенности LSPV описаны в. Все восстановленные сегменты имели консенсусные последовательности (GAG / AUU / A) на 5ʹ-конце и (G / CAGUC) и 3ʹ-конце () соответственно. Однако последовательности генома LSPV отличались от таковых у признанных колтивирусов, с сходством <75% (дополнительная таблица S6). Как и другие колвирусы, сегмент 9 LSPV также содержал две ORF. Однако последовательности, примыкающие к стоп-кодону UGA, которые являются сигналом считывания, отличались от известных колтивирусов.Примечательно, однако, что похожая картина наблюдалась у SHLV (), ближайшего родственника LSPV, который был взят от клещей в Австралии.
Характеристики генома LSPV. (а) Консервация последовательности 5ʹ- и 3ʹ-концевых 10 нт в геномных сегментах генома LSPV была проанализирована и визуализирована с помощью Weblogo. (b) Информация о последовательности вокруг стоп-кодона сегмента VP9 LSPV и известного колвируса.
3.4 Филогенетические отношения вновь идентифицированных вирусов
Чтобы определить эволюционные отношения между вновь идентифицированными и ранее признанными вирусами, мы оценили филогенетические деревья ML на основе последовательностей aa ().
деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей (полипротеина) и генов NS3 DYPV и других известных пестивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.
В филогении, основанном на последовательностях аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей и генов NS3, DYPV сформировал четко различимый клон, подтверждая, что он представляет собой новый пестивирус.Примечательно, что линия DYPV занимала базовое положение внутри линии парнокопытных, при этом пестивирусы, присутствующие у грызунов и летучих мышей, образуют более расходящиеся линии. В филогенезе, основанном на аминокислотных последовательностях гена RdRp и предполагаемого гена метилтрансферазы РНК (VP2;), LSPV также образовали отдельную линию в пределах рода Coltivirus . Интересно, однако, что вирус был наиболее тесно связан с мысом Шелли, идентифицированным у клещей ( I. holocyclus ), взятых у длинноносого бандикут (сумчатое животное) в Австралии (Harvey et al.2018).
деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей генов RdRp и предполагаемых генов РНК-метилтрансферазы (VP2) LSPV и других известных колтивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.
3.5 Филогенетический анализ последовательностей панголинов
Зондский панголин ( M. javanica ) географически широко распространен в Юго-Восточной Азии, включая Индонезию (Ява, Суматра, Борнео и Малые Зондские острова), Малайзию, Сингапур и др. Филиппины, Таиланд, Вьетнам, Лаос и Камбоджа (Zhang et al.2015), тогда как китайские панголины ( M. pentadactyla ) относительно обычны в Южном Китае (Choo et al. 2016). Чтобы определить вероятное географическое происхождение этих больных ящеров, последовательности гена mt- cyt b были амплифицированы из их тканей. Генетический анализ показал, что все последовательности, полученные от зондских ящеров в этом исследовании, попали в группу M. javanica , в то время как китайские ящеры сгруппированы с последовательностями M. pentadactyla . Примечательно, что три отобранных здесь зондских панголина были очень близки к панголинам из Индонезии, Малайзии, Таиланда и Сингапура — 99.9, 99,7 и 99,9% идентичности последовательностей нуклеотидов соответственно, что указывает на то, что они, скорее всего, были (незаконно) импортированы в Китай из-за границы. Напротив, панголин 3-Ruian ( M. pentadactyla ) сгруппировался вместе с панголином из Тайваня / Китая с идентичностью последовательностей на 99,1%, что позволяет предположить, что это животное не было импортировано. Поскольку последовательности, относящиеся к митохондриальной 16S рДНК A. javanense , не были доступны, мы не смогли определить происхождение клещей A. javanense , собранных у больных зондских ящеров.Следовательно, следует рассмотреть системные усилия по созданию всеобъемлющих баз данных для определения видов членистоногих-переносчиков и в качестве инструмента для определения географического происхождения собранных членистоногих.
3.6 Молекулярное исследование DYPV и LSPV у местных клещей
Поскольку DYPV был идентифицирован у клещей ( A. javanense ), собранных у панголина 1-Dongyang, и LSPV был тесно связан с SHLV, также идентифицированным у клещей ( I . holocyclus ) из Австралии, мы собирали клещей в местах, где были обнаружены больные ящеры.Следовательно, было собрано 452 клеща, представляющих 7 видов, в том числе 220 Haemaphysalis hystricis , 147 Rhipicephalus microplus , 49 Haemaphysalis longicornis , 11 Ixodes granulatus , 11 Ranguicephalus Haemaphysalis mageshimaensis . К сожалению, ни DYPV, ни LSPV не были идентифицированы у этих клещей с помощью мета-транскриптомики и вложенной ОТ-ПЦР.
4.Обсуждение
Ящеры насекомоядны, ведут преимущественно ночной образ жизни и питаются почти исключительно муравьями и термитами, с сильным предпочтением определенных видов насекомых (Lin et al. 2015; Choo et al. 2016). Восемь видов ящеров обитают в Африке и Азии, утрата среды обитания и изменения в их среде обитания серьезно сказываются на статусе их популяции. Что наиболее важно, на панголинов сильно повлияла незаконная международная и внутренняя торговля дикими животными и растениями для традиционной медицины или мяса (Zhang et al.2015). Следовательно, панголины занесены в Красный список исчезающих видов МСОП как уязвимые, находящиеся под угрозой исчезновения или находящиеся в критическом состоянии (du Toit et al., 2017). Примечательно, что панголинам также могут угрожать эпизоотические патогены, присутствующие либо в их первоначальной среде обитания, либо в новой среде после перемещения. Действительно, перемещение или торговля домашними и дикими животными играет важную роль в распространении многих эпизоотических патогенов (Lin et al. 2012; Kosmider et al. 2013; Peeler et al.2015).
В этом исследовании было обнаружено, что четыре панголина — три M. javanica , вероятно, из Индонезии, Малайзии и Таиланда, и один M. pentadactyla , вероятно местного происхождения, — страдали болезнью и были отправлены в местную спасательную станцию. для лечения. К сожалению, трое животных погибли, а одно выздоровело. На сегодняшний день сообщения о болезни панголина редки и в основном ограничиваются болезнями, вызываемыми бактериями и паразитами (Mohapatra et al., 2016; Jabin et al., 2019). Нет доступной литературы по вирусным инфекциям панголинов до недавнего выявления вируса парагриппа 5, вируса Сендай и коронавируса зондских панголинов в Китае (Liu et al.2019; Wang et al. 2019). Используя комбинацию мета-транскриптомных и ПЦР-методов, мы идентифицировали два новых РНК-вируса — пестивирус и колвирус — у двух мертвых ящеров. Судя по клиническим признакам (), все четыре панголина страдали инфекционным заболеванием. Однако, поскольку у этих животных не было получено полных клинических данных и лабораторных параметров, мы не могли четко определить заболевание, которым они страдали.
Пестивирусы — хорошо известные патогены животных, которые наносят значительный экономический ущерб, заражая как домашних (например,грамм. свиньи, крупный рогатый скот, овцы и козы) и диких (например, кабанов и жвачных) животных (Vilcek and Nettleton 2006). Пестивирусные инфекции могут быть субклиническими или вызывать ряд клинических признаков, включая острую диарею, острый геморрагический синдром, острое смертельное заболевание, а также болезнь истощения. Здесь новый пестивирус, обозначенный как DYPV, был идентифицирован во многих органах одного из больных ящеров [1-Dongyang ( M. javanica )], который имел явные патологические изменения. Филогенетический анализ показывает, что он представляет нового представителя рода Pestivirus .Хотя требуются более подробные подтверждающие результаты, эти данные предполагают, что DYPV-подобные пестивирусы могут быть ответственны за геморрагическое заболевание, наблюдаемое у ящеров.
На сегодняшний день принято считать, что позвоночные животные, а не беспозвоночные, являются основными хозяевами пестивирусов (Smith et al. 2017). Однако недавно у клещей был обнаружен новый пестивирус, названный вирусом Fairfax Lookout ( Ixodes trichosuri ). Однако, учитывая его филогенетическое положение рядом с пестивирусами млекопитающих, а также его чрезвычайно низкую численность, было высказано предположение, что вирус был связан с позвоночным хозяином, а не с самим клещом (Harvey et al.2018). В этом исследовании DYPV был идентифицирован не только у ящеров, но и у нимфных клещей, собранных у ящеров. Однако DYPV не был обнаружен у взрослых клещей, взятых также у панголина 1-Dongyang. Интересно, что хотя DYPV от клещей был тесно связан с образцом, взятым от панголинов, в вирусном геноме имелось около 2% различий нуклеотидов, что позволяет предположить, что они разделены несколькими событиями передачи. Филогенетический анализ показал, что панголины Sunda, включая панголина 1-Dongyang, скорее всего, были импортированы в Китай из Индонезии, Малайзии и Филиппин ().Кроме того, клещей A. javanense не были обнаружены в провинции Чжэцзян (Chen et al. 2010), DYPV не был идентифицирован у местных собранных клещей, и мы не наблюдали этот вирус в предыдущих крупномасштабных исследованиях выборки клещей (Li et al. 2015; Ши и др., 2016a, b, 2018). В совокупности эти наблюдения предполагают, что вирус, вероятно, был завезен из-за границы с ящерами, незаконно проданными.
ML-дерево на основе последовательностей нуклеотидов гена mt- cyt b четырех панголинов и других известных панголинов.Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значимыми и отображались на деревьях.
Колвирусы — хорошо известные клещевые патогены, которые могут вызывать болезни человека. Например, CTFV вызывает легкое лихорадочное заболевание или более тяжелое заболевание, включая инфекцию центральной нервной системы и / или геморрагическую лихорадку (Goodpasture et al. 1978; Attoui et al. 2005). Кроме того, инфекции EYAV были связаны с неврологическими заболеваниями человека (Moutailler et al.2016). Примечательно, что хотя некоторые колвирусы (например, CTFV, EYAV, TFRV) были обнаружены в дикой природе (например, летучие мыши и грызуны), нет четких доказательств того, что эти вирусы могут вызывать заболевания у животных (Moutailler et al.2016; Weiss et al. 2017; Уильямсон и др., 2019). В этом исследовании новый колвирус, названный LSPV, был идентифицирован у одного из больных ящеров [2-Lishui ( M. javanica )]. Учитывая высокое содержание LSPV в мета-транскриптомных данных в сочетании с клиническими признаками и патологическими изменениями, появившимися у панголина (2-Lishui), а также обнаружение LSPV в нескольких органах, наши данные позволяют предположить, что LSPV, возможно, вызвала системная инфекция и гибель рассматриваемого панголина, хотя это необходимо будет подтвердить дополнительными данными.
Принято считать, что геном колвируса состоит из двенадцати сегментов линейной двухцепочечной РНК (Fujita et al. 2017). Недавно у летучих мышей со свободным хвостом был обнаружен новый колвирус, лесной реовирус (TFRV) ( C. aloysiisabaudiae ; Weiss et al.2017). Интересно, что в геноме вируса отсутствуют сегменты 6, 7 и 12, и было высказано предположение, что эти отсутствующие сегменты не были идентифицированы, вероятно, из-за низкого сходства между TFRV и известными колтивирусами (Weiss et al.2017). Поразительно, как и в случае с TFRV, мы не смогли идентифицировать вирусные сегменты 6, 7 и 12 в LSPV, несмотря на использование методов, которые ранее позволили получить полный геном сильно дивергентного вируса клещей Jingmen (Qin et al. 2014). Следовательно, очевидно, что необходимы дополнительные исследования, чтобы сделать вывод, действительно ли эти сегменты отсутствуют в LSPV и TFRV. Наконец, поскольку панголин 2-Lishui мог быть импортирован из Индонезии (), возможно, что LSPV, как и DYPV, также был импортирован в Китай.
Наконец, несмотря на некоторую дискуссию о роли ящеров в возникновении нового коронавируса (тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2, SARS-CoV-2; Wahba et al.2020; Wong et al. 2020), являющейся причиной вспышки коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) (Wu et al.2020; Zhou et al.2020), мы не обнаружили коронавирусов у этих ящеров метатранскриптомными методами и методами ПЦР. Следовательно, необходимы дополнительные усилия, чтобы сделать вывод о роли ящеров в передаче SARS-CoV-2.
Доступность данных
Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и последовательности гена mt- cyt b, созданные в этом исследовании, депонированы в GenBank под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MK636874-MK636884 «,» start_term «:» MK636874 «,» end_term «:» MK636884 «,» start_term_id «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MN365828-MN365832», «start_term»: «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117 «,» end_term_id «:» 1812622121 «}} MN365828-MN365832 и {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81861138003, 31930001 и 81672057) и Специального национального проекта по изучению основных ресурсов Китая (2019ФГ) 101500. E.C.H. был профинансирован стипендией австралийского лауреата ARC (FL170100022).
Конфликт интересов: Нет конфликта интересов.
Дополнительные материалы
veaa020_Supplementary_Data
Ссылки
Асплунд М.и другие. (2019) «Загрязнение вирусных последовательностей при высокопроизводительном секвенировании вирусов: исследование связи 700 библиотек для секвенирования», Clinical Microbiology and Infection, 25: 1277–85. [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие. (2002) «Genus Coltivirus (Family Reoviridae ): Genomic and Morphologic Characterization of Old World and New World Viruses», Archives of Virology, 147: 533–61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие.(2005) «Колвирусы и сеадорнавирусы в Северной Америке, Европе и Азии», Новые инфекционные заболевания, 11: 1673–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Бломе С. и другие. (2017) «Классическая чума свиней — обновленный обзор», Вирусы, 9: 86. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Капелла-Гутьеррес С. и другие. (2009) «trimAl: Инструмент для автоматического выравнивания выравнивания в крупномасштабных филогенетических анализах», Bioinformatics, 25: 1972–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чен З.и другие. (2010) «Клещи (Acari: Ixodoidea: Argasidae, Ixodidae) из Китая», Experimental and Applied Acarology, 51: 393–404. [PubMed] [Google Scholar]
Чен З. и другие. (2012) «Морфологические, биологические и молекулярные характеристики бисексуальных и партеногенетических Haemaphysalis longicornis », Ветеринарная паразитология, 189: 344–52. [PubMed] [Google Scholar]
Чин С.С. и другие. (2015) «Гематологические и сывороточные биохимические параметры явно здоровых спасенных формозановых панголинов ( Manis pentadactyla pentadactyla )», Journal of Zoo and Wildlife Medicine, 46: 68–76.[PubMed] [Google Scholar]
Чу С. В. и другие. (2016) «Геномы панголинов и эволюция чешуек млекопитающих и иммунитет», Genome Research, 26: 1312–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
du Toit Z. и другие. (2017) «Митохондриальные геномы африканских панголинов и понимание эволюционных закономерностей и филогении семейства Manidae», BMC Genomics, 18: 746. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ферт К. и другие. (2014) «Обнаружение зоонозных патогенов и характеристика новых вирусов, переносимых Commensal Rattus norvegicus в Нью-Йорке», mBio, 5: e01933–01914.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Фуджита Р. и другие. (2017) «Выделение и характеристика вируса клещей Тарумизу: новый колвирус от клещей Haemaphysalis flava в Японии», Virus Research, 242: 131–40. [PubMed] [Google Scholar]
Гобер П. и другие. (2018) «Полная филогения панголинов: увеличение ресурсов для молекулярного отслеживания наиболее пострадавших млекопитающих на Земле», Journal of Heredity, 109: 347–59. [PubMed] [Google Scholar]
Годен Т.Дж. и другие. (2009) «Филогения живых и вымерших панголинов (Mammalia, Pholidota) и связанных таксонов: анализ на основе морфологии», Journal of Mammalian Evolution, 16: 235–305. [Google Scholar]
Goodpasture H.C. (1978) «Колорадская клещевая лихорадка: клинические, эпидемиологические и лабораторные аспекты 228 случаев заболевания в Колорадо в 1973–1974 годах», Annals of Internal Medicine, 88: 303–10. [PubMed] [Google Scholar]
Гиндон С. и другие. (2010) «Новые алгоритмы и методы оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0 ’, Систематическая биология, 59: 307–21. [PubMed] [Google Scholar]
Го В. П. и другие. (2013) «Филогения и происхождение хантавирусов, обитающих у летучих мышей, насекомоядных и грызунов», PLoS Pathogens, 9: e1003159. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Харви Э. и другие. (2018) «Обширное разнообразие РНК-вирусов у австралийских клещей», Журнал вирусологии, 93: e01358–18. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Хуа Л. и другие. (2015) «Разведение панголинов в неволе: текущее состояние, проблемы и перспективы на будущее», ZooKeys, 507: 99–114.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джабин Г. и другие. (2019) «Идентификация клеща Amblyomma javanense (Acari: Ixodidae) из китайского панголина: создание штрих-кода видов, филогенетический статус и его значение в судебной экспертизе дикой природы», Экспериментальная и прикладная акарология, 78: 461–7. [PubMed] [Google Scholar]
Джо В. К. и другие. (2019) «Эволюционно расходящийся пестивирус, лишенный гена N (Pro), системно заражает виды китов», Emerging Microbes & Infections, 8: 1383–92.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Като К., Стэндли Д. М. (2013) «Программное обеспечение для выравнивания множественных последовательностей MAFFT, версия 7: Улучшения в производительности и удобстве использования», Молекулярная биология и эволюция, 30: 772–80. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Космидер Р. и другие. (2013) « Echinococcus multilocularis Интродукция и распространение в дикой природе через импортированных бобров», Veterinary Record, 172: 606.2. [PubMed] [Google Scholar]
Кумар С.и другие. (2016) «MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets», Molecular Biology and Evolution, 33: 1870–4. [PubMed] [Google Scholar]
Ли Б. и другие. (2010) «Оценка экспрессии гена RNA-Seq с неопределенностью картирования считывания», Bioinformatics, 26: 493–500. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ли К. X. и другие. (2015) «Беспрецедентное геномное разнообразие РНК-вирусов у членистоногих выявляет происхождение РНК-вирусов с отрицательным смыслом», eLife, 4: e05378.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линь М. Ф. и другие. (2015) «Аспекты пищеварительной анатомии, потребления корма и пищеварения у китайского панголина ( Manis pentadactyla ) в зоопарке Тайбэя», Zoo Biology, 34: 262–70. [PubMed] [Google Scholar]
Лин Х. Д. и другие. (2012) «Миграция норвежских крыс привела к глобальному распространению сеульского хантавируса сегодня», Journal of Virology, 86: 972–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Лю П. и другие.(2019) «Вирусная метагеномика выявила вирус Сендай и коронавирусную инфекцию малайских панголинов ( Manis javanica )», Вирусы, 11: 979. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моенниг В., Бехер П. (2015) «Программы борьбы с пестивирусами: как далеко мы продвинулись и куда мы идем?», Обзоры исследований здоровья животных, 16: 83–7. [PubMed] [Google Scholar]
Мохапатра Р. К. и другие. (2016) «Контрольный список паразитов и бактерий, зарегистрированных у ящеров ( Manis sp.) ’, Journal of Parasitic Diseases, 40: 1109–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моутайлер С. и другие. (2016) «Разнообразие вирусов в Ixodes ricinus и характеристика нейротропного штамма вируса Eyach», Новые микробы и новые инфекции, 11: 71–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Пилер Э. Дж. и другие. (2015) «Анализ рисков импорта болезней животных — Обзор текущих методов и практики», Трансграничные и новые болезни, 62: 480–90.[PubMed] [Google Scholar]
Постель А. и другие. (2015) «Тесная связь пестивирусов жвачных животных и вируса классической чумы свиней», Emerging Infectious Diseases, 21: 668–72. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Цинь X. С. и другие. (2014) «Клещевой сегментированный РНК-вирус, содержащий сегменты генома, полученные от несегментированных вирусных предков», Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111: 6744–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ридпат Дж.Ф. и другие. (2008) «Заболевание репродуктивного тракта, связанное с инокуляцией беременных белохвостых оленей вирусом бычьей вирусной диареи», Американский журнал ветеринарных исследований, 69: 1630–6. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2016a) «Дивергентные вирусы, обнаруженные у членистоногих и позвоночных, пересматривают историю эволюции Flaviviridae и родственных вирусов», Journal of Virology, 90: 659–69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие.(2016b) «Новое определение виросферы РНК беспозвоночных», Nature, 540: 539–43. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2018) «Эволюционная история РНК-вирусов позвоночных», Nature, 556: 197–202. [PubMed] [Google Scholar]
Смит Д. Б. и другие. (2017) «Предлагаемый пересмотр таксономии рода Pestivirus , семейства Flaviviridae », Журнал общей вирусологии, 98: 2106–12. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Тауц Н. и другие.(2015) «Молекулярная биология пестивирусов», «Достижения в вирусных исследованиях», 93: 47–160. [PubMed] [Google Scholar]
Вальдазо-Гонсалес Б. и другие. (2007) «Генетическое и антигенное типирование изолятов вируса пограничных заболеваний у овец Пиренейского полуострова», Ветеринарный журнал, 174: 316–24. [PubMed] [Google Scholar]
Вилчек С., Нетлтон П. Ф. (2006) «Пестивирусы у диких животных», Ветеринарная микробиология, 116: 1–12. [PubMed] [Google Scholar]
Вахба Л. и другие. (2020) «Идентификация ниши панголина для коронавируса, подобного 2019-nCoV, с помощью обширного мета-метагеномного поиска», bioRxiv, doi: 10.1101 / 2020.02.08.939660. [Google Scholar]
Ван Х. и другие. (2019) «Полная последовательность генома вируса парагриппа 5 (PIV5) зондского панголина ( Manis Javanica ) в Китае», Journal of Wildlife Diseases, 55: 947–50. [PubMed] [Google Scholar]
Вайс С. и другие. (2017) «Новый связанный с колтивирусом вирус, выделенный из летучих мышей со свободным хвостом из Кот-д’Ивуара, способен инфицировать клетки человека in vitro», Virology Journal, 14: 181. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Уильямсон Б.Н. и другие. (2019) «Распространенность и штаммы вируса колорадской клещевой лихорадки у лесных клещей Скалистых гор в долине Биттеррут, штат Монтана», Трансмиссивные и зоонозные заболевания, 19: 694–702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Вонг М. и другие. (2020) «Доказательства рекомбинации коронавирусов, указывающие на происхождение nCoV-2019 у панголинов», bioRxiv , DOI: 10.1101 / 2020.02.07.939207.
Ву Ф. и другие. (2020) «Новый коронавирус, связанный с респираторным заболеванием человека в Китае», Nature, 579: 265–9.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
У З. и другие. (2012) «Анализ виромов для идентификации новых вирусов млекопитающих у видов летучих мышей из провинций Китая», Journal of Virology, 86: 10999–1012. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ядав П. Д. и другие. (2019) «Характеристика новых реовирусов Вируса Вад Медани (орбивирус) и вируса Кундала (колвирус), собранных из клещей Hyalomma anatolicum в Индии во время эпиднадзора за геморрагической лихорадкой Крымского Конго», Журнал вирусологии, 93: e00106–19.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чжан Х. и другие. (2015) «Молекулярное отслеживание конфискованных чешуек панголинов для сохранения и мониторинга незаконной торговли в Юго-Восточной Азии», Глобальная экология и сохранение, 4: 414–22. [Google Scholar]
Чжоу П. и другие. (2020) «Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом вероятного происхождения летучих мышей», Nature, 579: 270–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Недавно идентифицированные вирусные геномы у ящеров со смертельным исходом
Virus Evol.2020 Янв; 6 (1): veaa020.
, ^v1 , ^v2 , ^v1, ^v3 , ^v4, ^v1, ^v5, ^v4, 901 901 901 901 , ^v3
Wen-Hua Gao
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
Xian-Dan Lin
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
Ян-Мэй Чен
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
Chun-Gang Xie
^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай
Чжи-Чжоу Тан
^v1 Отдел зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
Цзя-Цзюнь Чжоу
^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай
Шуай Чен
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
Эдвард С. Холмс
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006, Австралия
Yong-Zhen Zhang
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v1 Департамент зоонозов, Национальный институт по контролю и профилактике инфекционных заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний, Пекин, 102206, Китай
^v2 Вэньчжоуский центр по контролю и профилактике заболеваний, Вэньчжоу, 325001, Чжэцзян, Китай
^v3 Шанхайский клинический центр общественного здравоохранения и школа естественных наук, Университет Фудань, Шанхай, 201052, Китай
^v4 Станция защиты дикой природы Цзиньхуа, Бюро лесного хозяйства Цзиньхуа, Цзиньхуа, 321000, Чжэцзян, Китай
^v5 Центр мониторинга лесных ресурсов Чжэцзян, Ханчжоу, 310020, Чжэцзян, Китай
^v6 Институт инфекционных заболеваний и биобезопасности Мари Башир, Школа наук о жизни и окружающей среде и Школа медицинских наук, Сиднейский университет, Сидней, Новый Южный Уэльс, 2006 год, Австралия
Вен-Хуа Гао, Сиань-Дан Линь и Ян-Мей Чен внесли равный вклад к этой работе.
Авторские права © Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/). 4.0 /), который разрешает некоммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь по адресу [email protected]. Эта статья цитируется в других статьях PMC.
Дополнительные материалы
veaa020_Supplementary_Data.
GUID: 9C1C82C7-9CA4-4D6E-83E6-59A44C7915D7
Заявление о доступности данных
Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и mt- были депонированы в этом исследовании генов последовательностей генов b. под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MK636874-MK636884», «start_term»: «MK636874», «end_term»: «MK636884», «start_term_id» «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365828-MN365832 «,» start_term » : «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117», «end_term_id»: «1812622121»}} MN365828-MN365832 и {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.
Abstract
Эпизоотические патогены представляют серьезную угрозу для многих видов диких животных, особенно в контексте быстро меняющейся окружающей среды. Панголины (отряд Pholidota) — млекопитающие, находящиеся под большой угрозой, в значительной степени из-за незаконной торговли дикими животными и растениями. В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера (три Manis javanica и один Manis pentadactyla ) с различными клиническими симптомами были спасены станцией защиты дикой природы Цзиньхуа в провинции Чжэцзян, Китай.Хотя трое из этих животных погибли, к счастью, одно выздоровело после 2 недель симптоматического лечения. Используя мета-транскриптомику в сочетании с полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), мы идентифицировали два новых РНК-вируса у двух мертвых ящеров. Геномный анализ показал, что эти вирусы были наиболее близки к пестивирусам и колтивирусам, хотя все еще генетически отличны друг от друга, с расхождением последовательностей более чем на 48 и 25 процентов на аминокислотном уровне, соответственно.Мы назвали эти вирус панголина Дунъян (DYPV) и вирус панголина Лишуй (LSPV) на основе места отбора проб и хозяев. Хотя известно, что колвивирусы (LSPV) передаются клещами, мы не обнаружили доказательств LSPV у клещей, взятых близко к месту сбора панголинов. Кроме того, хотя DYPV присутствовал в личинках клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у больных панголинов, они не были обнаружены в местной популяции клещей. Эпидемиологическое расследование показало, что оба новых вируса могли быть импортированы в результате незаконной международной торговли панголинами.Следовательно, эти данные указывают на то, что незаконный оборот дикой природы не только угрожает статусу популяций панголинов, но также может распространять эпизоотические патогены.
Ключевые слова: Ящеры, смертельная болезнь, пестивирус, колвирус, незаконная торговля дикими животными
1. Введение
Ящеры, также известные как чешуйчатые муравьеды (семейство: Manidae, отряд: Pholidota), уникальны среди млекопитающих из-за их перекрывающиеся чешуйки (сделанные из кератина) и имеют географическое распространение, которое включает части Азии и Африки (Gaudin et al.2009 г.). Во всем мире обитает всего восемь видов панголинов, четыре — в Азии, включая Китай, и четыре — в Африке. Растет интерес к благополучию панголинов, включая угрозы, связанные с браконьерством и вырубкой лесов в их естественной среде обитания (Hua et al. 2015). Самое главное, что панголины стали неудачными символами международной и внутренней незаконной торговли дикими животными и растениями, а также являются наиболее продаваемыми млекопитающими (Gaubert et al. 2018). Из восьми видов четыре занесены в список уязвимых, два находятся под угрозой исчезновения, а оставшиеся два находятся под угрозой исчезновения в Красном списке видов, находящихся под угрозой исчезновения Международного союза охраны природы (du Toit et al.2017).
Пестивирусы (семейство: Flaviviridae ) представляют собой оболочечные РНК-вирусы с сильно вариабельными одноцепочечными геномами положительно-смысловой РНК размером ~ 12,3 т.п.н., которые содержат одну большую открытую рамку считывания (ORF), кодирующую полипротеин из примерно 3900 аминокислот (аминокислотные остатки). ) по длине (Постел и др., 2015; Таутц и др., 2015). Некоторые пестивирусы (например, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус пограничной болезни, вирус классической чумы свиней) являются хорошо известными патогенами животных, вызывающими тяжелые заболевания, включая контагиозное геморрагическое заболевание у свиней и респираторное и репродуктивное заболевание крупного рогатого скота и овец (Vilcek and Nettleton 2006; Valdazo). -Gonzalez et al.2007; Менниг и Бехер 2015). Сообщалось также о заболеваниях диких животных (например, кабанов и оленей), вызываемых пестивирусами (Ridpath et al., 2008; Blome et al., 2017). После применения молекулярных и геномных методов обнаружения вирусов в последние годы был идентифицирован ряд новых пестивирусов, в том числе от летучих мышей, грызунов и морских свиней (Wu et al. 2012; Firth et al. 2014; Smith et al. 2017; Джо и др., 2019). Наконец, пестивирусоподобные вирусы также идентифицированы у членистоногих (Shi et al.2016a) и членистоногих, собранных у млекопитающих (Harvey et al. 2018). Вместе эти данные подчеркивают циркуляцию разнообразного диапазона пестивирусов в широком диапазоне животных-хозяев.
Колвирусы (род: Coltivirus , семейство: Reoviridae ) представляют собой двухцепочечные сегментированные РНК-вирусы. В настоящее время в этот род определены только два вируса: вирус колорадской клещевой лихорадки (CTFV), обнаруженный в Северной Америке, и вирус Eyach (EYAV) из Европы. Их геном РНК состоит из двенадцати сегментов.Оба вируса могут вызывать тяжелые заболевания у людей (Attoui et al. 2005; Moutailler et al. 2016) и передаются клещами (Attoui et al. 2002). Недавно было охарактеризовано несколько новых колтивирусов, в том числе вирус клещей Тарумизу от клещей Haemaphysalis flava в Японии (Fujita et al.2017), вирус Кундала от клещей Hyalomma anatolicum в Индии (Yadav et al.2019), вирус Шелли-Хедленд. (SHLV) от клещей Ixodes holocyclus в Австралии (Harvey et al.2018) и реовирус Тайского леса (TFRV) от летучих мышей со свободным хвостом ( Chaereophon aloysiisabaudiae ) в Кот-д’Ивуаре (Weiss et al., 2017). Следовательно, очевидно, что в природе существует большое разнообразие колтивирусов, и, вероятно, будет идентифицировано гораздо больше. Однако на сегодняшний день неизвестно, связаны ли колвирусы с болезнями диких животных.
Здесь мы выполнили мета-транскриптомный (то есть полное секвенирование РНК) анализ четырех больных панголинов, спасенных станцией защиты дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян в Китае в 2018 году.От этих животных мы идентифицировали и охарактеризовали новые вирусные агенты — пестивирус и колтивирус — от двух ящеров. Кроме того, мы проанализировали клинические особенности и патологические изменения, связанные с заболеванием у этих животных.
2. Материалы и методы
2.1 Больные ящеры и сбор образцов
В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). На станции эти панголины прошли лабораторное и клиническое обследование с последующим лечением.Хотя трое животных погибли, одно выздоровело через 2 недели лечения. Образцы крови и тканей были собраны у всех четырех животных, а клещи были собраны у двух (дополнительная таблица S1). Первоначально ящеры и клещи были идентифицированы до уровня видов опытными полевыми биологами, а затем подтверждены анализом последовательностей гена митохондриального цитохрома b (mt- cyt b) или митохондриального гена 16S рДНК, как описано ранее (Chen et al.2012; Guo и др., 2013).
Места отбора проб (красные кружки) больных ящеров из провинции Чжэцзян, Китай.
Это исследование было рассмотрено и одобрено этическим комитетом Национального института контроля и профилактики инфекционных заболеваний Китайского центра контроля и профилактики заболеваний (CDC). Все процедуры вскрытия и взятия проб строго соответствовали руководству по использованию и уходу за лабораторными животными Китайского центра контроля заболеваний (SYXK (Jing) 2017-0021).
2.2 Построение библиотеки РНК, секвенирование и анализ данных
Общая РНК была извлечена из образцов крови, тканей органов и фекалий, а также из клещей с использованием Nucleo Spin RNA Blood (MN, Düren, Германия), RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) и TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) соответственно, следуя инструкциям производителя.ДНК экстрагировали с помощью набора DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Для конструирования библиотеки РНК аликвоты раствора РНК объединяли в равных количествах (дополнительная таблица S2). Набор SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 (TaKaRa, Далянь, Китай) и набор KAPA RNA HyperPrep с RiboErase (HMR; KAPA, Уилмингтон, Массачусетс, США) использовали для создания библиотек РНК из образцов крови, тканей органов и фекалий. соответственно. Рибосомную (r) РНК удаляли с использованием набора Ribo-Zero-Gold (HMR) (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).Секвенирование парных концов (150 п.н.) каждой библиотеки РНК проводили на платформе HiSeqX10 (Illumina).
Биоинформатический анализ считываний секвенирования был проведен, как описано ранее (Shi et al. 2016a). Вкратце, считывания секвенирования с фильтрацией адаптера и качеством были собраны de novo с использованием программы Trinity (версия 2.5.1). Вирусные контиги были идентифицированы путем сравнения (с использованием blastn и Diamond blastx) с базой данных неизбыточных нуклеотидов (nt) и белков (nr) NCBI со значениями e- , установленными на 1 × 10 ^— ¹⁰ и 1 × 10 ^— ⁴ соответственно.Вероятно контаминирующие вирусные последовательности были исключены из мета-транскриптомных данных (дополнительная таблица S2) с использованием методов, описанных ранее (Asplund et al.2019). Кроме того, была исключена высокая частота последовательностей ретровирусов, поскольку большинство из них, вероятно, были генами хозяина, а некоторые из них могли загрязнять вирусные последовательности, такие как последовательности альфаретровирусов и гаммаретровирусов, вероятно, связанные с лабораторными компонентами (Asplund et al., 2019 ). Наконец, предполагаемые вирусы, присутствующие в образцах крови, печени, селезенки, легких и почек, были подтверждены с помощью ПЦР.Количество транскриптов, сопоставленных с каждым вирусным контигом, определяли с помощью программы RSEM (Li et al. 2010), реализованной в Trinity.
2.3 ПЦР и секвенирование
Суммарную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для одностадийной ОТ-ПЦР (TaKaRa). Вирусная РНК у клещей была обнаружена с помощью вложенной ПЦР, нацеленной на консервативные области гена РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) как пестивируса, так и колтивируса. Для восстановления полных вирусных геномов были сконструированы праймеры на основе собранных контигов пестивируса и колвируса, полученных с помощью мета-транскриптомики (дополнительная таблица S3).Концы генома определяли с помощью наборов 5ʹ / 3ʹ RACE (TaKaRa).
Набор для экстракции геля QIAquick (Qiagen) использовали для очистки продуктов ПЦР перед секвенированием. Очищенную ДНК длиной <700 п.н. секвенировали напрямую, а ДНК длиной более 700 п.н. сначала клонировали в вектор pMD18-T (TaKaRa), а затем трансформировали в компетентные клетки JM109-143. Для каждого образца было отобрано не менее трех клонов для секвенирования.
2.4 Филогенетический анализ
Вирусные последовательности были выровнены с использованием алгоритма E-INS-i, реализованного в MAFFT версии 7 (Katoh and Standley 2013).Затем неоднозначно выровненные области удаляли с помощью программы TrimAl (Capella-Gutierrez et al. 2009). Модель наилучшего соответствия (LG + Γ) эволюции последовательности аминокислот была оценена с использованием MEGA версии 7.0 (Kumar et al., 2016). Затем филогенетические деревья оценивались с использованием метода максимального правдоподобия (ML), реализованного в PhyML версии 3.0 (Guindon et al. 2010) со значениями поддержки бутстрапа, рассчитанными на основе 1000 повторяющихся деревьев. Значения начальной загрузки> 70% считались значимыми. Идентичность между последовательностями nt и aa рассчитывалась с помощью программы MegAlign, реализованной в программном пакете Lasergene v5.0 (ДНКстар).
3. Результаты
3.1 Болезнь и клинические особенности больных ящеров
В период с июля по август 2018 года четыре больных диких ящера были отправлены на станцию спасения дикой природы Цзиньхуа провинции Чжэцзян, Китай (). Для простоты они были названы здесь «1-Дунъян», «2-Лишуй», «3-Жуйан» и «4-Учэн» в зависимости от найденного местоположения. Морфологическое исследование и молекулярная идентификация показали, что эти панголины принадлежат к панголинам зонд, Manis javanica (1-Dongyang, 2-Lishui и 4-Wucheng) и китайскому панголину Manis pentadactyla (3-Ruian).Детали и клинические признаки этих ящеров описаны в. Все четыре панголина проявляли анорексию при отправке на спасательную станцию, а у 1-Дунъян и 2-Лишуй наблюдались подергивания и слюнки. Кровоизлияния и поражения кожи были очевидны у 1-Дунъян, тогда как у 2-Лишуй были обнаружены отеки на передних ногах. Наконец, панголин 4-Wucheng проявлял лихорадку и содержал кожные поражения, тогда как панголин 3-Ruian демонстрировал относительно легкие клинические признаки.
Таблица 1.
Справочная информация, клинические особенности и обследование спасенных ящеров.
Pangolin ID Вид Пол / возраст Штат Клинические особенности Клинический осмотр
Рентген Гематологический анализ
Гематологический анализ М. Яваница Мужчина / взрослый Мертвый Анорексия, подергивание, слюнотечение, кровоизлияние, ^a и поражения кожи ^b Нормальный PLT ↓, GLU ↓, холестерин ↓ и амилаза ↑ ↑ Лишуй М.Яваника Женский / взрослый Мертвый Анорексия, подергивание, слюноотделение и отек ^c Большая область тени на левом легком АЛТ ↑, АСТ ↑, амилаза ↑ и общий билирубин ↑ 3-Руян M. pentadactyla Самка / несовершеннолетняя Живой Анорексия, беспокойство и отек ^c — —
4-Wucheng М.Яваника Женский / взрослый Мертвый Анорексия, лихорадка и кожные поражения ^b Камни в желудке PLT ↓, ALP ↑, BUN ↑
Рентгенологические тесты показали большую площадь тень в левом легком панголина 2-Лишуй, указывающая на пневмонию (дополнительный рис. S1). Из-за отсутствия здоровых панголинов в качестве контроля в этом исследовании мы использовали биохимические показатели крови здоровых формозанских панголинов (Chin et al. 2015) в качестве эталона.1-Dongyang показал значительное снижение количества тромбоцитов, глюкозы и холестерина, тогда как 2-Lishui продемонстрировал значительное увеличение уровней аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и амилазы, но снижение общего билирубина. Кроме того, в 4-Wucheng (и в дополнительной таблице S4) наблюдались более низкое количество PLT и более высокие уровни щелочных фосфатаз и азота мочевины крови. Хотя этих панголинов тщательно реанимировали на спасательной станции, только панголин 3-Руян выздоровел.Панголины 1-Дунъян, 2-Лишуй и 4-Учэн умерли на 3, 16 и 5 дней после поступления соответственно.
3.2 Патологические изменения у мертвых ящеров
После вскрытия наблюдали застой в печени и легких панголина 1-Дунъян, хотя в других внутренних органах явных патологических изменений не наблюдалось. В соответствии с очевидной гиперемией, гистологические тесты выявили кровоизлияние в печень и легкие (дополнительный рисунок S2). Кроме того, наблюдались пикнотическое ядро печеночных клеток, пикноз лимфоцитов в селезенке, некроз печеночной пластинки и некроз клубочков.Наконец, дегенерация коллагеновых волокон наблюдалась в печени, селезенке и легких (дополнительный рис. S2).
Для панголина 2-Lishui, очевидный некроз наблюдался в легких, почках и селезенке, а застойные явления наблюдались в печени (дополнительный рис. S2) в дополнение к мезентериальной лимфаденопатии. Примечательно, что в обоих легких присутствовало много молочно-белых поражений, особенно в левой нижней доле (1 × 2 см). Гистологические тесты выявили некроз печени, селезенки, легких, почек, трахеи и тонкого кишечника, а также кровоизлияние в легкое (дополнительный рис.S2).
3.3 Идентификация вирусных агентов с помощью мета-транскриптомики и ПЦР
Для идентификации возможных этиологических агентов заболевания у четырех ящеров были созданы восемь мета-транскриптомных библиотек из образцов крови, печени, селезенки, легких, почек и фекалий. генерируя в общей сложности 306 908 179 считываний последовательностей с парными концами. Сборка De novo выявила высокую распространенность пестивирусного и колвирусоподобного вируса во всех мета-транскриптомных библиотеках панголина 1-Dongyang и 2-Lishui, что составляет 6–80 и 1–29 процентов от общего числа вирусных контигов. соответственно (дополнительная таблица S2).Примечательно, что, несмотря на присутствие других предполагаемых вирусов (дополнительная таблица S2), только пестивирусный и колвирусоподобный вирус можно было успешно идентифицировать с помощью ПЦР. Поскольку эти предполагаемые вирусные последовательности не могли быть подтверждены с помощью ПЦР и, вероятно, были результатом контаминации; следовательно, они не были возможными этиологическими агентами заболевания у четырех ящеров. Дополнительные анализы показали, что новый пестивирус присутствует только в 1-Dongyang, тогда как новый колтивирус присутствует только в 2-Lishui. В библиотеках, созданных из 1-Dongyang и 2-Lishui, не было обнаружено потенциальных бактериальных и грибковых патогенов.Наконец, не было обнаружено обильных вирусных, бактериальных и грибковых последовательностей в библиотеках, созданных из образцов крови и тканей 3-Ruian и 4-Wucheng (дополнительная таблица S2).
Генетический анализ показал, что новый пестивирус имел <57% сходства с известными пестивирусами, тогда как новый колвирус показал <68% сходства с известными колвирусами. Учитывая, что они родственны, но явно генетически отличаются от известных представителей Pestivirus и Coltivirus (см. Ниже), мы обозначили эти два недавно идентифицированных вируса как вирус панголина Dongyang (DYPV) и вирус панголина Lishui (LSPV), соответственно. , отражающие их виды-хозяева и географическое положение выборки.Попытки выделения вируса культурой клеток (BHK-21, Vero-E6 и DH82) и инокуляции мышей-сосунков оказались безуспешными.
Чтобы определить распределение вновь идентифицированных вирусов, каждый орган был протестирован с помощью ПЦР. Следовательно, DYPV был идентифицирован в сердце, печени, селезенке, легких, почках, головном мозге, крови, мазке из горла и фекалиях, взятых у панголина 1-Dongyang, а также у нимфных клещей ( Amblyomma javanense ), собранных у этого животного. Интересно, что вирус не был идентифицирован у взрослых клещей, взятых также из 1-Dongyang.Аналогичным образом, LSPV также был идентифицирован в широком диапазоне тканевых органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки, кровь, мазок из горла и фекальные массы 2-Lishui.
3.4 Генетические особенности DYPV и LSPV
Для дальнейшей характеристики обоих вирусов были разработаны праймеры на основе последовательностей, полученных здесь, и последовательностей родственных вирусов, описанных ранее. Таким образом мы смогли восстановить полные геномы DYPV от 1-Dongyang и клещей ( A. javanense ), собранные от этого животного.Генетические особенности DYPV описаны в. Примечательно, что вирусы, полученные от ящеров и клещей, были тесно связаны друг с другом, хотя все же имели почти 2-процентное различие в последовательностях нуклеотидов. Кроме того, оба вируса были генетически и филогенетически отличными от известных вирусов рода Pestivirus , с отличиями> 43% nt и> 48% aa (дополнительная таблица S5). Как и в случае классических пестивирусов, геном DYPV кодирует двенадцать белков. Все известные сайты расщепления протеазы NS3 наблюдались в DYPV (дополнительный рис.S3). Кроме того, сайт расщепления NS4A-NS4B, расположенный в позиции L ₂₄₂₆ / A ₂₄₂₇ в BVDV1 и L ₂₃₃₆ / A ₂₃₃₇ в CSFV, появился в позиции L ₂₃₁₅ / K ₂₃₁₆ сайт. в DYPV (дополнительный рисунок S3).
Схема аннотированных геномов DYPV и LSPV. (а) Сравнение генома DYPV и известных пестивирусов. (b) Сравнение генома между LSPV и известными колтивирусами.
Примечательно, что, несмотря на использование как мета-транскриптомных методов, так и методов ПЦР, только девять сегментов генома (1–5 и 8–11) были получены от нового колвируса — у животного 2-Lishui — и наша попытка восстановить сегменты 6, 7 и 12 не удалось.Подробно генетические особенности LSPV описаны в. Все восстановленные сегменты имели консенсусные последовательности (GAG / AUU / A) на 5ʹ-конце и (G / CAGUC) и 3ʹ-конце () соответственно. Однако последовательности генома LSPV отличались от таковых у признанных колтивирусов, с сходством <75% (дополнительная таблица S6). Как и другие колвирусы, сегмент 9 LSPV также содержал две ORF. Однако последовательности, примыкающие к стоп-кодону UGA, которые являются сигналом считывания, отличались от известных колтивирусов.Примечательно, однако, что похожая картина наблюдалась у SHLV (), ближайшего родственника LSPV, который был взят от клещей в Австралии.
Характеристики генома LSPV. (а) Консервация последовательности 5ʹ- и 3ʹ-концевых 10 нт в геномных сегментах генома LSPV была проанализирована и визуализирована с помощью Weblogo. (b) Информация о последовательности вокруг стоп-кодона сегмента VP9 LSPV и известного колвируса.
3.4 Филогенетические отношения вновь идентифицированных вирусов
Чтобы определить эволюционные отношения между вновь идентифицированными и ранее признанными вирусами, мы оценили филогенетические деревья ML на основе последовательностей aa ().
деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей (полипротеина) и генов NS3 DYPV и других известных пестивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.
В филогении, основанном на последовательностях аминокислотных последовательностей всех кодирующих последовательностей и генов NS3, DYPV сформировал четко различимый клон, подтверждая, что он представляет собой новый пестивирус.Примечательно, что линия DYPV занимала базовое положение внутри линии парнокопытных, при этом пестивирусы, присутствующие у грызунов и летучих мышей, образуют более расходящиеся линии. В филогенезе, основанном на аминокислотных последовательностях гена RdRp и предполагаемого гена метилтрансферазы РНК (VP2;), LSPV также образовали отдельную линию в пределах рода Coltivirus . Интересно, однако, что вирус был наиболее тесно связан с мысом Шелли, идентифицированным у клещей ( I. holocyclus ), взятых у длинноносого бандикут (сумчатое животное) в Австралии (Harvey et al.2018).
деревьев ML на основе аминокислотных последовательностей генов RdRp и предполагаемых генов РНК-метилтрансферазы (VP2) LSPV и других известных колтивирусов. Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значительными и отображались на деревьях.
3.5 Филогенетический анализ последовательностей панголинов
Зондский панголин ( M. javanica ) географически широко распространен в Юго-Восточной Азии, включая Индонезию (Ява, Суматра, Борнео и Малые Зондские острова), Малайзию, Сингапур и др. Филиппины, Таиланд, Вьетнам, Лаос и Камбоджа (Zhang et al.2015), тогда как китайские панголины ( M. pentadactyla ) относительно обычны в Южном Китае (Choo et al. 2016). Чтобы определить вероятное географическое происхождение этих больных ящеров, последовательности гена mt- cyt b были амплифицированы из их тканей. Генетический анализ показал, что все последовательности, полученные от зондских ящеров в этом исследовании, попали в группу M. javanica , в то время как китайские ящеры сгруппированы с последовательностями M. pentadactyla . Примечательно, что три отобранных здесь зондских панголина были очень близки к панголинам из Индонезии, Малайзии, Таиланда и Сингапура — 99.9, 99,7 и 99,9% идентичности последовательностей нуклеотидов соответственно, что указывает на то, что они, скорее всего, были (незаконно) импортированы в Китай из-за границы. Напротив, панголин 3-Ruian ( M. pentadactyla ) сгруппировался вместе с панголином из Тайваня / Китая с идентичностью последовательностей на 99,1%, что позволяет предположить, что это животное не было импортировано. Поскольку последовательности, относящиеся к митохондриальной 16S рДНК A. javanense , не были доступны, мы не смогли определить происхождение клещей A. javanense , собранных у больных зондских ящеров.Следовательно, следует рассмотреть системные усилия по созданию всеобъемлющих баз данных для определения видов членистоногих-переносчиков и в качестве инструмента для определения географического происхождения собранных членистоногих.
3.6 Молекулярное исследование DYPV и LSPV у местных клещей
Поскольку DYPV был идентифицирован у клещей ( A. javanense ), собранных у панголина 1-Dongyang, и LSPV был тесно связан с SHLV, также идентифицированным у клещей ( I . holocyclus ) из Австралии, мы собирали клещей в местах, где были обнаружены больные ящеры.Следовательно, было собрано 452 клеща, представляющих 7 видов, в том числе 220 Haemaphysalis hystricis , 147 Rhipicephalus microplus , 49 Haemaphysalis longicornis , 11 Ixodes granulatus , 11 Ranguicephalus Haemaphysalis mageshimaensis . К сожалению, ни DYPV, ни LSPV не были идентифицированы у этих клещей с помощью мета-транскриптомики и вложенной ОТ-ПЦР.
4.Обсуждение
Ящеры насекомоядны, ведут преимущественно ночной образ жизни и питаются почти исключительно муравьями и термитами, с сильным предпочтением определенных видов насекомых (Lin et al. 2015; Choo et al. 2016). Восемь видов ящеров обитают в Африке и Азии, утрата среды обитания и изменения в их среде обитания серьезно сказываются на статусе их популяции. Что наиболее важно, на панголинов сильно повлияла незаконная международная и внутренняя торговля дикими животными и растениями для традиционной медицины или мяса (Zhang et al.2015). Следовательно, панголины занесены в Красный список исчезающих видов МСОП как уязвимые, находящиеся под угрозой исчезновения или находящиеся в критическом состоянии (du Toit et al., 2017). Примечательно, что панголинам также могут угрожать эпизоотические патогены, присутствующие либо в их первоначальной среде обитания, либо в новой среде после перемещения. Действительно, перемещение или торговля домашними и дикими животными играет важную роль в распространении многих эпизоотических патогенов (Lin et al. 2012; Kosmider et al. 2013; Peeler et al.2015).
В этом исследовании было обнаружено, что четыре панголина — три M. javanica , вероятно, из Индонезии, Малайзии и Таиланда, и один M. pentadactyla , вероятно местного происхождения, — страдали болезнью и были отправлены в местную спасательную станцию. для лечения. К сожалению, трое животных погибли, а одно выздоровело. На сегодняшний день сообщения о болезни панголина редки и в основном ограничиваются болезнями, вызываемыми бактериями и паразитами (Mohapatra et al., 2016; Jabin et al., 2019). Нет доступной литературы по вирусным инфекциям панголинов до недавнего выявления вируса парагриппа 5, вируса Сендай и коронавируса зондских панголинов в Китае (Liu et al.2019; Wang et al. 2019). Используя комбинацию мета-транскриптомных и ПЦР-методов, мы идентифицировали два новых РНК-вируса — пестивирус и колвирус — у двух мертвых ящеров. Судя по клиническим признакам (), все четыре панголина страдали инфекционным заболеванием. Однако, поскольку у этих животных не было получено полных клинических данных и лабораторных параметров, мы не могли четко определить заболевание, которым они страдали.
Пестивирусы — хорошо известные патогены животных, которые наносят значительный экономический ущерб, заражая как домашних (например,грамм. свиньи, крупный рогатый скот, овцы и козы) и диких (например, кабанов и жвачных) животных (Vilcek and Nettleton 2006). Пестивирусные инфекции могут быть субклиническими или вызывать ряд клинических признаков, включая острую диарею, острый геморрагический синдром, острое смертельное заболевание, а также болезнь истощения. Здесь новый пестивирус, обозначенный как DYPV, был идентифицирован во многих органах одного из больных ящеров [1-Dongyang ( M. javanica )], который имел явные патологические изменения. Филогенетический анализ показывает, что он представляет нового представителя рода Pestivirus .Хотя требуются более подробные подтверждающие результаты, эти данные предполагают, что DYPV-подобные пестивирусы могут быть ответственны за геморрагическое заболевание, наблюдаемое у ящеров.
На сегодняшний день принято считать, что позвоночные животные, а не беспозвоночные, являются основными хозяевами пестивирусов (Smith et al. 2017). Однако недавно у клещей был обнаружен новый пестивирус, названный вирусом Fairfax Lookout ( Ixodes trichosuri ). Однако, учитывая его филогенетическое положение рядом с пестивирусами млекопитающих, а также его чрезвычайно низкую численность, было высказано предположение, что вирус был связан с позвоночным хозяином, а не с самим клещом (Harvey et al.2018). В этом исследовании DYPV был идентифицирован не только у ящеров, но и у нимфных клещей, собранных у ящеров. Однако DYPV не был обнаружен у взрослых клещей, взятых также у панголина 1-Dongyang. Интересно, что хотя DYPV от клещей был тесно связан с образцом, взятым от панголинов, в вирусном геноме имелось около 2% различий нуклеотидов, что позволяет предположить, что они разделены несколькими событиями передачи. Филогенетический анализ показал, что панголины Sunda, включая панголина 1-Dongyang, скорее всего, были импортированы в Китай из Индонезии, Малайзии и Филиппин ().Кроме того, клещей A. javanense не были обнаружены в провинции Чжэцзян (Chen et al. 2010), DYPV не был идентифицирован у местных собранных клещей, и мы не наблюдали этот вирус в предыдущих крупномасштабных исследованиях выборки клещей (Li et al. 2015; Ши и др., 2016a, b, 2018). В совокупности эти наблюдения предполагают, что вирус, вероятно, был завезен из-за границы с ящерами, незаконно проданными.
ML-дерево на основе последовательностей нуклеотидов гена mt- cyt b четырех панголинов и других известных панголинов.Цифры на узлах указывают значения поддержки начальной загрузки после 1000 репликаций. Значения бутстрапа выше 70% считались значимыми и отображались на деревьях.
Колвирусы — хорошо известные клещевые патогены, которые могут вызывать болезни человека. Например, CTFV вызывает легкое лихорадочное заболевание или более тяжелое заболевание, включая инфекцию центральной нервной системы и / или геморрагическую лихорадку (Goodpasture et al. 1978; Attoui et al. 2005). Кроме того, инфекции EYAV были связаны с неврологическими заболеваниями человека (Moutailler et al.2016). Примечательно, что хотя некоторые колвирусы (например, CTFV, EYAV, TFRV) были обнаружены в дикой природе (например, летучие мыши и грызуны), нет четких доказательств того, что эти вирусы могут вызывать заболевания у животных (Moutailler et al.2016; Weiss et al. 2017; Уильямсон и др., 2019). В этом исследовании новый колвирус, названный LSPV, был идентифицирован у одного из больных ящеров [2-Lishui ( M. javanica )]. Учитывая высокое содержание LSPV в мета-транскриптомных данных в сочетании с клиническими признаками и патологическими изменениями, появившимися у панголина (2-Lishui), а также обнаружение LSPV в нескольких органах, наши данные позволяют предположить, что LSPV, возможно, вызвала системная инфекция и гибель рассматриваемого панголина, хотя это необходимо будет подтвердить дополнительными данными.
Принято считать, что геном колвируса состоит из двенадцати сегментов линейной двухцепочечной РНК (Fujita et al. 2017). Недавно у летучих мышей со свободным хвостом был обнаружен новый колвирус, лесной реовирус (TFRV) ( C. aloysiisabaudiae ; Weiss et al.2017). Интересно, что в геноме вируса отсутствуют сегменты 6, 7 и 12, и было высказано предположение, что эти отсутствующие сегменты не были идентифицированы, вероятно, из-за низкого сходства между TFRV и известными колтивирусами (Weiss et al.2017). Поразительно, как и в случае с TFRV, мы не смогли идентифицировать вирусные сегменты 6, 7 и 12 в LSPV, несмотря на использование методов, которые ранее позволили получить полный геном сильно дивергентного вируса клещей Jingmen (Qin et al. 2014). Следовательно, очевидно, что необходимы дополнительные исследования, чтобы сделать вывод, действительно ли эти сегменты отсутствуют в LSPV и TFRV. Наконец, поскольку панголин 2-Lishui мог быть импортирован из Индонезии (), возможно, что LSPV, как и DYPV, также был импортирован в Китай.
Наконец, несмотря на некоторую дискуссию о роли ящеров в возникновении нового коронавируса (тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2, SARS-CoV-2; Wahba et al.2020; Wong et al. 2020), являющейся причиной вспышки коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) (Wu et al.2020; Zhou et al.2020), мы не обнаружили коронавирусов у этих ящеров метатранскриптомными методами и методами ПЦР. Следовательно, необходимы дополнительные усилия, чтобы сделать вывод о роли ящеров в передаче SARS-CoV-2.
Доступность данных
Все последовательности вирусного генома, 16S рДНК и последовательности гена mt- cyt b, созданные в этом исследовании, депонированы в GenBank под номерами доступа {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs «: {» текст «:» MK636874-MK636884 «,» start_term «:» MK636874 «,» end_term «:» MK636884 «,» start_term_id «:» 1815408708 «,» end_term_id «:» 1815408729 «}} MK636874-MK636884, {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «MN365828-MN365832», «start_term»: «MN365828», «end_term»: «MN365832», «start_term_id»: «1812622117 «,» end_term_id «:» 1812622121 «}} MN365828-MN365832 и {» type «:» entrez-nucleotide-range «,» attrs «: {» text «:» MN365833-MN365836 «,» start_term «:» MN365833 «,» end_term «:» MN365836 «,» start_term_id «:» 1812757480 «,» end_term_id «:» 1817956800 «}} MN365833-MN365836.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81861138003, 31930001 и 81672057) и Специального национального проекта по изучению основных ресурсов Китая (2019ФГ) 101500. E.C.H. был профинансирован стипендией австралийского лауреата ARC (FL170100022).
Конфликт интересов: Нет конфликта интересов.
Дополнительные материалы
veaa020_Supplementary_Data
Ссылки
Асплунд М.и другие. (2019) «Загрязнение вирусных последовательностей при высокопроизводительном секвенировании вирусов: исследование связи 700 библиотек для секвенирования», Clinical Microbiology and Infection, 25: 1277–85. [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие. (2002) «Genus Coltivirus (Family Reoviridae ): Genomic and Morphologic Characterization of Old World and New World Viruses», Archives of Virology, 147: 533–61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Аттуи Х. и другие.(2005) «Колвирусы и сеадорнавирусы в Северной Америке, Европе и Азии», Новые инфекционные заболевания, 11: 1673–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Бломе С. и другие. (2017) «Классическая чума свиней — обновленный обзор», Вирусы, 9: 86. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Капелла-Гутьеррес С. и другие. (2009) «trimAl: Инструмент для автоматического выравнивания выравнивания в крупномасштабных филогенетических анализах», Bioinformatics, 25: 1972–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чен З.и другие. (2010) «Клещи (Acari: Ixodoidea: Argasidae, Ixodidae) из Китая», Experimental and Applied Acarology, 51: 393–404. [PubMed] [Google Scholar]
Чен З. и другие. (2012) «Морфологические, биологические и молекулярные характеристики бисексуальных и партеногенетических Haemaphysalis longicornis », Ветеринарная паразитология, 189: 344–52. [PubMed] [Google Scholar]
Чин С.С. и другие. (2015) «Гематологические и сывороточные биохимические параметры явно здоровых спасенных формозановых панголинов ( Manis pentadactyla pentadactyla )», Journal of Zoo and Wildlife Medicine, 46: 68–76.[PubMed] [Google Scholar]
Чу С. В. и другие. (2016) «Геномы панголинов и эволюция чешуек млекопитающих и иммунитет», Genome Research, 26: 1312–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
du Toit Z. и другие. (2017) «Митохондриальные геномы африканских панголинов и понимание эволюционных закономерностей и филогении семейства Manidae», BMC Genomics, 18: 746. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ферт К. и другие. (2014) «Обнаружение зоонозных патогенов и характеристика новых вирусов, переносимых Commensal Rattus norvegicus в Нью-Йорке», mBio, 5: e01933–01914.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Фуджита Р. и другие. (2017) «Выделение и характеристика вируса клещей Тарумизу: новый колвирус от клещей Haemaphysalis flava в Японии», Virus Research, 242: 131–40. [PubMed] [Google Scholar]
Гобер П. и другие. (2018) «Полная филогения панголинов: увеличение ресурсов для молекулярного отслеживания наиболее пострадавших млекопитающих на Земле», Journal of Heredity, 109: 347–59. [PubMed] [Google Scholar]
Годен Т.Дж. и другие. (2009) «Филогения живых и вымерших панголинов (Mammalia, Pholidota) и связанных таксонов: анализ на основе морфологии», Journal of Mammalian Evolution, 16: 235–305. [Google Scholar]
Goodpasture H.C. (1978) «Колорадская клещевая лихорадка: клинические, эпидемиологические и лабораторные аспекты 228 случаев заболевания в Колорадо в 1973–1974 годах», Annals of Internal Medicine, 88: 303–10. [PubMed] [Google Scholar]
Гиндон С. и другие. (2010) «Новые алгоритмы и методы оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0 ’, Систематическая биология, 59: 307–21. [PubMed] [Google Scholar]
Го В. П. и другие. (2013) «Филогения и происхождение хантавирусов, обитающих у летучих мышей, насекомоядных и грызунов», PLoS Pathogens, 9: e1003159. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Харви Э. и другие. (2018) «Обширное разнообразие РНК-вирусов у австралийских клещей», Журнал вирусологии, 93: e01358–18. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Хуа Л. и другие. (2015) «Разведение панголинов в неволе: текущее состояние, проблемы и перспективы на будущее», ZooKeys, 507: 99–114.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джабин Г. и другие. (2019) «Идентификация клеща Amblyomma javanense (Acari: Ixodidae) из китайского панголина: создание штрих-кода видов, филогенетический статус и его значение в судебной экспертизе дикой природы», Экспериментальная и прикладная акарология, 78: 461–7. [PubMed] [Google Scholar]
Джо В. К. и другие. (2019) «Эволюционно расходящийся пестивирус, лишенный гена N (Pro), системно заражает виды китов», Emerging Microbes & Infections, 8: 1383–92.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Като К., Стэндли Д. М. (2013) «Программное обеспечение для выравнивания множественных последовательностей MAFFT, версия 7: Улучшения в производительности и удобстве использования», Молекулярная биология и эволюция, 30: 772–80. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Космидер Р. и другие. (2013) « Echinococcus multilocularis Интродукция и распространение в дикой природе через импортированных бобров», Veterinary Record, 172: 606.2. [PubMed] [Google Scholar]
Кумар С.и другие. (2016) «MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets», Molecular Biology and Evolution, 33: 1870–4. [PubMed] [Google Scholar]
Ли Б. и другие. (2010) «Оценка экспрессии гена RNA-Seq с неопределенностью картирования считывания», Bioinformatics, 26: 493–500. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ли К. X. и другие. (2015) «Беспрецедентное геномное разнообразие РНК-вирусов у членистоногих выявляет происхождение РНК-вирусов с отрицательным смыслом», eLife, 4: e05378.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линь М. Ф. и другие. (2015) «Аспекты пищеварительной анатомии, потребления корма и пищеварения у китайского панголина ( Manis pentadactyla ) в зоопарке Тайбэя», Zoo Biology, 34: 262–70. [PubMed] [Google Scholar]
Лин Х. Д. и другие. (2012) «Миграция норвежских крыс привела к глобальному распространению сеульского хантавируса сегодня», Journal of Virology, 86: 972–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Лю П. и другие.(2019) «Вирусная метагеномика выявила вирус Сендай и коронавирусную инфекцию малайских панголинов ( Manis javanica )», Вирусы, 11: 979. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моенниг В., Бехер П. (2015) «Программы борьбы с пестивирусами: как далеко мы продвинулись и куда мы идем?», Обзоры исследований здоровья животных, 16: 83–7. [PubMed] [Google Scholar]
Мохапатра Р. К. и другие. (2016) «Контрольный список паразитов и бактерий, зарегистрированных у ящеров ( Manis sp.) ’, Journal of Parasitic Diseases, 40: 1109–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Моутайлер С. и другие. (2016) «Разнообразие вирусов в Ixodes ricinus и характеристика нейротропного штамма вируса Eyach», Новые микробы и новые инфекции, 11: 71–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Пилер Э. Дж. и другие. (2015) «Анализ рисков импорта болезней животных — Обзор текущих методов и практики», Трансграничные и новые болезни, 62: 480–90.[PubMed] [Google Scholar]
Постель А. и другие. (2015) «Тесная связь пестивирусов жвачных животных и вируса классической чумы свиней», Emerging Infectious Diseases, 21: 668–72. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Цинь X. С. и другие. (2014) «Клещевой сегментированный РНК-вирус, содержащий сегменты генома, полученные от несегментированных вирусных предков», Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111: 6744–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ридпат Дж.Ф. и другие. (2008) «Заболевание репродуктивного тракта, связанное с инокуляцией беременных белохвостых оленей вирусом бычьей вирусной диареи», Американский журнал ветеринарных исследований, 69: 1630–6. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2016a) «Дивергентные вирусы, обнаруженные у членистоногих и позвоночных, пересматривают историю эволюции Flaviviridae и родственных вирусов», Journal of Virology, 90: 659–69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие.(2016b) «Новое определение виросферы РНК беспозвоночных», Nature, 540: 539–43. [PubMed] [Google Scholar]
Ши М. и другие. (2018) «Эволюционная история РНК-вирусов позвоночных», Nature, 556: 197–202. [PubMed] [Google Scholar]
Смит Д. Б. и другие. (2017) «Предлагаемый пересмотр таксономии рода Pestivirus , семейства Flaviviridae », Журнал общей вирусологии, 98: 2106–12. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Тауц Н. и другие.(2015) «Молекулярная биология пестивирусов», «Достижения в вирусных исследованиях», 93: 47–160. [PubMed] [Google Scholar]
Вальдазо-Гонсалес Б. и другие. (2007) «Генетическое и антигенное типирование изолятов вируса пограничных заболеваний у овец Пиренейского полуострова», Ветеринарный журнал, 174: 316–24. [PubMed] [Google Scholar]
Вилчек С., Нетлтон П. Ф. (2006) «Пестивирусы у диких животных», Ветеринарная микробиология, 116: 1–12. [PubMed] [Google Scholar]
Вахба Л. и другие. (2020) «Идентификация ниши панголина для коронавируса, подобного 2019-nCoV, с помощью обширного мета-метагеномного поиска», bioRxiv, doi: 10.1101 / 2020.02.08.939660. [Google Scholar]
Ван Х. и другие. (2019) «Полная последовательность генома вируса парагриппа 5 (PIV5) зондского панголина ( Manis Javanica ) в Китае», Journal of Wildlife Diseases, 55: 947–50. [PubMed] [Google Scholar]
Вайс С. и другие. (2017) «Новый связанный с колтивирусом вирус, выделенный из летучих мышей со свободным хвостом из Кот-д’Ивуара, способен инфицировать клетки человека in vitro», Virology Journal, 14: 181. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Уильямсон Б.Н. и другие. (2019) «Распространенность и штаммы вируса колорадской клещевой лихорадки у лесных клещей Скалистых гор в долине Биттеррут, штат Монтана», Трансмиссивные и зоонозные заболевания, 19: 694–702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Вонг М. и другие. (2020) «Доказательства рекомбинации коронавирусов, указывающие на происхождение nCoV-2019 у панголинов», bioRxiv , DOI: 10.1101 / 2020.02.07.939207.
Ву Ф. и другие. (2020) «Новый коронавирус, связанный с респираторным заболеванием человека в Китае», Nature, 579: 265–9.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
У З. и другие. (2012) «Анализ виромов для идентификации новых вирусов млекопитающих у видов летучих мышей из провинций Китая», Journal of Virology, 86: 10999–1012. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ядав П. Д. и другие. (2019) «Характеристика новых реовирусов Вируса Вад Медани (орбивирус) и вируса Кундала (колвирус), собранных из клещей Hyalomma anatolicum в Индии во время эпиднадзора за геморрагической лихорадкой Крымского Конго», Журнал вирусологии, 93: e00106–19.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Чжан Х. и другие. (2015) «Молекулярное отслеживание конфискованных чешуек панголинов для сохранения и мониторинга незаконной торговли в Юго-Восточной Азии», Глобальная экология и сохранение, 4: 414–22. [Google Scholar]
Чжоу П. и другие. (2020) «Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом вероятного происхождения летучих мышей», Nature, 579: 270–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Распространяли ли ящеры китайский коронавирус среди людей?
Ящеры — чешуйчатые существа, часто используемые в традиционной китайской медицине.Предоставлено: Франс Лантинг / National Geographic
.
Исследователи из Гуанчжоу, Китай, предположили, что панголины — длиннорылые млекопитающие, питающиеся муравьями, часто используемые в традиционной китайской медицине, — вероятный животный источник вспышки коронавируса, заразившей более 30 000 человек и сеющей хаос во всем мире.
Ученые говорят, что предположение, основанное на генетическом анализе, кажется правдоподобным, но предупреждают, что работа исследователей еще не опубликована полностью.«Это чрезвычайно интересное наблюдение. Хотя нам нужно увидеть больше деталей, это имеет смысл, поскольку сейчас появляются некоторые другие данные о том, что панголины несут вирусы, которые тесно связаны с 2019-nCoV, — говорит Эдвард Холмс, вирусолог-эволюционист из Сиднейского университета, Австралия.
Идентификация животного источника коронавируса, получившего название nCoV-2019, была одним из ключевых вопросов, на которые исследователи пытались ответить. Известно, что коронавирусы циркулируют среди млекопитающих и птиц, и ученые уже предположили, что nCoV-2019 первоначально произошел от летучих мышей, и это предположение основано на сходстве его генетической последовательности с таковыми других известных коронавирусов.Но, вероятно, вирус был передан человеку от другого животного. Коронавирус, вызвавший тяжелый острый респираторный синдром или атипичную пневмонию, распространился от летучих мышей, циветт-кошек и людей.
Южно-китайский сельскохозяйственный университет в Гуанчжоу сообщает, что двое его исследователей, Шен Юнъи и Сяо Лихуа, определили панголина как потенциальный источник nCoV-2019 на основе генетического сравнения коронавирусов, взятых у животных и животных. от людей, инфицированных во время вспышки, и другие данные.Последовательности аналогичны на 99%, сообщили исследователи на пресс-конференции 7 февраля.

Хороший кандидат
Ранее исследователи отмечали, что коронавирусы являются возможной причиной смерти панголинов ¹, и что nCoV-2019 и коронавирусы панголинов используют рецепторы с похожей молекулярной структурой для заражения клеток.
Еще до сегодняшнего объявления ящеры были хорошим кандидатом на роль промежуточного вида вируса, поэтому очень интересно, что исследователи обнаружили такую близкую последовательность, говорит Дэвид Робертсон, компьютерный вирусолог из Университета Глазго, Великобритания.
Панголины являются охраняемыми животными, но незаконный оборот широко распространен, и некоторые виды находятся под угрозой исчезновения. Их продают, что противоречиво, из-за мяса и чешуи, а также для использования в традиционной китайской медицине, в которой части животных используются для лечения таких заболеваний, как кожные заболевания, нарушения менструального цикла и артрит. Китайский закон гласит, что люди, продающие ящеров, могут быть наказаны лишением свободы на срок от 10 лет.
Коронавирус появился в китайском городе Ухань в декабре и, как полагают, распространился на людей на рынке морепродуктов и диких животных, где работали многие из первых инфицированных.Ящеров не было в списке предметов, продаваемых на рынке, хотя незаконность торговли ящерами может объяснить это упущение.
В прошлом месяце ученые в Пекине заявили, что источником nCoV-2019 были змеи, но другие исследователи отвергли эту теорию.
Шен и Сяо не сразу ответили на запросы Nature о комментариях, но Лю Яхун, президент Южно-Китайского сельскохозяйственного университета, сказал на пресс-конференции, что результаты будут вскоре опубликованы, чтобы помочь усилиям по борьбе с коронавирусом.
Ученые надеются, что в статье будут представлены подробности, в том числе, где команда нашла ящеров с подобным вирусом. Аринджай Банерджи, исследователь коронавируса из Университета Макмастера в Гамильтоне, Канада, говорит, что еще одна важная деталь — это то, где у ящеров исследователи обнаружили вирус — например, был ли он выделен из образцов крови или ректальных мазков.