С какого возраста можно принимать глицин: Сколько раз в день можно Глицин: количество таблеток в сутки

Содержание

Сколько раз в день можно Глицин: количество таблеток в сутки

Оно успокаивает, улучшает настроение и умственную активность, запускает процессы торможения ЦНС. Необходимое количество аминокислоты в организме помогает нормализовать давление, способствует выработке лецитина и расщеплению глюкозы, улучшению обмена веществ. Это, в свою очередь, служит профилактикой ишемического инсульта, появления атеросклеротических бляшек, помогает предупредить сахарный диабет.

Для достижения оптимального эффекта необходимо учитывать особенности курса и знать, сколько раз в день можно принимать Глицин. Эта информация представлена на официальном сайте препарата и в каждой инструкции, вложенной в коробочку с таблетками. Внимательно изучите ее перед использованием средства.

Особенности приема

Какие факторы определяют, сколько Глицина можно принимать в день?

  • Возраст. Средство можно давать даже грудным детям и принимать в преклонном возрасте, поэтому дозировка меняется с учетом этого фактора.
  • Для чего используется препарат. Сколько Глицина нужно в день зависит и от причин использования. Например, для улучшения сна достаточно половинки или одной таблетки, а при инсульте используется сразу 10 таблеток с небольшим количеством воды.
  • Индивидуальное назначение. Консультация с лечащим врачом поможет скорректировать схему приема и количество таблеток для ежедневного применения, чтобы достичь максимального эффекта.

Дозировка и особенности приема препарата

Однозначного ответа, сколько таблеток Глицина можно принимать в день, нет. Курс и дозировка зависят от индивидуальных потребностей и учета вышеперечисленных факторов. Однако существуют разработанные рекомендации, указанные в инструкции, которых необходимо придерживаться.

При нарушениях сна (частых пробуждениях, трудностях с засыпанием и пр.) назначают по ½­–1 таблетке за 20 минут до того, как лечь в постель, или сразу перед сном.

Для улучшения концентрации и памяти, при умственных нагрузках, стрессах, влекущих за собой психоэмоциональное напряжение, назначается курс на 2–4 недели с дозировкой препарата 2–3 раза в сутки по 1 табл. Аналогично средство дают детям и подросткам для коррекции социальной девиации и задержек умственного развития.

При риске ишемического инсульта взрослые могут одновременно принять Глицин в количестве 10 таблеток подъязычно, а при подозрении на уже наступивший инсульт – растолченных и немного разбавленных водой.

При наличии поражений ЦНС разного характера, которым сопутствуют перепады настроения, излишняя возбудимость, бессонница и пр., курс составляет 1–2 недели. Таблетки принимают по 1 шт. 2–3 раза ежедневно. Повторный курс осуществляется через месяц, если имеется необходимость.

В наркологии препарат используется как средство, помогающее уменьшить стресс и улучшить умственную работоспособность. При энцефалопатии и ПНС назначается курс на 2–4 недели с приемом 1 табл. 2–3 раза в сутки. Прием препарата повторяется 4–6 раз в год.

Указанная информация о том, сколько таблеток Глицина можно принимать в день, рассчитана на детей старше 3 лет, подростков, взрослых людей. Для младенцев и детей младше 3 лет дозировка снижается. При поражениях ЦНС, чрезмерной возбудимости, расстройствах сна предписывается давать по ¼–½ табл. 2–3 раза в день. Длительность курса – 1–2 недели, затем таблетки дают по ½ шт. ежедневно в течение 7–10 суток.

Когда стоит повышать дозу Глицина

Принимать препарат следует согласно инструкции, то есть не более 3 таблеток (300 мг) в сутки. Использование одномоментно большой дозы препарата (10 таблеток или 1000 мг) обусловлено ишемическим инсультом или близкими к нему ситуациями.

Если же задачей приема Глицина является улучшение работоспособности и настроения, защита от перегрузок ЦНС, профилактика различных заболеваний и поддержание нужного уровня аминокислоты в организме, в повышении дозировки нет необходимости.

Помните, что для достижения терапевтического эффекта важно, как принимать Глицин, а не сколько раз в день. Глицин применяется подъязычно или трансбуккально. Именно такой прием препарата обеспечит нужное действие. Если же просто принимать таблетки внутрь, вреда не будет, но и положительного эффекта тоже.


Препараты и лекарства для памяти пожилых людей.

Препараты для сохранения памяти у пожилого человека, лекарства для улучшения памяти у пожилых, медикаменты для лечения забывчивости у престарелых – актуальная тема. Все лекарства для улучшения и сохранения памяти в пожилом возрасте можно разделить на 4 категории: лекарственные препараты, бады, витамины и ноотропы. И все препараты имеют психотропные функции, а не мнемотропные – то есть активизируют возможности психики, а не памяти, так как влияют на кровообращение и процессы, активизирующие внимание, восприятие, концентрацию. Но непосредственно на память они не влияют.

Так что, к сожалению, любой из существующих лекарственных препаратов не является таблеткой, помогающей «вспомнить все». Так что просто поговорим о тех лекарственных средствах, которые активизируют мозговое кровообращение, следствием улучшения которого активизируется и память.

Помогаем памяти без рецепта.

Из безрецептурных препаратов среди пожилых людей, страдающих расстройствами памяти, в России наиболее известен и популярен глицин. Глицин – это амино-уксусная кислота, одна из 20 аминокислот, присутствующих в организме всегда. Она вырабатывается в организме и необходима для нормального развития и функционирования. У глицина немало важных функций, прежде всего, в нервной системе. Дополнительный прием его повышает мозговое кровообращение. Средство очень доступно по стоимости и не имеет противопоказаний.

Также без рецепта отпускается и «Витрум мемори», который способствует повышению внимания и интеллекта, а также скорости мыслительных процессов. Третьим по популярности средством в свободной продаже считается «Ундевит» – поливитаминный препарат для профилактики и лечения преждевременного старения. В этом же списке – есть еще одна аминокислота: гаммо-аминомаслянная кислота, которое является основным активным компонентом «Аминалона» – средства с ноотропным и психостимулирующим действием. В составе данного препарата только один активнодействующий компонент – гамма-аминомасляная кислота (по 0,25 или 0,5 грамма в таблетке).а также еще одна аминокислота «Аминалон», которая также считается эффективным стимулятором памяти и нередко употребляется с глицином. Капсулы «Билобил», основной компонент которых экстракт листьев гингко, положительно влияют на улучшение памяти и концентрацию внимания. Они назначаются также при головокружении, шуме в ушах, нарушениях сна; в случае нарушения кровообращения нижних конечностей; при нарушении мозгового кровообращения с чувством тревоги и страха.

Среди других безрецептурных препаратов хорошей репутацией пользуются «Интеллан», «Диваза», «Глицин D3» и многочисленные препараты на основе гинко билоба.

Что назначают врачи для сохранения и улучшения памяти у пожилых.

Вопросы медикаментозной поддержки памяти для пожилых рецептурными препаратами решает только врач. Отпускаемые по рецепту препараты, как правило, имеют несколько больше побочных эффектов и требуют назначения врача и врачебного контроля их приема.

Глицин детям — как давать ребенку и с какого возраста

Детский Глицин прошел полное исследование в ходе которого было доказано, что влияние препарата на организм мягкое и не вызывает побочных эффектов. Поэтому Глицин детям так часто рекомендуют в педиатрической практике. Основное действие препарата назначено на нормализацию сна, устранение тревожного и беспокойного состояния, гармонизации работы нервной системы.

Глицин не представляет опасности для назначения новорожденным, а также рекомендуется детям дошкольного и школьного возраста для улучшения возможности концентрации внимания во время занятий.

Воздействие Глицина на детский организм

Основное действующее вещество глицин является аминокислотой. Аналогичное вещество вырабатывает и организмом, синтезируется из белковых соединений. Получить его можно вместе с белковыми продуктами, большое его количество содержится в грудном молоке.

Зачем грудничкам может потребовать принимать Глицин? Принимать Глицин детям необходимо при дефиците натуральной аминокислоты и вызванных этим дефицитом симптомах. Получить данный компонент можно из продуктов питания. Содержится он в овсяной крупе, семенах тыквы, подсолнухе, орехах, печени и говядине. Правильное питание с содержанием перечисленных продуктов необходимо для нормальной работы ЦНС.

Попадая в организм с продуктами питания, аминокислота из желудочно-кишечного тракта попадает в печень и участвует в синтезе белка. Если глицин попал из таблетки, то он через кровоток сразу поступает к мозгу, минуя ЖКТ. На этом этапе в нейронах начинает образовываться гамма-аминомасляная кислота, которая оказывает тормозящий эффект. В результате нормализуются обменные процессы, стимулируется мозговая деятельность, стабилизируется психоэмоциональное состояние.

Показания к применению

Для чего нужен Глицин детям: показания:

  • бессонница либо сонливость;
  • плаксивость;
  • агрессивность;
  • расслабленное состояние, рассеянное внимание;
  • ослабление памяти;
  • эмоциональное и интеллектуальное перенапряжение;
  • гиперактивность;
  • беспокойство;
  • социальная дезадаптация в детском саду или школе;
  • вегето-сосудистая дистония;
  • последствия мозговых расстройств или травм;
  • задержки в умственном развитии;
  • мышечная дистрофия;
  • нарушение обмена веществ;
  • интоксикация.

С вышеперечисленными симптомами родителя сталкиваются у своих детей с самого рождения. Поэтому было разработано лекарство, которое можно принимать с грудного возраста, а не ждать несколько лет пока проблема будет только усугубляется.

Можно ли давать Глицин детям? Глицин быстро попадает в кровоток, излишки полностью выводятся из организма в виде воды и углекислого газа. Вещество не оседает в тканях.

Глицин способен выводить токсины из организма. Правильно назначать таблетки вместе с другими антипсихотическими препаратами для выведения токсических веществ. Стоит обратить внимание, что при одновременном приеме Глицина с другими седативными препаратами, их действие будет умножаться.

Схема лечения и дозировка

Дозировка Глицина детям выбирается строго индивидуально, чем младше пациент, тем меньше ему требуется вещества. Также ребенок проявлять большую или меньшую чувствительность к аминокислоте

Инструкция по применению содержит данные о дозах и длительности лечения. Однако, спектр применения Глицина достаточно широкий, а симптомы могут быть выражены в большей или меньшей степени. Поэтому прием препарата начинается только после диагностики и назначения врача. С какого возраста можно назначать Глицин?

Таблетка принимается сублингвально, то есть кладется под язык либо за щеку до полного растворения. Если ребенок упрямится, таблетку можно размельчить в порошок и дать запить водой. Порошок не окажет ожидаемого эффекта, если его растворить в воде, в таком виде он будет выведен системой ЖКТ, и не попадет в лимфу.

  • Детям до 1 года назначают четверть или половину таблетки. Возможно нанесение порошка на соску. В качестве альтернативы глицин может приниматься кормящей матерью;
  • Давать Глицин ребенку в 2 года можно по половине таблетки, способ применения аналогичен. Сложностей при приеме возникать не должно, поскольку таблетка имеет сладкий привкус;
  • Глицин ребенку в 3 года и старше назначают в зависимости от показаний, можно назначать целую таблетку.

С какого возраста можно давать детям Глицин? Педиатры часто назначают Глицин грудничкам. В этот период ЦНС еще не развита и не укреплена и ей нужно помочь. Ребенок может долгое время находиться в возбужденном состоянии, не может уснуть, что приводит к еще большему стрессу. Аналогичные проблемы возникают в период роста зубов и даже при изучении новых предметов и получении новых впечатлений. 

Для детей длительность терапии не должна превышать 2-х недель. Количество приемов в день – 1-3, при нарушениях сна возможен прием Глицина только на ночь. Обычно этой дозировки и срока достаточно для устранения симптоматики. После перерыва курс можно повторить. По показаниям Глицин могут принимать в течение года.

Вред Глицина для ребенка

В большинстве случаев Глицин является безопасным для детей, негативные реакции не проявляются. Исключением является непереносимость действующего вещества, аллергические реакции. Следует немедленно прекратить принимать препарат, если после Глицина ребенок чешется, появилась сыпь на коже и покраснения. Ребенок может жаловаться на тошноту, головокружение.

Одним из действий глицина является развитие гиподинамии. Поэтому запрещено давать препарат ребенку с пониженным давлением. Самолечение может привести к слабости, торможению нервных реакций, обморочным состояниям.

Во время лечение нужно быть особенно внимательным к поведению и состоянию здоровья малыша. Аминокислота оказывает непосредственное влияние на работу центральной нервной системы. Даже у взрослого человека могут возникнуть непредсказуемые реакции. При появлении дополнительных жалоб либо изменении поведения в худшую сторону, необходимо прекратить прием препарата и обратиться к врачу.

Рекомендации педиатров

Детские врачи без опасения назначают глицин детям. Из предложенных на фармацевтическом рынке препаратов, Глицин является одним из самых безопасных и эффективных. Действие препарата наступает буквально сразу, что подтверждается отзывами. Поэтому подобрать правильную дозировку и схему лечения не составляет труда.

Также специалисты отмечают универсальность препарата. Это означает, что нервная система приходит в баланс независимо от первоначальной проблемы: был ли ребенок перевозбужденным либо наоборот наблюдалась заторможенность.

Положительным качеством является отсутствие привыкания к препарату, так как данная аминокислота в естественных условиях вырабатывается человеческим организмом. Молекула воздействует только на работу нервной системы, другие органы и ткани не поддаются влиянию.

Педиатры успокаивают родителей, которые категорически против приема препаратов, особенно в грудном возрасте. Ведь нарушение работы нервной системы может привести к необратимым последствиям, например, задержке физического и умственного развития, ослаблению иммунитета и т.д.

Известный доктор Комаровский не рекомендует давать детям Глицин, даже при наличии показаний. Знаменитый педиатр считает, что вышеперечисленные симптомы можно снять другими немедикаментозными методами.

Источники:

Видаль: https://www. vidal.ru/drugs/glycine__4429
ГРЛС: https://grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=80b010cc-df9b-4601-90e4-d8cd11a43524&t=

Нашли ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl + Enter

инструкция по применению, дозировка, отзывы, сравнение с Тенотеном


Информация носит справочный характер. Не занимайтесь самодиагностикой и самолечением. Обращайтесь ко врачу.

Довольно часто многие молодые мамочки встречаются с такой проблемой, как беспокойное поведение их малыша. Плохой сон, капризы, постоянный плач и плохое настроение – это часты явления в поведении ребенка в первые месяцы и годы его жизни.

Часто многие невропатологи в качестве успокоительного средства для детей назначают Глицин. Это лекарство безопасно для здоровья и не оказывает вредного влияния на состояние нервной системы малыша.

Но многие матери сомневаются в целесообразности применения Глицина для ребенка, потому что считают, что он может вместо пользы нанести вред. Однако чтобы разобраться так это или нет, стоит подробно рассмотреть свойства этого лекарства.

Характеристика аминокислоты

Глицин – это аминокислота, которая вырабатывается в организме человека. Что интересно с греческого языка слово «гликос» переводится, как сладковатый. Именно это условие позволяет принимать этот препарат детям, потому что они думают, что это леденец или конфета.

Глицин входит в состав заменимых аминокислот и обладает способностью выделяться в организме человека, а именно в печени. Он входит в состав определенной продукции, которая имеет животное и растительное происхождение.

Большой уровень концентрации этого вещества имеется в печени, говяжьем мясе, орехах, овсе, тыквенных семенах, подсолнечники и другой пищевой продукции. А также содержится в веществах – холин, треонин, серин.

Принцип действия

Механизм действия препарата состоит в следующем:

  • регулирование метаболизма в организме;
  • приводит в норму торможение защитных процессов, которые происходят в центральной нервной системе;
  • оказывает повышающее воздействие на рабочий процесс умственной жизнедеятельности;
  • снимает напряжение психоэмоционального характера, чувство беспокойства;
  • оказывает действие антитоксического и антиоксидантного характера на организм;
  • снижает чувство агрессивности, улучшает социальную адаптацию;
  • оказывает положительное воздействие на сон;
  • приводит к купированию симптомов вегето-сосудистого и мозгового нарушения.

Во время попадания в организм, препарат не накапливается в организме. Оно равномерно распределяется по всем тканям, попадает практически в состав всех биологических жидкостей и после этого переходит в состояние углекислого газа и воды.

Можно ли давать Глицин детям? Нужно!

Многие матери побаиваются давать детям Глицин, потому что уверенны, что это лекарство оказывает вредное воздействие на еще не сформировавшийся детский организм. Однако это совсем не так.

Учитывая то, что это лекарство относится к натуральным компонентам белковой продукции и находится в клеточной структуре человека, то оно является абсолютно безопасным препаратом для детского организма.

Кроме этого данное средство на протяжении долгого времени применяется для лечебной терапии и для поддержки жизнедеятельности мозга детского организма, начиная с рождения.

Итак, для чего Глиицин нужен детскому организму:

  • для решения различных проблем и нарушений сна;
  • снятие состояния беспокойства;
  • если у ребенка чрезмерная плаксивость;
  • если у ребенка имеются проблемы и торможение умственного развития;
  • для улучшения памяти;
  • во время лабильности эмоционального характера;
  • при различных проблемах в деятельности нервной системы;
  • во время синдрома нехватки внимания.

Помимо этого многие педиатры назначают эту аминокислоту детям для улучшения уровня интеллектуальной деятельности, для того, чтобы ребенок легче адаптировался в социуме.

Дозировка в зависимости от возраста

Во время назначения Глицина для прима детьми нужно учитывать 3 важного условия:

  • возраст ребенка, которому назначается данное лекарство;
  • реакции индивидуального характера на препарат;
  • цель использования.

Дозировки детям в возрасте до 12 месяцев

Обычно в таком возрасте детям аминокислота назначается при устойчивых проблемах со сном, повышенном уровне возбудимости, при состоянии плаксивости и во время чрезмерного беспокойства.

Согласно инструкции дозировка Глицина для детей до года ¼ или ½ части таблетки. Желательно ее размять до порошкообразного состояния, также можно обмакнуть соску в порошок или положить таблетку под язык или на поверхность щеки с внутренней стороны.

Детишки до трех лет

Ребенку в возрасте 2-3 лет следует давать по 0,5 таблетки Глицина. Таблетку можно растолочь до состояния порошка или положить в целом виде под язык или на внутреннюю сторону щеки.

Не желательно порошок разводить водой или другими жидкостями. В таком состоянии он теряет свое действие и снижается его всасывание в кровоток или лимфу.

От трех и старше

Детям старшего возраста от 3 лет и старше можно принимать уже по целой таблетке Глицина. При этом ее не нужно предварительно измельчать.

Поскольку аминокислота обладает сладковатым вкусом, трудностей приема у детей не возникнет. Они могут принять таблетку за витаминку или таблетку. Поэтому у ребенка не будет возражений, если вы предложите ему пососать пилюлю.

Количество приемов препарата независимо от возраста составляет 2 или 3 раза в день. Длительность курса терапевтического лечения определяет лечащий врач, но обычно она составляет не более 14-15 дней.

Может ли препарат нанести вред ребенку

Единственно противопоказание к приему Глицина – это повышенная чувствительность к аминокислоте. Обычно же данное средство не наносит вред детскому организму. Среди побочных явлений в редких случаях встречаются аллергические реакции на составляющие средства.

Но все же стоит строго придерживаться дозировок. Неправильная доза может стать оказать негативное влияние на состояние центральной нервной системы и вызвать разные эффекты, а также нежелательные реакции.

Внимание! В первые 1-2 дня приема этого средства нужно обязательно следить за поведением ребенка, это поможет вовремя выявить нежелательные реакции и понять, что препарат ему не подходит.

Иногда некоторые родители не консультируются со специалистами и начинают давать Глицин самостоятельно, при этом они не соблюдают дозировки и количество приемов за сутки.

В результате у ребенка могут возникнуть обморочные состояния, еще большее ухудшение сна и проявление сильного беспокойства, заметное торможение реакций нервного характера и иногда расстройства психики.

Но всего этого можно избежать, просто нужно заранее проконсультироваться со специалистом, чтобы он смог точно назначить дозировку и при необходимости подкорректировать ее.

Из практики врачей

Многие специалисты часто назначают данное средство. Это связано с тем, что Глицин проявляет себя только с положительной стороны, устраняет признаки различных расстройств в поведении ребенка, а также абсолютно безопасен для детского организма.

Помимо этого подобрать правильную дозировку для малыша очень легко. Это связано с тем, что реакция ребенка на составляющие препарата прослеживается на самом первом этапе его приема.

Кроме этого, в своих отзывах многие детские врачи отмечают главное преимущество препарата – его универсальность, Глицин можно использовать в качестве успокоительного средства, а также в качестве улучшения умственной работы и стимулирования мозговой деятельности детей.

При этом небольшое корректирование суточной дозировки препарата, позволяет добиться желаемого результата без смены лекарства.

Стоит брать во внимание то, что Глицин относится к ноотропам. Это средство состоит только из аминокислоты, которая вырабатывается человеческим организмам. По этой причине препарат не оказывает воздействия на другие системы организма, а также не вызывает привыкания и побочных явлений.

Докторо Комаровский знает, как воспитать и вырастить ребенка без лекарств:

Практический опыт применения

Отзывы родителей подтверждают тот факт, что Глицин действительно можно эффективно применять для улучшения состояния детей любого возраста.

Когда моему сыну было 8 месяцев, у него было явное расстройство поведения, а именно он был очень беспокойным, постоянно капризничал, плохо спал, почти не ел и всегда плакал.

Мы сразу решили обратиться к врачу, поскольку не могли понять, в чем дело. После осмотра врач назначил Глицин в дозировке по 0,25 таблетки 2 раза в день. Поскольку препарат обладает сладковатым вкусом, проблем с приемом не возникло. После недели приема наш малыш стал спокойным, веселым, он играет и всегда радуется своим успехам.

Оксана, 27 лет

Дочке 8 лет. До приема Глицина у нее были различные расстройства – проблемы со сном, переутомление, нарушение умственной работы. Я сразу задумалась, что это не нормально и повела дочку на обследование. Врач порекомендовал принимать аминокислоту.

Да я давно слышала об этом препарате, но не знала, что его можно давать детям. После 10 дней приема состояние дочки намного улучшилось. У нее нормализовался сон, да и успехи в школе пошли в гору. Кроме этого этот препарат практически безвреден и не вызывает побочных явлений!

Мария, 34 года

Выбрать есть из чего

Глицин имеет большое количество аналогов, которые обладают сходными свойствами и одинаковым принципом действия. Самым известным из них является Тенотен.

Многих мамочек интересует вопрос – что лучше Глицин или Тенотен? Оба препарата обладают одинаковым действием. Они оказывают воздействие на центральную нервную систему, и назначается при похожих симптомах. Но состав этих средств разный. В основе Глицина лежит аминокислота, а вот в Тенотен – это гомеопатическое средство.

Кроме этого Глицин можно давать детям с самого рождения, а Тенотен не рекомендуется принимать до 3 летнего возраста, первый обладает мягким воздействием, улучшает память, работоспособность, оказывает успокаивающее воздействие, второй же рекомендуется назначать при серьезных нарушениях.

В целом Глицин для детей совершено безопасен. Его можно давать прямо с рождения. Он не оказывает побочных явлений и вредного воздействия на детский организм. Главное во время приема точно соблюдать дозировки и не давать препарат дольше положенной нормы.

Если точно соблюдать правила приема, у детей улучшится общее состояние, умственная способность, пройдут расстройства поведения и беспокойство, нормализуется сон и поведение.

Бетагистин при симптомах головокружения | Cochrane

Вопрос обзора

Помогает ли препарат бетагистин пациентам с головокружением, развивающимся по разным причинам?

Актуальность

Головокружение является симптомом, при котором люди испытывают ложное ощущение движения. Считается, что этот вид головокружения связан с нарушениями во внутреннем ухе — в органе, отвечающим за равновесие, или в структурах, соединяющих его с мозгом. Многие страдают от симптома головокружения, и оно может вызвать серьезные проблемы в обычной / повседневной деятельности. Бетагистин является препаратом, который, возможно, работает за счет улучшения кровотока во внутреннем ухе. В этом обзоре изучено: является ли бетагистин более эффективным, чем плацебо (фиктивное лекарство) в лечении симптомов головокружения, вызванного различными причинами у пациентов любого возраста.

Характеристика исследований

Мы включили 17 исследований, в которых приняли участие в общей сложности 1025 участников. В шестнадцати исследованиях, включивших 953 человека, сравнили бетагистин с плацебо. Риск смещения в этих исследованиях колебался от высокого до неясного. Все исследования с данными, поддающимися анализу, длились три месяца или меньше. В одно исследование с высоким риском смещения, сравнивающее бетагистин с плацебо, были включены 72 человека с доброкачественным пароксизмальным позиционным головокружением (ДППГ). Все пациенты также лечились с помощью маневров репозиционирования частиц. В целом, мы оценили, что качество доказательств было низким.

Исследования значительно различались с точки зрения типов участников, их диагнозов, назначенной дозы бетагистина и продолжительности времени применения препарата, методов исследования и того, как измерялось любое облегчение симптомов головокружения.

Основные результаты

При суммировании всех исследований доля пациентов, отметивших облегчение симптомов головокружения, была значимо выше у пациентов, принимавших бетагистин, чем у пациентов, принимавших плацебо. Однако, присутствует существенная несогласованность в результатах исследований, поэтому к этому результату следует относиться с осторожностью.

Доля пациентов, сообщивших о побочных эффектах лечения была сходной в обеих группах: 16% у пациентов, принимавших бетагистин и 15% у пациентов, принимавших плацебо. В целом, 16% пациентов обеих групп выбыли из исследования.

Не было представлено достаточно информации о влиянии бетагистина на объективные показатели функционарования органа, отвечающего за равновесие, во внутреннем ухе. Не было представлено информации о влиянии бетагистина на общее качество жизни и падения.

Качество доказательств

После оценки включенных исследований, мы оценили качество доказательств как низкое. Это означает, что наша оценка эффективности бетагистина может оказаться неточной. Эти доказательства актуальны по сентябрь 2015 года.

Выводы

Низкое качество доказательств свидетельствуют о том, что бетагистин может помочь облегчить симптомы головокружения у пациентов, страдающих от головокружения от разных причин. Бетагистин, как правило, хорошо переносится. В дальнейших исследованиях по управлению симптомами головокружения необходимо использовать более строгую методологию и включать исходы (результаты), которые важны для пациентов и их семей.

Успокоительные для кошек: отзывы ветеринаров, обзор препаратов

Стресс – это тяжелое для организма состояние. Порой с ним справиться очень сложно. И если человек может заподозрить у себя патологическое состояние и обратиться к специалисту, то для кошек эта задача невыполнима.

Единственное, что она может – это подавать своим поведением сигналы о том, что ей плохо и некомфортно. Важно не пропустить симптомы стресса у кошки, ведь он способен вызвать серьезные проблемы со здоровьем.

Когда кошке могут понадобиться успокоительные средства

Есть множество факторов, приводящих к стрессовому состоянию кошки. 

К ним относят:

  • Переезд в новое место жительства.
  • Посещение выставок, мест с большим скоплением людей.
  • Визит в ветеринарную клинику, проведение процедур.
  • Выгул.
  • Появление в доме ребенка или нового члена семьи.
  • Смену хозяина.
  • Поездку на автомобиле, авиаперелет.
  • Уличный шум во время праздничных мероприятий.
  • Наступление половой зрелости.
  • Хирургическое вмешательство – кастрацию или стерилизацию.
  • Болезнь.
  • Отсутствие внимание со стороны владельца.

Симптомы стресса у кошек

Стресс – это патологическое состояние организма, вызванное каким-либо раздражающим фактором. При своевременной диагностике и правильном лечении с ним можно справиться в короткие сроки.

Стресс бывает двух типов – острый и хронический.


Острый стресс вызван неожиданным событием. В организме резко повышается уровень кортизола – гормона стресса. Это проявляется резким изменением в поведении любимца.

Его признаки:

  • беспокойное поведение;
  • агрессия;
  • обильное слюноотделение;
  • учащенные сердцебиение и дыхание;
  • частое мяуканье;
  • непроизвольные мочеиспускание и/или дефекация;
  • оскал;
  • вздыбленная шерсть;
  • выгибание спины;
  • расширенные зрачки;
  • прижатые к голове уши.

Хронический стресс вызван систематическим воздействием на психику кошки какого-либо фактора. При этом изменяются поведение и привычки животного.

Его симптомы:

  • стремление забиваться в уединенные места, преимущественно темные;
  • потеря аппетита, либо, наоборот, повышение;
  • периодическая рвота;
  • частое вылизывание;
  • запор или диарея;
  • вялость, апатия, нежелание участвовать в играх;
  • продолжительный сон;
  • активное расчесывание кожи, вплоть до появления крови;
  • неадекватная реакция на шум;
  • мочеиспускание в не предназначенных для этого местах.

Специалисты выделяют три фазы стресса у кошек:

1. Тревога. Иногда владельцы попросту не замечают ее. 

Для нее характерны:

  • нарушение аппетита;
  • понижение температуры тела;
  • учащенное дыхание;
  • стремление активно вылизывать себя;
  • недержание мочи;
  • диарея.

2. Резистентность. По мере того, как раздражающий фактор исчезает, состояние любимца нормализуется.

3. Истощение. Возникает, если раздражитель продолжает воздействовать на психику, и она не справляется с нагрузкой. 

На истощение указывают:

  • вялость, апатия;
  • потеря аппетита;
  • дистрофия тканей и органов.

Такое состояние опасно и может привести к серьезным последствиям.

Последствия стресса


Неоказание своевременной помощи может привести к серьезным последствиям. Особенно сильно страдают защитные функции организма – у любимца существенно снижается иммунитет. В тяжелых случаях итогом стресса становится летальный исход.

Диагностика и лечение

При любом подозрении на стресс у кошки необходимо обратиться к ветеринарному врачу. Это очень важно, поскольку некоторые опасные заболевания имеют схожую симптоматику.

Если стресс связан с каким-либо заболеванием, ветеринар диагностирует его и назначит необходимую терапию.

В случае, когда животное физически здорово, можно подозревать у кошки патологическое состояние, вызванное каким-либо раздражающим фактором.

Лучше обратиться к специалисту, изучающему поведение животных и занимающемуся его коррекцией – зоопсихологу. Это сравнительно новое направление в ветеринарии, которое успешно зарекомендовало себя.

Задача зоопсихолога – изучить, как устроен быт питомца, и скорректировать окружающую его обстановку. Далее специалист, при необходимости, назначает успокоительные средства. Важно то, что зоопсихолог работает не только с самим животным, но и с хозяином. Это необходимо для того, чтобы врач видел полную картину происходящего.

В зависимости от ситуации, кошке могут быть назначены:

  • арома- и фитотерапия;
  • тактильное общение с владельцем – специальный массаж;
  • прием витаминно-минеральных комплексов;
  • успокоительные препараты.

Успокоительные средства для кошек


Актуальны, если другие методы психологической помощи не работают. В этом случае специалист может порекомендовать кошке средства с седативным – успокаивающим эффектом.

Важно! Все препараты необходимо подбирать и принимать только под контролем ветеринарного врача!

Успокаивающие средства имеют накопительный эффект, для достижения нужного результата следует применять их систематически.

Выпускаются в виде:

1. Таблеток. Применяются перорально, можно смешивать с кормом.

2. Растворов и капель для приема внутрь. Их также можно смешать с пищей, либо дать кошке с помощью шприца с дозатором.

3. Ошейников. Содержат эфирные масла, способствующие снятию нервного напряжения. Ошейник следует носить постоянно в течение периода, указанного в инструкции.

4. Спреев. Вещество распыляется в том месте, где кошка чувствует себя беспокойно.

5. Капель на холку. 

6. Суспензий.

7. Жидкостей. Флакон помещается в диффузор, который вставляется в розетку. Происходит испарение действующего вещества, благотворно влияющего на состояние питомца.

Длительность действия того или иного средства указана в инструкции по применению.

Мнение ветеринарного эксперта


         

  “Бывают ситуации, при которых не обойтись без успокоительных: питомец привыкает к новому дому, другим животным или членам семьи; громкие звуки или другие стресс-факторы. Также когда четвероногий друг находится в хроническом стрессе или на начальном этапе, без успокоительных никак. Они помогают нормализовать фоновое спокойствие и далее работать с окружающей обстановкой!”,

     – Евгения Гусева, зоопсихолог ветеринарного центра “Четыре Лапы”.

       ЗАПИСАТЬСЯ НА ПРИЕМ

  

Обзор успокоительных средств для кошек


Ceva

Страна-производитель: Франция

Форма выпуска:

  • ошейник;
  • спрей;
  • растворы для диффузора.

Ceva Феливей флакон + диффузор

Объем: 48 мл

Состав: аналог феромона лицевых желез кошки Feliway.

Применение: снимите крышку с флакона, закрепите диффузор и плотно закрутите. Не выбирайте розетки, расположенные за мебелью, предметами декора, дверью. 

Ceva Feliway Friends феромоны для кошек

Объем: 48 мл

Состав: феромон Feliway Friends, который успокаивающе действует только на кошек, так как в природе выделяется мамой-кошкой в области молочных желез.

Применение: откройте флакон и вставьте в диффузор. Не использовать сменные блоки других брендов!



Relaxivet

Страна-производитель: Россия.

Формы выпуска:

  • капли для приема внутрь;
  • жидкость в диффузоре;
  • спрей;
  • ошейник;
  • капли на холку;
  • суспензия;
  • таблетки.

Важно! Препараты Relaxivet безопасны для домашних животных, не вызывают привыкания.

Relaxivet ошейник успокоительный для кошек и собак

Длина: 40 см

Состав: эфирные масла ромашки, лаванды.

Применение: закрепить ошейник так, чтобы он не сдавливал шею и не причинял дискомфорт. 

Длительность применения: до 1 месяца непрерывного ношения.

Начинает действовать через несколько минут после надевания.

Relaxivet Spot-on капли на холку для кошек и собак

Количество пипеток в упаковке: 4.

Состав: эфирные масла (кошачья мята и розмарин), экстракты трав – пустырника и шлемника байкальского.

Состав разработан совместно с немецкой компанией Neoterica.

Применение: нанести на сухую неповрежденную кожу холки.

Действие начинается через 30 минут.

Relaxivet суспензия успокоительная

Объем: 25 мл.

Состав: 

  • L-триптофан: естественный антидепрессант.
  • L-теанин: антиоксидант, релаксант.
  • Инозитол: витамин В8.

Эффект заметен после первого применения

Длительность действия: до 12-24 часов.

Длительность курса: до 3 месяцев.

Применение: перорально с помощью шприца с дозатором. Если стресс краткосрочный, препарат дают повторно спустя час после фактора, спровоцировавшего его.

Дозировка: 1 мл на 2 кг веса. 


No Stress

Производитель: Beaphar (Нидерланды).

Форма выпуска: диффузор со сменным блоком. Сменные блоки продаются отдельно.

Объем: 30 мл.

Принцип действия: благотворно влияет на нервную систему, успокаивает ее.

Состав: эфирное масло валерианы.

Длительность действия: 4 недели непрерывного использования. 

Площадь действия: 50 кв.м.

Применение: вставить диффузор в розетку (220 вольт).



Cat Comfort

Производитель: Beaphar (Нидерланды).

Форма выпуска: диффузор со сменным блоком. Сменные блоки продаются отдельно.

Объем: 30 мл

Состав:

  • аналог лицевого феромона кошек F3 – 2%;
  • углеводороды;
  • ароматизаторы.

и т.д.

Принцип действия: феромон, входящий в состав средства, помогает скорректировать проблемное поведение кошки, вызванное:

  • посещением ветеринара, грумера, выставки;
  • транспортировкой или переездом;
  • появлением нового питомца или члена семьи.

и т.д.

Площадь действия: 70 кв.м.

Применение: поместить сменный блок в диффузор. Вставить в розетку (220 вольт).

Длительность применения: 30 дней (при непрерывном использовании).



ФИТЭКС

Производитель: АВЗ, Россия.

Форма выпуска: капли для кошек и собак.

Объем: 10 мл

Состав: корень валерианы, экстракт пустырника, хмеля обыкновенного, шлемника байкальского.

Применение: перорально, на корень языка или в защечный мешок. Можно смешивать с едой. Принимается за 1 час до приема пищи.

Дозировка: 3-5 капель 3 раза в день.

Длительность курса: 15-30 дней.


Стоп-Стресс

Производитель: Apicenna, Россия.

Формы выпуска: 

  • таблетки;
  • кормовая добавка.

Стоп-Стресс 2в1 таблетки для кошек для снижения возбуждения и коррекции поведения

Количество в упаковке: 15.

Состав: аминофенилмасляная кислота (фенибут), экстракты лекарственных трав (хмель, шлемник байкальский, пион, пустырник), вспомогательные вещества.

Применение: перорально, на корень языка. Допустимо смешивать с кормом.

Дозировка: подбирается индивидуально.

Длительность курса: 15-20 дней. При необходимости может быть продлен до 4 недель.

Противопоказания:

  • аллергия на один из компонентов препарата;
  • заболевания мочеполовой системы;
  • сахарный диабет;
  • новообразования;
  • вынашивание потомства и лактация.

Стоп-Стресс Плюс для кошек кормовая добавка

Объем: 30 мл

Состав:

  • L-теанин;
  • триптофан;
  • глицин;
  • вспомогательные вещества.

Применение: внутрь, на кончик языка или в защечный мешок. Допустимо смешивать с небольшим количеством корма.

Дозировка: 1 капля на 1 кг массы тела. Суточную норму делят на 2 приема.

Длительность приема: до 3 месяцев.



GimCat

Страна-производитель: Германия.

Форма выпуска: паста. 

Объем: 50 г

Состав: зверобой, L-триптофан, бета-глюкан, мясо и мясные продукты, масла, жиры, яйца и яичные продукты, рыба и рыбные продукты, водоросли.

Применение: давать кошке из тюбика или смешивать с едой (водой).

Дозировка: 6 см пасты в день (1 см = 0,5 г).



Экспресс Успокоин

Производитель: Астрафарм, Россия.

Форма выпуска: таблетки.

Количество в упаковке: 2 или 6.

Применение: внутрь. Обладает мясным вкусом.

Состав: тразодона сукцинат.

Дозировка: устанавливается ветеринарным врачом.

Длительность действия: до 8 часов.

Противопоказания:

  • чувствительность к компонентам препарата;
  • заболевания почек и печени, сердечно-сосудистой системы;
  • приступы эпилепсии;
  • беременность и лактация;
  • возраст

Краткие выводы

1. Стресс – опасное для кошек состояние.  Если вовремя не принять меры, последствия для здоровья четвероногого друга могут быть самыми печальными.

2. Причинами для возникновения стресса являются: переезд, транспортировка, смена хозяина, поездка в ветеринарную клинику и т.д. Кошки любят стабильность и долго адаптируются ко всему новому. 

3. При подозрении на патологическое состояние необходимо показать кошку специалисту.

4. Ветеринарный врач может назначить кошке успокоительные средства. Важно изучить инструкцию по применению и соблюдать дозировку.

Рекомендуем также

Glycine Глицин 1000 мг, 100 капс NOW foods

Glycine Глицин 1000 мг, 100 капс NOW foods 

Одна капсула содержит: 
Глицин (аминоуксусная кислота, гликокол) 1000 мг 

  • Глицин (аминоуксусная кислота, гликокол) влияет на метаболические процессы.
  • Глицин является регулятором обмена веществ, нормализует и активирует процессы защитного торможения в центральной нервной системе, уменьшает психоэмоциональное напряжение, повышает умственную работоспособность.
  • Глицин метаболизируется до воды и углекислого газа, накопление его в тканях не происходит.
  • Глицин является предшественником креатина, который используется для построения ДНК и РНК. Также поддерживает запасы гликогена, в результате чего в организме образуется больше глюкозы для производства энергии.

Функциональное действие: 

Глицин обладает глицин- и ГАМК-эргическим, альфа1-адреноблокирующим, антиоксидантным, антитоксическим действием, регулирует деятельность глутаматных (NMDA) рецепторов, за счёт чего препарат:
— Улучшает настроение.
— Облегчает засыпание и нормализует сон.
— Повышает умственную работоспособность. — Уменьшает вегето-сосудистые расстройства, в т.ч. и в климактерическом периоде.
— Уменьшает выраженность общемозговых расстройств при ишемическом инсульте и черепно-мозговых травмах.
— Уменьшает токсическое действие алкоголя.

Показания к применению:
— Глицин назначают практически здоровым детям, подросткам, взрослым для повышения умственной работоспособности.
— При стрессовых ситуациях — психоэмоциональных напряжениях (в период экзаменов, конфликтных и др. ситуациях).
— В качестве антистрессорного и ноотропного средства назначают детям старше одного года, подросткам, в том числе с девиантным (отклоняющимся от нормы) поведением, и взрослым при различных 
— Функциональных и органических заболеваниях нервной системы (неврозах, неврозоподобных состояниях и вегето-сосудистой дистонии, последствиях нейроинфекций и черепно-мозговых травм,перинатальных и других энцефалопатий, в том числе алкогольного происхождения), сопровождающихся повышенной возбудимостью, эмоциональной нестабильностью, снижением умственной работоспособности, нарушением сна.
— В качестве нейропротекторного препарата глицин назначают при ишемическом инсульте.

Способ применения: по 1 капсуле 1-3 раза в день за 30 мин. до еды.
Практически здоровым детям, подросткам, взрослым для повышения умственной работоспособности, при психоэмоциональных напряжениях, снижении памяти, внимания, задержке умственного развития, при девиантных формах поведения по 1 капсуле 1-3 раза в день, в течении 2-4 недель. Суточная доза 3 г (3 капсулы).

При функциональных и органических поражениях нервной системы, сопровождающихся повышенной возбудимостью, эмоциональной лабильностью и нарушением сна, детям до 3 лет по 1 капсуле 1-2 раза в день в течении 1-2 недель, в дальнейшем по 1 капсуле 1 раз в день в течении 7-10 дней. Детям старше 3 лет и взрослым по 1 капсуле 2-3 раза в день в течении 1-2 недель. При необходимости курс лечения повторяют. 

При нарушении сна глицин назначают за 20 минут до сна или непосредственно перед сном по 1 капсуле (в зависимости от возраста).

При ишемическом мозговом инсульте: в течении первых 3-6 часов по 1капсуле с одной чайной ложкой воды, далее в течении 5 суток по 3 капсулы в сутки, затем в течении последующих 20 дней по 1 капсуле 3 раза в сутки. В наркологии глицин применяют в качестве средства, повышающего умственную работоспособность и уменьшающего психоэмоциональное напряжение в период ремиссии при явлениях энцефалопатии, органических поражениях центральной и периферической нервной системы по 1 капсуле 2-3 раза в сутки в течении 2-4 недель. При необходимости курсы повторяют 4-6 раз в год (каждые 2-3 месяца).

Побочное действие: возможны аллергические реакции.

Противопоказания: индивидуальная непереносимость.

Условия хранения: в сухом, прохладном, недоступном для детей месте, t° не выше +25°С.

Глицин подавляет сигнальный путь AGE / RAGE и последующий окислительный стресс, восстанавливая функцию Glo1 в аорте диабетических крыс и в HUVEC

Окислительный стресс играет решающую роль в патогенезе сосудистых осложнений диабета. Известно, что накопление конечных продуктов гликирования (AGE) и активация рецептора AGE (RAGE) вызывают устойчивый окислительный стресс в ткани сосудов.Все больше данных указывает на то, что глицин, простейшая аминокислота, оказывает антиоксидантное и антигликационное действие, а также улучшает функцию сосудов. Однако механизм, посредством которого глицин защищает ткань сосудов от окислительного стресса на моделях с диабетом, не исследован. В настоящем исследовании мы оценили, может ли глицин ослаблять окислительный стресс путем подавления пути передачи сигналов AGE / RAGE в аорте крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом и в эндотелиальных клетках пупочных сосудов человека (HUVEC).Наши результаты показали, что пероральное введение глицина увеличивает содержание NO и снижает окислительный стресс в сыворотке и аорте крыс с диабетом. Путь передачи сигналов AGE / RAGE в аорте крыс с диабетом был значительно ослаблен обработкой глицином, что проявлялось в снижении уровней AGE, RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Подавляющее действие глицина на образование AGE было связано с повышенной активностью и экспрессией аортальной глиоксалазы-1 (Glo1), важнейшего фермента, разрушающего метилглиоксаль (MG), основного предшественника AGE.В обработанных MG HUVEC глицин восстанавливает функцию Glo1, подавляет сигнальный путь AGE / RAGE и ингибирует образование активных форм кислорода. Кроме того, снижение образования AGE в HUVEC, вызванное обработкой глицином, ингибировалось ингибированием Glo1. В совокупности наше исследование предоставляет доказательства того, что глицин может ингибировать путь AGE / RAGE и последующий окислительный стресс за счет улучшения функции Glo1, тем самым защищая от диабетических макрососудистых осложнений.

Глицин подавляет сигнальный путь AGE / RAGE и последующий окислительный стресс, восстанавливая функцию Glo1 в аорте диабетических крыс и в HUVEC.

Окислительный стресс играет решающую роль в патогенезе диабетических сосудистых осложнений.Известно, что накопление конечных продуктов гликирования (AGE) и активация рецептора AGE (RAGE) вызывают устойчивый окислительный стресс в ткани сосудов. Все больше данных указывает на то, что глицин, простейшая аминокислота, оказывает антиоксидантное и антигликационное действие, а также улучшает функцию сосудов. Однако механизм, посредством которого глицин защищает ткань сосудов от окислительного стресса на моделях с диабетом, не исследован. В настоящем исследовании мы оценили, может ли глицин ослаблять окислительный стресс путем подавления пути передачи сигналов AGE / RAGE в аорте крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом и в эндотелиальных клетках пупочных сосудов человека (HUVEC).Наши результаты показали, что пероральное введение глицина увеличивает содержание NO и снижает окислительный стресс в сыворотке и аорте крыс с диабетом. Путь передачи сигналов AGE / RAGE в аорте крыс с диабетом был значительно ослаблен обработкой глицином, что проявлялось в снижении уровней AGE, RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Подавляющее действие глицина на образование AGE было связано с повышенной активностью и экспрессией аортальной глиоксалазы-1 (Glo1), важнейшего фермента, разрушающего метилглиоксаль (MG), основного предшественника AGE.В обработанных MG HUVEC глицин восстанавливает функцию Glo1, подавляет сигнальный путь AGE / RAGE и ингибирует образование активных форм кислорода. Кроме того, снижение образования AGE в HUVEC, вызванное обработкой глицином, ингибировалось ингибированием Glo1. В совокупности наше исследование предоставляет доказательства того, что глицин может ингибировать путь AGE / RAGE и последующий окислительный стресс за счет улучшения функции Glo1, тем самым защищая от диабетических макрососудистых осложнений.

1.Введение

Сосудистые осложнения стали ведущей причиной заболеваемости и смертности среди пациентов, страдающих сахарным диабетом во всем мире. Окислительный стресс играет центральную роль в патогенезе сосудистых осложнений диабета [1]. Хорошо известно, что образование конечных продуктов гликирования (AGE) и последующий сигнальный путь вносят основной вклад в устойчивый окислительный стресс, который возникает в ткани сосудов [2, 3]. AGE образуются в результате неферментативных реакций между восстанавливающими сахарами и аминогруппами крупных биомолекул, включая белки, нуклеиновые кислоты и липиды [4].Этот необратимый процесс ускоряется при хронической гипергликемии и / или окислительном стрессе, как при сахарном диабете. Помимо депонирования во внеклеточном матриксе и рекрутирования макрофагов в сосуды [5], AGE также связываются с рецептором AGE (RAGE) и активируют НАДФН-оксидазу (Nox) и NF- κ B [6], таким образом инициируя порочный круг окислительного стресса и воспаления [7, 8]. Еще одна вредная особенность AGE — их роль в «метаболической памяти». Поскольку образование AGE не может быть обращено вспять, их накопление в сосудистой ткани вызывает устойчивый окислительный стресс, даже если гипергликемия уменьшается [9].Следовательно, поиск способов ингибирования образования AGE имеет особое значение для защиты от окислительного стресса при диабетическом сосудистом повреждении.

Метилглиоксаль (MG), высокореактивный дикарбонильный метаболит гликолиза, все больше признается в качестве основного предшественника внутриклеточных AGE [10]. MG разлагается глиоксалазной системой, эффективной системой ферментативной детоксикации, в которой глиоксалаза-1 (Glo1) является ферментом, ограничивающим скорость [11]. Используя глутатион (GSH) в качестве кофактора, Glo1 превращает MG в промежуточный продукт, который далее детоксифицируется в лактат глиоксалазой-2.В условиях диабета снижается как экспрессия Glo1, так и уровни GSH [12–14]. Следовательно, функция Glo1 нарушается, что приводит к неконтролируемому образованию AGE и окислительному стрессу [15, 16]. Следовательно, усиление функции Glo1 может сыграть ценную роль в подавлении этого вредного процесса.

Глицин — простейшая аминокислота у млекопитающих. Помимо участия в синтезе структурных биомолекул, глицин служит одним из предшественников GSH, одного из важнейших антиоксидантов в организме человека.При диабетических осложнениях глицин оказывает подавляющее действие на гликирование, такое как задержка образования катаракты [17], хотя механизм этого четко не установлен. В недавних исследованиях сообщалось о некоторых защитных эффектах глицина при повреждениях сосудов, таких как улучшение функции эндотелия [18] и восстановление реактивности сосудов [13], но влияние глицина на крупные кровеносные сосуды, подверженные диабетическим состояниям, не исследовалось. Антигликационные и антиоксидантные эффекты глицина оставляют открытой возможность того, что глицин может работать, подавляя образование AGE и ингибируя активацию оси AGE / RAGE, тем самым защищая от окислительного стресса и диабетических сосудистых осложнений.В связи с действием глицина на восстановление сосудистых уровней GSH [13], мы предположили, что глицин может оказывать благотворное влияние на функцию Glo1, таким образом восстанавливая способность Glo1 ингибировать образование AGE.

В настоящем исследовании мы стремились изучить влияние глицина на сигнальный путь AGE / RAGE, а также на функцию Glo1 в аорте крыс с диабетом и в эндотелиальных клетках пупочных сосудов человека (HUVEC). Наша цель состояла в том, чтобы увеличить количество возможных терапевтических методов, которые могут быть полезны при диабетических макрососудистых осложнениях.

2. Материалы и методы
2.1. Экспериментальные животные

Все протоколы и процедуры нашего исследования были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных факультета Первой больницы Пекинского университета (номер разрешения: J201613).

Шестинедельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD) содержали при 12-часовом цикле свет-темнота. Все животные имели неограниченный доступ к питьевой воде и питанию. После двух недель акклиматизации всех крыс случайным образом распределили либо в экспериментальную группу, либо в здоровую контрольную группу.После ночного голодания экспериментальной группе внутрибрюшинно вводили разовую дозу стрептозотоцина (STZ, 45 мг / кг веса тела, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Сахарный диабет (СД) был подтвержден через 2 недели путем измерения уровня глюкозы в крови (пациенты с сахарным диабетом были подтверждены как диабетики). Экспериментальная группа была далее разделена на группу DM (нелеченные диабетические крысы, получавшие обычную питьевую воду) и группу DG (диабетические крысы, получавшие 1% (/) глицин ad libitum в питьевой воде [13, 19],).Аналогичным образом, здоровая контрольная группа была разделена на две группы: контрольную группу (здоровые крысы, получавшие обычную питьевую воду) и группу CG (здоровые крысы, получавшие 1% (/) глицин ad libitum в питьевой воде). Через 12 недель всех крыс анестезировали пентобарбиталом и умерщвляли. Грудные аорты быстро удаляли и хранили при -80 ° C или погружали в формалин для фиксации. Образцы сыворотки были собраны для определения биохимического профиля (с помощью автоматического биохимического анализатора 7600, Hitachi, Токио, Япония) и концентрации глицина.

2.2. Измерение сывороточного глицина

Образцы сыворотки готовили с использованием набора для анализа свободных аминокислот EZ: faast GCMS (Phenomenex, Торранс, Калифорния, США) и анализировали на газовом хроматографе-масс-спектрометре-QP2010 (Shimadzu, Киото, Япония) в соответствии с инструкции производителя. Условия были следующими: образцы вводили с использованием раздельного впрыска в соотношении 1:10 и температуре порта 280 ° C. Колонку Rtx-5MS () использовали для разделения соединений. Первоначальная температура печи была установлена ​​на уровне 100 ° C, затем повышена до 300 ° C со скоростью 10 ° C / мин, а затем выдержана в течение 10 минут.

2.3. Гистопатология

Нисходящие грудные аорты фиксировали в 10% формалине, заливали парафином и разрезали на 4 среза размером мкм и мкм. Регидратированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином (H&E) для наблюдения общих изменений и измерения толщины интима-медиа (IMT). Пять случайных неперекрывающихся полей зрения одного среза были захвачены на микроскопе Olympus DP71 (увеличение 400x). В каждом поле зрения IMT измеряли в четырех разных точках с помощью программного обеспечения ImageJ.Набор для окрашивания Verhoeff-Van Gieson (DC0059, Leagene, Beijing, China) использовался для наблюдения за эластичными волокнами в ткани.

2.4. Измерение концентрации NO и маркеров окислительного стресса в сыворотке и аорте

Образцы аорты обрабатывали ультразвуком в ледяном буфере для лизиса RIPA (P0013, Beyotime, Шанхай, Китай) и центрифугировали при 16000 g в течение 20 минут при 4 ° C. . Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа белков Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Хадсон, штат Нью-Хэмпшир, США) и доводили до тех же уровней.Для определения уровней метаболитов NO (S0021, Beyotime, Шанхай, Китай), общих уровней GSH (S0053, Beyotime, Шанхай, Китай), уровней малонового диальдегида (MDA) (S0131, Beyotime, Шанхай, Китай) и активности супероксиддисмутазы (SOD) (706002, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA) в соответствии с инструкциями производителей.

2,5. Измерение уровней AGE

100 мкл мкл образцов солюбилизированного белка пипеткой вносили в лунки 96-луночного непрозрачного планшета и оценивали автофлуоресценцию AGE при длинах волн Ex 370 нм / Em 440 нм [20].Набор AGE ELISA (MBS261131, MyBioSource, Сан-Диего, Калифорния, США) также применяли для определения концентраций AGE в соответствии с инструкциями производителя. Данные были нормализованы по концентрациям белка.

2.6. Иммуногистология

Мы следовали методам Wang et al. [21]. После блокирования срезы аорты инкубировали в течение ночи при 4 ° C с кроличьими антителами против AGE (1: 200, ab23722, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличьими антителами против RAGE (1: 200, ab3611, Abcam, Кембридж, Великобритания). Великобритания), кроличьи антитела против Nox4 (1: 150, ab133303, Abcam, Кембридж, Великобритания), мышиные антитела против 3-нитротирозина (1: 200, ab61392, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличьи антитела против NF- κ B p65 антитело (1: 200, D14E12, CST, Беверли, Массачусетс, США) или мышиное антитело против Glo1 (1: 200, MA1-13029, Invitrogen, Waltham, MA, США).Срезы промывали, а затем инкубировали со вторичным антителом (1: 200, конъюгированное с пероксидазой антитело против кролика (ZB-2301) или антитело против мыши (ZB-2305), ZSGB-BIO, Пекин, Китай) в течение 1 часа. Цвет был разработан с использованием DAB. Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus DP71. Среднее значение IOD окрашивания (IOD / площадь) из 5 случайных полей на одном срезе оценивалось с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0.

2.7. Вестерн-блот

Образцы солюбилизированного белка кипятили с загрузочным буфером в течение 5 мин.Равные количества белка (30 мкл г) разделяли с помощью электрофореза в 12% SDS-полиакриламидном геле и переносили электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком и инкубировали с кроличьими антителами против RAGE (1: 1000, ab3611, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличьими антителами против Nox4 (1: 1000, ab133303, Abcam, Кембридж, Великобритания). , кроличьи антитела против NF- κ B p65 (1: 1000, D14E12, CST, Беверли, Массачусетс, США) или мышиные антитела против Glo1 (1: 3000, MA1-13029, Invitrogen, Waltham, MA, USA) ) в течение ночи при 4 ° C.После тщательной промывки мембрану инкубировали со вторичными антителами (1: 5000, конъюгированные с пероксидазой антикроличьи (ZB-2301) или антимышиные (ZB-2305) антитела, ZSGB-BIO, Пекин, Китай) для получения час при комнатной температуре. β -Актин использовали в качестве контроля загрузки (1: 3000 TA-09, ZSGB-BIO, Пекин, Китай). Полосы визуализировали с использованием субстрата для вестерн-блоттинга ECL (Thermo Fisher Scientific, Hudson, NH, USA) и количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0.

2,8. Измерение активности Glo1

Активность Glo1 измеряли в соответствии с методом, установленным Arai et al.[22]. Образцы промывали PBS и обрабатывали ультразвуком в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (). После центрифугирования с помощью набора BCA определяли концентрацию белка и доводили ее до одинакового уровня во всех образцах. В 96-луночном планшете 125 мкл мкл натрий-фосфатного буфера (100 мМ), 25 мкл мкл GSH (40 мМ), 25 мкл мкл MG (40 мМ) и 70 мкл мкл Millipore воду добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин. После инкубации в каждую лунку добавляли 5 мкл мкл солюбилизированного белка из клеток или ткани аорты.Оптическую плотность при 240 нм () контролировали каждые 2 мин. Активность Glo1 отображалась как скорость изменения на мг белка.

2.9. Культура клеток и жизнеспособность

Линия эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) была куплена у Китайской национальной инфраструктуры ресурсов клеточных линий. HUVEC культивировали в минимально необходимых средах (MEM без глицина, глюкоза 5,5 мМ, Hyclone, Life Science, Питтсбург, Пенсильвания, США) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco, Life Science, Питтсбург, Пенсильвания, США), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкл г / мл стрептомицина при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .HUVEC были идентифицированы по их типичной морфологии булыжника и наличию антигена фактора фон Виллебранда (VWF).

Жизнеспособность клеток оценивали с использованием CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Donjindo, Mashikimachi, Japan). HUVEC засевали в каждую лунку 96-луночного планшета. После обработки каждую лунку осторожно промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы исключить возможное влияние любой оставшейся культуральной среды. В каждую лунку добавляли 10 мкл мкл раствора CCK-8 и 100 мкл мкл новой среды MEM без фенолового красного.После инкубации при 37 ° C в течение 3 часов измеряли оптическую плотность при 450 нм.

2.10. Иммунофлуоресценция.

HUVEC засевали на покровное стекло, помещенное в лунку 12-луночного планшета. После обработки все куски покровного стекла инкубировали в 10% нейтральном формалине в течение 10 минут, промывали 3 раза PBS и инкубировали с 0,1% реагентом Triton X-100 в течение 10 минут. Затем клетки блокировали в 1% BSA в течение 30 минут и инкубировали с 50 мкл мкл кроличьих антител против AGE (1: 200, ab23722, Abcam, Cambridge, UK) в течение ночи при 4 ° C.После обширной промывки в PBS клетки инкубировали с флуоресцентным вторичным антителом в течение часа в темной камере. После трехкратной промывки покровное стекло было установлено с помощью DAPI. Цифровые изображения флуоресцентного окрашивания были получены на микроскопе Olympus. Пять случайных неперекрывающихся полей зрения одной секции были захвачены для расчета средней интенсивности флуоресценции.

2.11. Оценка внутриклеточных активных форм кислорода (АФК)

Внутриклеточные АФК оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием чувствительного к окислению флуоресцентного зонда (2,7-дихлорфлуоресциндиацетат, DCFH-DA, D6883, Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури, США). Обработанные клетки осторожно промывали PBS и инкубировали с DCFH-DA (10 мкМ, М в MEM без фенолового красного). Через 30 минут клетки промывали 3 раза PBS и расщепляли 0,05% трипсин-ЭДТА. Средние интенсивности флуоресценции Ex 488 / Em 525 определяли с помощью проточной цитометрии.

2.12. Статистический анализ

Статистический анализ данных был выполнен с использованием SPSS 20.0 (SPSS Inc., Чикаго, США) в соответствии с методами, опубликованными в другом месте [21].Количественные данные представлены в виде ошибок средних (для нормально распределенных данных) или медианы и межквартильных диапазонов (для ненормально распределенных данных). Различия между группами оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) для нормально распределенных данных с последующим апостериорным тестом Тьюки. Кроме того, для ненормально распределенных данных использовался тест Краскела-Уоллиса. Значение менее 0,05 считалось значимым.

3. Результаты
3.1. Влияние глицина на уровень глюкозы в плазме, массу тела и уровень глицина в сыворотке

На 12 неделе уровни глюкозы в плазме в группе DM были значительно выше, чем в контрольной группе (Таблица 1).Масса тела и уровни глицина в сыворотке крови в группе DM были ниже, чем в контрольной группе (и, соответственно). По сравнению с группой DM, уровни глюкозы и масса тела в группе DG, казалось, не пострадали, тогда как уровни глицина в сыворотке были значительно увеличены ().

9012


Контроль CG DM DG

9012 9030 9012 мм 9030 9030 Масса тела (г)
Глицин сыворотки ( μ M) ###12 Контроль: здоровые крысы, получавшие обычную водопроводную воду.CG: здоровые крысы, получавшие водопроводную воду с добавлением 1% глицина. DM: диабетические крысы, получавшие обычную водопроводную воду. DG: диабетические крысы, получавшие водопроводную воду с добавлением 1% глицина. -8. , по сравнению с контрольной группой. по сравнению с группой DM.
3.2. Влияние лечения глицином на гистопатологию аорты и функцию сосудов

Чтобы оценить влияние лечения глицином на структуру ткани аорты, мы применили окрашивание H&E и Verhoeff-Van Gieson для изучения морфологических изменений.Окрашивание H&E (рис. 1 (а)) показало, что в группе DM как интимный, так и медиальный слои аорты были дезорганизованы, тогда как в группе DG наблюдалось гораздо меньше повреждений. Окрашивание Верхоффа-Ван Гизона (рис. 1 (b)) продемонстрировало, что эластичные волокна в группе DM демонстрировали серьезную фрагментацию и деформацию. При лечении глицином деформация эластиновых волокон была ниже, чем в группе DM, хотя и не восстановилась полностью.

Чтобы оценить влияние глицина на функцию эндотелия сосудов, мы измерили уровни метаболитов NO в сыворотке и аорте.Рисунки 1 (c) и 1 (d) показывают, что в группе DM концентрации метаболитов NO были значительно снижены как в сыворотке, так и в гомогенатах ткани аорты по сравнению с контрольной группой (и, соответственно). В группе DG концентрации метаболитов NO были значительно повышены по сравнению с этими концентрациями в группе DM (). Как показано на Рисунке 1 (e), между четырьмя группами не наблюдалось значительных различий в IMT аорты.

3.3. Глицин увеличивает антиоксидантную способность сыворотки диабетических крыс

Чтобы оценить влияние глицина на антиоксидантную способность, мы измерили уровни GSH, SOD и MDA в сыворотке и аорте крыс.В сыворотке крови уровни GSH и SOD в группе DM были значительно снижены по сравнению с контрольной группой (и, соответственно, фиг. 2 (a) и 2 (b)). Однако уровни GSH были значительно увеличены в группе DG по сравнению с группой DM (). Уровни SOD в группе DG имели тенденцию к повышению, но эта тенденция не достигла статистической значимости. Уровни MDA в сыворотке в группе DM были увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе (рис. 2 (c)), но это повышение было отменено в группе DG ().Никаких изменений этих маркеров в группе КГ не наблюдалось.

3.4. Глицин восстанавливает антиоксидантный статус в аорте диабетических крыс

В гомогенатах ткани аорты диабет значительно снизил уровни GSH и SOD по сравнению с контрольной группой (и, соответственно, рисунками 2 (d) и 2 (e)), тогда как обработка глицином значительно увеличила эти два антиоксидантных маркера (и, соответственно). Уровни MDA в аорте были увеличены в группе DM по сравнению с контрольной группой ().При обработке глицином уровни MDA у диабетических крыс были снижены (рис. 2 (f)). Явных изменений в группе CG по сравнению с контрольной группой не обнаружено. Как показала иммуногистология (Рисунки 2 (g) и 2 (h)), экспрессия 3-нитротирозина в аорте была значительно увеличена в группе DM по сравнению с контрольной группой (), особенно в интимном слое. Однако группа DG показала гораздо меньшее окрашивание 3-нитротирозина ().

3.5. Глицин подавляет накопление AGE и сигнальный путь RAGE-Nox-NF-
κ B

Хорошо известно, что AGE связывается со своим рецептором RAGE, который дополнительно активирует NADPH-оксидазу (Nox) [23] и воспалительную реакцию [24], в конечном итоге вызывая замкнутую петлю окислительного стресса в сосудистой ткани [2, 5].Таким образом, сигнальный путь AGE / RAGE представляет собой один из основных механизмов оксидативного стресса сосудов. Сообщалось, что добавка глицина может снизить уровень AGE в сыворотке диабетических крыс [17], но его влияние на сосудистую ткань остается неизвестным. Чтобы выяснить, был ли антиоксидантный эффект глицина связан с подавлением пути AGE / RAGE, мы измерили экспрессию AGE, RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Уровни сывороточного AGE в группе DM были значительно увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе (Фигуры 3 (a) и 3 (b)).Обработка глицином снижала уровни AGE в сыворотке, что определялось как с помощью автофлуоресценции, так и с помощью ELISA (и, соответственно). Аналогичным образом, уровни AGE в аорте были увеличены в группе DM, как обнаружено с помощью иммуногистологического анализа (фиг. 3 (c) и 3 (d)), но были снижены в группе DG (). Аналогичные результаты были также получены при измерении AGE в аорте с помощью ELISA (рис. 3 (е)).

Чтобы исследовать, может ли индуцированное глицином снижение AGE влиять на нижестоящий путь передачи сигналов AGE / RAGE, мы применили иммуногистологию и иммуноблоттинг для определения экспрессии RAGE, Nox4 и NF- κ B p65 в аорте.Как показано на рисунках 3 (f) –3 (n), экспрессия аортального RAGE, Nox4 и NF- κ B p65 значительно увеличилась в группе DM по сравнению с контрольной группой (,, и, соответственно) в вестерн-блоттинг. Однако экспрессия RAGE, Nox4 и NF- κ B в группе DG была значительно снижена по сравнению с таковой в группе DM (,, и, соответственно). Аналогичные результаты наблюдались и при иммуногистологическом анализе. Не было замечено значительных различий в группе CG по сравнению с контрольной группой.

3.6. Глицин увеличивает активность Glo1 аорты и экспрессию белка

Чтобы выяснить, является ли подавляющий эффект глицина на образование AGE следствием активации системы Glo1, мы измерили активность и экспрессию белка Glo1 аорты. Как показано в иммуногистологическом анализе (рисунки 4 (a) и 4 (b)), в группе DM наблюдалась гораздо меньшая экспрессия Glo1, чем в контрольной группе (), тогда как больший уровень окрашивания Glo1 был показан в группе пациентов с сахарным диабетом. Группа DG, чем в группе DM ().Как показано на фиг. 4 (c) и 4 (d), экспрессия и активность аортального Glo1 были значительно ниже в группе DM, чем в контрольной группе (). Однако как экспрессия, так и активность белка Glo1 были заметно увеличены в группе DG по сравнению с группой DM ().

3,7. Глицин восстанавливает жизнеспособность и функцию Glo1 в обработанных MG HUVEC

Чтобы исследовать, опосредовано ли подавление образования AGE и нижестоящего сигнального пути AGE / RAGE, вызванного обработкой глицином, с помощью Glo1, мы изучили HUVEC.Мы добавили 400 мкг M MG в среду для выращивания HUVEC для имитации дикарбонильного стресса, вызванного гипергликемией. Во время 72-часовой инкубации с MG некоторые из HUVEC также обрабатывали 0,5 мМ, 2 мМ или 4 мМ глицином. Как показано на рисунке 5 (а), жизнеспособность клеток упала на 35% при обработке MG в течение 72 часов (). И 2 мМ, и 4 мМ глицин защищали от повреждений, вызванных MG (). Обработка 0,5 мМ глицина не оказала очевидного влияния на жизнеспособность клеток.

Инкубация HUVEC с MG вызвала значительное снижение внутриклеточного соотношения GSH / GSSG по сравнению с контрольной группой (, Рисунок 5 (b)), но это снижение было обращено обработкой 2 мМ и 4 мМ глицином ().

Инкубация HUVEC с MG также вызвала значительное снижение активности клеточного Glo1 по сравнению с контрольной группой (). Как показано на Фигуре 5 (c), обработка глицином 2 мМ и 4 мМ значительно повышала активность Glo1 дозозависимым образом (и, соответственно). Не было обнаружено заметных изменений этих параметров в клетках, обработанных 0,5 мМ глицином.

3.8. Глицин ингибирует клеточное образование AGE и сигнальный путь RAGE-Nox-NF-
κ B в MG-обработанных HUVEC

Чтобы исследовать, может ли благоприятное влияние глицина на функцию Glo1 влиять на образование AGE и последующий путь AGE / RAGE, мы определили уровни AGE, RAGE, Nox4 и NF-κB p65 в обработанных MG HUVEC.Как показано на фиг. 6 (a) и 6 (c), инкубация HUVEC с MG в течение 72 часов значительно увеличивала образование AGE, что отражалось в иммунофлуоресцентном анализе и ELISA (и, соответственно). Исследование иммунофлуоресценции показало, что экспрессия AGE снижалась на 0,5 мМ, 2 мМ или 4 мМ глицина (,, и, соответственно), тогда как анализ ELISA показал, что только обработка 4 мМ глицином может значительно обратить вспять увеличение образования AGE. ().

Как показано на фиг. 6 (d) и 6 (f), уровни экспрессии RAGE, Nox4 и NF- κ B p65 в HUVEC были значительно увеличены при обработке MG в течение 72 часов ().Однако обработка 2 мМ или 4 мМ глицина значительно снижала уровни экспрессии RAGE (), Nox4 () и NF- κ B p65 (). Обработка 0,5 мМ глицина была эффективна только в подавлении клеточной экспрессии Nox4 ().

3.9. Обработка глицином снижает образование внутриклеточных ROS

Анализ проточной цитометрии показал, что после инкубации с MG в течение 72 часов внутриклеточная флуоресценция DCFH-DA, которая служит инструментом приблизительной оценки внутриклеточных ROS, была значительно увеличена на 50% по сравнению с контролем. группа (, Рисунки 6 (g) и 6 (h)).Однако при обработке 0,5 мМ, 2 мМ или 4 мМ глицина индуцированные MG сигналы флуоресценции DCFH-DA были значительно уменьшены (, и, соответственно).

3.10. Защитные эффекты глицина в подавлении образования AGE опосредованы Glo1

Чтобы выяснить, опосредуется ли влияние глицина на подавление AGE через Glo1, мы совместно обрабатывали HUVECs с 4 мкМ M ингибитором Glo1 S-бромбензилглутатиона, циклопентиловым диэфиром (BBGC). глицин в течение 72 ч. Наши результаты показали, что увеличение активности Glo1 за счет глицина уменьшилось (по сравнению с контролем, рис. 7 (а)).Кроме того, подавляющее действие глицина на образование AGE блокировалось BBGC (по сравнению с контролем, фигура 7 (b)).

4. Обсуждение

Окислительный стресс играет центральную роль в патогенезе сосудистых осложнений диабета. Глицин является предшественником синтеза GSH и, как известно, оказывает антиоксидантное действие на моделях диабетических осложнений [17, 19, 25–27]. Исследования показали роль глицина в восстановлении функции эндотелия сосудов у старых крыс [18] и у крыс с метаболическим синдромом [13], но влияние глицина на макроваскулярные повреждения, вызванные диабетом, и возможные механизмы любого такого эффекта все еще остаются неясными. .В настоящем исследовании мы обнаружили, что структурные нарушения в аорте крыс с диабетом, такие как искажение эластических волокон, заметно улучшались при лечении глицином. Кроме того, пониженные уровни метаболитов NO в сыворотке крови и гомогенатах аорты крыс с диабетом восстанавливались глицином, что позволяет предположить, что функция сосудов улучшалась обработкой глицином. Поскольку окислительный стресс может инактивировать NO [28] и привести к повреждению сосудов, мы предположили, что глицин может защищать ткань сосудов, уменьшая окислительный стресс.

Несмотря на то, что с питательной точки зрения глицин не является существенным, сообщается о его недостаточности как у пациентов с предиабетом, так и у пациентов с установленным диабетом [29, 30]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что уровни глицина в сыворотке крови в группе DM были снижены по сравнению с таковыми в контрольной группе, тогда как уровни глицина в группе DM были значительно увеличены по сравнению с таковыми в группе DM. В нормальных условиях уровень глицина в сыворотке крови человека колеблется от 200 до 400, мкМ, М [26].После лечения глицином уровень глицина у людей может даже вырасти до 942 мк М, но не вызывая побочных эффектов [31]. В нашем исследовании средний уровень глицина в сыворотке здоровых крыс составляет около 54% ​​от уровня глицина в сыворотке здоровых людей, о котором сообщают Sekhar et al. () [12], но схож с уровнем глицина у здоровых людей, о котором сообщают Tulipani et al. () [29]. Хотя концентрации глицина могут различаться между моделями крыс и людьми, существенные исследования показали, что у субъектов с диабетом или метаболическим синдромом уровни глицина снижаются по сравнению со здоровыми субъектами, но это снижение может быть отменено пероральным лечением глицином. [12, 13, 29, 32].

Параллельно со снижением уровней глицина в группе DM, уровни GSH в сыворотке и гомогенатах аорты в этой группе были снижены по сравнению с таковыми в контрольной группе, но были значительно увеличены в группе DG. Глицин также снижает уровни MDA в сыворотке и имеет тенденцию к улучшению активности SOD в сыворотке крови у крыс с диабетом. Глицин также значительно улучшил активность СОД и снизил уровни МДА и 3-нитротирозина в гомогенатах аорты. МДА является конечным продуктом перекисного окисления липидов, вызванного образованием АФК, а 3-нитротирозин служит маркером пероксинитрита, индуцированного окислительным стрессом.Снижение этих окислительных биомаркеров у крыс с диабетом при лечении глицином показало, что окислительный стресс, вызванный сахарным диабетом, заметно уменьшился к 12 неделям перорального лечения глицином.

Сообщалось, что AGE и нижестоящий путь передачи сигналов AGE / RAGE представляют собой основные механизмы оксидативного стресса сосудов [5, 33]. Образование AGE не является ферментативным и необратимым, и многие из таких реакций гликирования специфически происходят на долгоживущих макромолекулах, таких как коллаген [34], который обнаруживается в высоких концентрациях в стенках сосудов.После образования AGE не только накапливаются в сосудистой ткани, вызывая морфологические аномалии, но также активируют нисходящий путь RAGE-Nox-NF- κ B и вызывают устойчивый окислительный стресс [7, 23]. Окислительный стресс, вызванный гипергликемией, может, в свою очередь, усугубить накопление AGE и экспрессию RAGE [1, 16], тем самым создавая порочный круг, который приведет к постоянному повреждению. Следовательно, подавление образования AGE и окислительного стресса имеет решающее значение для предотвращения диабетических сосудистых осложнений.

Чтобы изучить, уменьшает ли глицин окислительный стресс посредством вмешательства оси AGE / RAGE, мы оценили влияние глицина на экспрессию AGE и нижестоящий путь AGE / RAGE. Уровни AGE в сыворотке и аорте диабетических крыс были значительно выше по сравнению с таковыми у здоровых контрольных крыс, но были значительно ниже у диабетических крыс, получавших лечение глицином. Между тем, уровни экспрессии RAGE, Nox4 и NF- κ B в аорте диабетических крыс были заметно увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе, но это повышение подавлялось обработкой глицином.Эти результаты продемонстрировали, что обработка глицином значительно ингибировала путь AGE / RAGE, тем самым ослабляя оксидативный стресс сосудов. Nox4 вносит основной вклад в генерацию сосудистых АФК [35, 36]. Снижение экспрессии аортального Nox4 в группе DG нашего исследования предполагает, что помимо участия в синтезе GSH, глицин также может работать, подавляя экспрессию окислительных ферментов. Этот результат также согласуется с нашим предыдущим исследованием, в котором сообщалось о влиянии перорального лечения глицином на подавление экспрессии островков p22 phox и окислительных маркеров на моделях диабетических крыс [37].Кроме того, недавно мы сообщили, что 20-недельное лечение глицином снизило уровни мРНК и белка Nox4 и улучшило антиоксидантную защиту в почках крыс с STZ-индуцированным диабетом [21]. Однако в этом исследовании предшествующий механизм, посредством которого глицин регулирует почечный Nox4, не исследовался. Основываясь на результатах настоящего исследования, есть соблазн предположить, что снижение Nox4 может быть результатом подавляющего действия глицина на экспрессию AGE и RAGE.

Эффект глицина на подавление образования AGE в аорте в нашем исследовании представляет особый интерес. Насколько нам известно, это первое исследование, которое предоставляет доказательства того, что глицин может ослаблять образование AGE в сосудистой ткани. Сообщалось, что некоторые биоактивные антиоксиданты, такие как урсоловая кислота [38] и кемпферол [39], могут подавлять образование AGE и снижать экспрессию белков оси AGE / RAGE, тем самым защищая от окислительного стресса и диабетических сосудистых повреждений.В предыдущих исследованиях сообщалось, что глицин может ингибировать индуцированное глюкозой гликирование в хрусталике, действуя как поглотитель глюкозы [27, 40], в то время как в другом исследовании предполагалось, что этот положительный эффект может быть связан с высокой растворимостью глицина, предотвращающим преципитацию AGE [ 41]. Тем не менее, молекулярные механизмы, посредством которых глицин подавляет образование AGE, четко не выяснены.

MG, высокореакционноспособное дикарбонильное соединение, все больше признается в качестве очень важного предшественника образования AGE [42].AGE, происходящие из MG, могут связываться с RAGE с высокой аффинностью и специфичностью [43], таким образом, более эффективно активируя ось AGE / RAGE. С традиционной точки зрения, процесс образования AGE — это медленная реакция между большими биомолекулами и восстанавливающими сахарами, такими как глюкоза, но недавние исследования показали, что MG в 200-20 000 раз более активен в образовании AGE, чем глюкоза [44, 45] . Используя GSH в качестве кофактора, Glo1 эффективно детоксифицирует MG, тем самым предотвращая образование AGE. GSH является критически важным антиоксидантом в организме человека, но уровень GSH недостаточен у пациентов с диабетом из-за чрезмерного окислительного стресса [12, 46].Кроме того, сообщалось, что активность Glo1 in vivo пропорциональна клеточной концентрации GSH [11, 14]. Тот факт, что глицин увеличивает синтез GSH и подавляет образование AGE, в нашем исследовании привел нас к гипотезе о том, что глицин может оказывать благотворное влияние на функцию Glo1, тем самым защищая от образования AGE. Таким образом, мы измерили экспрессию и активность аортального Glo1. Наши результаты показали, что экспрессия и активность Glo1 в аорте были снижены в группе DM по сравнению с контрольной группой, что указывает на нарушение способности Glo1 деградировать MG.Снижение функции Glo1 также частично объясняет увеличение образования AGE у диабетических крыс. По сравнению с таковыми в группе DM, экспрессия и активность аортального Glo1 в группе DG были значительно увеличены. Следовательно, разумно предположить, что глицин может восстанавливать функцию Glo1 за счет увеличения уровней GSH и улучшения экспрессии и активности Glo1, тем самым ингибируя образование AGE и последующий окислительный стресс.

Чтобы подтвердить, что подавляющий эффект глицина на оси AGE / RAGE был связан с наблюдаемым улучшением функции Glo1, мы инкубировали HUVEC непосредственно с 400 мкМ M MG в течение 72 часов, чтобы имитировать дикарбонильный стресс, вызванный гипергликемией.Наши результаты показали, что в HUVEC, обработанных MG, введение 4 мМ глицина значительно увеличивало активность Glo1, а также внутриклеточное соотношение GSH / GSSG, указывая на то, что функция Glo1 была восстановлена ​​обработкой глицином. Введение глицина также приводило к снижению образования клеточных AGE и значительному снижению уровней экспрессии нескольких белков нижнего пути передачи сигнала AGE / RAGE, включая RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Следовательно, внутриклеточный окислительный стресс, вызванный MG, был значительно ослаблен введением глицина.Кроме того, мы обнаружили, что ингибитор Glo1 BBGC значительно блокирует подавляющее действие глицина на образование AGE. Таким образом, наш эксперимент in vitro предоставил доказательства положительного воздействия глицина на предотвращение вызванной MG активации оси AGE / RAGE и последующего увеличения окислительного стресса.

Повреждение эндотелиальных клеток — раннее событие в развитии атеросклероза. Потеря внутриклеточного глутатиона связана с нарушением барьерной функции эндотелия [47].Равновесие между восстановленной формой глутатиона (GSH) и окисленной формой (GSSG) имеет решающее значение для поддержания клеточного окислительно-восстановительного статуса. Когда GSH окисляется для улавливания свободных радикалов, окисленный глутатион (GSSG) может быть повторно использован для регенерации GSH путем использования НАДФН в качестве кофактора. Однако при хроническом окислительном стрессе НАДФН потребляется полиольным путем, нарушая рециклинг глутатиона [1]. В нашем исследовании окислительный стресс, вызванный лечением MG, заметно истощил восстановленную форму глутатиона (GSH) и увеличил содержание GSSG в HUVEC, тем самым уменьшив соотношение GSH / GSSG и, следовательно, нарушив функцию Glo1.Когда внутриклеточный GSSG приближается к цитотоксическому уровню, он может транспортироваться за пределы клеток [48], что в конечном итоге может привести к недостаточности общего содержания глутатиона из-за недоступности субстратов. Эта гипотеза подтверждается значительным снижением уровней общего глутатиона в сыворотке и гомогенатах ткани аорты крыс с диабетом в нашем исследовании. Однако в группе DG как общее содержание глутатиона in vivo , так и соотношение GSH / GSSG in vitro были значительно увеличены по сравнению с таковыми в группе DM.Этот эффект добавления глицина на поддержание равновесия GSH подтверждается другими исследованиями, в которых сообщалось, что пероральное лечение глицином восстанавливает нарушенные уровни GSH на моделях диабетического или метаболического синдрома [12, 13, 37]. Кроме того, глицин может даже быть фактором, ограничивающим скорость синтеза GSH в ткани, согласно исследованию Mohammed et al. [32], в которых подчеркивается роль глицина в поддержании антиоксидантной защиты.

Значительные доказательства показали, что экспрессия Glo1 может усиливаться биоактивными антиоксидантами [49–52].Хотя механизмы все еще остаются неясными, роль ядерной транслокации ядерного фактора, связанного с эритроидом-2, фактора 2 (Nrf2) все больше признается. Nrf2 представляет собой окислительно-восстановительный фактор транскрипции, который регулирует уровни экспрессии различных антиоксидантных ферментов, включая SOD, гемоксигеназу 1 и глутамилцистеинсинтетазу. Недавно сообщалось, что Nrf2 также связывается с элементами антиоксидантного ответа (ARE) в экзоне 1 Glo1 [53]. Следовательно, транслокация Nrf2 в ядро ​​может увеличивать экспрессию Glo1 и повышать его активность.Ранее мы обнаружили, что глицин может способствовать ядерной транслокации Nrf2 в почках диабетических крыс (неопубликованные данные), но влияние глицина на активацию Nrf2 в сосудистой ткани не исследовалось. Тем не менее, это оставляет открытой возможность того, что положительные эффекты глицина на функцию Glo1 сосудов могут быть приписаны ядерной транслокации Nrf2.

Это исследование действительно имеет некоторые ограничения. Уровни MG в разных группах в эксперименте на животных не измеряли; таким образом, прямая функция Glo1 в деградации MG не была определена.Таким образом, в эксперименте in vitr o мы напрямую инкубировали HUVEC с MG, чтобы исследовать влияние глицина на вызванное MG повреждение в сосудистых клетках, и подтвердили, что глицин способен защищать функцию Glo1. Более того, в нашем исследовании концентрации глицина, использованные в экспериментах с культурами клеток, были выше, чем уровни глицина, измеренные в сыворотке крови животных. В HUVEC мы начали с 0,5 мМ глицина, потому что эта концентрация была близка к средним уровням глицина в сыворотке, обнаруженным в группе DG эксперимента на животных.Однако 0,5 мМ глицина было недостаточно для защиты от повреждения клеток, вызванного MG. Следовательно, концентрация глицина была увеличена до 2 мМ и 4 мМ. Кроме того, в клеточных экспериментах мы использовали ингибитор Glo1 только для нарушения функции Glo1, что могло привести к неспецифическим эффектам. Нокдаун Glo1 с использованием siRNA обеспечит дополнение к исследованию ингибиторов и лучше продемонстрирует специфический механизм действия глицина на Glo1.

Таким образом, наше исследование продемонстрировало, что глицин ослабляет окислительный стресс в аорте диабетических крыс, ингибируя накопление AGE и последующий путь передачи сигнала RAGE-Nox-NF- κ B.Кроме того, положительный эффект глицина на подавление образования AGE может быть связан с увеличением активности Glo1 и синтеза GSH. Точный механизм, лежащий в основе роли глицина в защите от диабетических макрососудистых повреждений, все еще требует дальнейшего изучения, чтобы расширить варианты лечения, доступные для клинической практики.

Доступность данных

Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Раскрытие информации

Финансирующая организация не принимала участия в написании, редактировании, утверждении рукописи или принятии решения о публикации.

Конфликт интересов

У авторов нет конфликта интересов в отношении данной статьи.

Выражение признательности

Эта работа была поддержана при финансовой поддержке Клинических медицинских исследований Китайской медицинской ассоциации (номер гранта 13040700455), Китайской национальной программы ключевых исследований и разработок в течение 13-го пятилетнего плана (номера грантов 2016YFC1305401 и 2016YFC1305405) и Пекинской городской науки и технологический проект (номер гранта D17110000281701).Мы благодарим LetPub (http://www.letpub.com) за лингвистическую помощь при подготовке этой рукописи.

Глицин может предотвращать вирусную инвазию и бороться с ней за счет усиления внеклеточного матрикса

https://doi.org/10.1016/j.jff.2020.104318Получить права и контент

Основные моменты

Внеклеточный матрикс является физическим барьером против инфекционных агентов.

Коллаген (с высоким содержанием глицина) является основным белком внеклеточного матрикса.

Глицин — незаменимая аминокислота, как было показано ранее.

Дефицит глицина вызывает слабую механическую систему, включая внеклеточный матрикс.

Прием глицина в качестве пищевой добавки был очень эффективным против вирусных инфекций.

Abstract

Внеклеточный матрикс, в основном состоящий из коллагена, представляет собой механический барьер против инфекционных агентов, включая вирусы.Высокая доступность глицина необходима для здорового обмена коллагена. Глицин, продуцируемый человеческим метаболизмом, намного ниже, чем потребности клетки, поэтому у людей общий дефицит глицина составляет 10 г / день. Этот эффект был протестирован в течение трех лет на 127 добровольцах, которые заражались вирусными инфекциями, как правило, один или несколько раз в год. 85 из них принимали глицин по 10 г / сут; 42 не принимали глицин. Среди тех, кто принимал глицин, только 16 (12 из которых заражались два или более раз в год) болели гриппом только в первый год — но значительно уменьшились по тяжести и продолжительности — в то время как те, кто не принимал глицин, инфицировались так же часто. и так же сурово, как и раньше.Прием глицина в вышеупомянутой дозе предотвращает распространение вирусов, укрепляя барьеры внеклеточного матрикса против их распространения.

Ключевые слова

Глицин

Коллаген

Внеклеточный матрикс

Инфекционные заболевания

Вирусы

Аббревиатуры

AdoMet

аденозил-метионин

THF- [C 900me91 1

4 THF- [C 900me91 1

4] тетрагидрофолат

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Авторы.Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Кардиометаболические преимущества глицина: является ли глицин «противоядием» от диетической фруктозы?

Сосудистые защитные свойства дополнительного глицина

Дополнительный глицин посредством активации глицин-управляемых хлоридных каналов, которые экспрессируются на ряде типов клеток, включая клетки Купфера, макрофаги, лимфоциты, тромбоциты, кардиомиоциты и эндотелиальные клетки, оказывает противовоспалительное, иммуномодулирующее, цитопротекторное действие. , стабилизирующие тромбоциты и антиангиогенные эффекты в исследованиях на грызунах, которые могут иметь клиническое значение.1–17 Концентрация глицина в плазме у нормально питающихся людей — около 200 мкМ — близка к K m для активации этих каналов, подразумевая, что можно ожидать, что многократное увеличение глицина в плазме, достижимое с практическими добавками, приведет к дальнейшей активации этих каналов. in vivo.18, 19 Влияние такой активации на поляризацию мембраны будет зависеть от содержания внутриклеточных хлоридов; клетки, которые активно концентрируют хлорид против градиента, будут деполяризованы активацией канала, тогда как другие клетки будут испытывать гиперполяризацию.В клетках, которые не могут концентрировать хлорид и которые экспрессируют активируемые напряжением кальциевые каналы, глицин имеет тенденцию подавлять приток кальция; этот эффект, как полагают, опосредует большую часть защиты, обеспечиваемой глицином. Роль активации хлоридных каналов в опосредовании физиологических эффектов глицина обычно оценивается одновременным применением стрихнина, ингибитора хлоридных каналов; если это отменяет действие глицина, этот эффект, скорее всего, опосредуется хлоридными каналами.

С точки зрения здоровья сосудов, недавнее сообщение о том, что глицин может стабилизировать тромбоциты, представляет очевидный интерес.7 Когда крыс кормили рационом, содержащим 2,5–5% глицина, время кровотечения увеличивалось примерно вдвое, а амплитуда агрегации тромбоцитов в цельной крови, вызванной АДФ или коллагеном, уменьшалась вдвое. Этот эффект был заблокирован стрихнином, и исследователи смогли подтвердить, что тромбоциты экспрессируют хлоридные каналы, управляемые глицином. Они также продемонстрировали, что человеческие тромбоциты также реагируют на глицин и экспрессируют такие каналы. Очевидно, что исследования, оценивающие взаимодействие глицина с аспирином или другими фармацевтическими агентами, стабилизирующими тромбоциты, будут подходящими, как и клиническое исследование, изучающее влияние дополнительного глицина на функцию тромбоцитов.

Другое недавнее исследование установило, что кардиомиоциты экспрессируют хлоридные каналы.17 Это может рационализировать доказательства того, что предварительное введение глицина (500 мг / кг внутрибрюшинно) уменьшает размер инфаркта на 21%, когда крысы впоследствии подвергаются сердечному ишемическому реперфузионному повреждению; этот эффект был связан с увеличением фракции выброса желудочков и фракционным укорочением у животных, предварительно обработанных глицином, по сравнению с контролем.17 Эта защита была связана со снижением апоптоза кардиомиоцитов, притупленной активацией киназы p38 MAP и JNK и снижением экспрессии лиганда Fas.В предыдущем исследовании сообщалось, что 3 мМ глицина способствует увеличению выживаемости кардиомиоцитов in vitro, подвергшихся 1 часу ишемии, а затем реоксигенированных, а также оказывает защитное действие в модели реперфузии ишемии сердца ex vivo.20

Сосудистые эндотелиальные клетки экспрессируют управляемые глицином хлоридные каналы, и было высказано предположение, что глицин может оказывать антиатеросклеротический эффект за счет гиперполяризации эндотелия сосудов.19 Поскольку такие клетки не экспрессируют потенциал-управляемые кальциевые каналы, влияние гиперполяризации эндотелия должно усиливаться. приток кальция, поскольку кальций следует градиенту заряда.21 Ожидается, что это, в свою очередь, будет способствовать опосредованной кальцием активации эндотелиальной синтазы оксида азота. Более того, поляризация эндотелия влияет на активность оксидазы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН); это усиливается деполяризацией и, наоборот, подавляется гиперполяризацией. 22-24 Предполагается, что защитное действие на сосуды богатой калием диеты частично опосредовано эндотелиальной гиперполяризацией, которая возникает в результате умеренного физиологического повышения уровня калия в плазме (что отражает повышенную активность. электрогенного натриевого насоса).25, 26 При прочих равных факторах можно ожидать, что увеличение выработки эндотелиального оксида азота в сочетании со снижением выработки супероксида будет иметь антиатерогенный и антигипертензивный эффект. В пользу антиатеросклеротического потенциала глицина говорит также исследование, демонстрирующее, что глицин оказывает противовоспалительное действие на клетки коронарных артерий человека, подвергшихся действию фактора некроза опухоли (TNF) α in vitro; активация NF-κB была подавлена, как и экспрессия E-селектина и интерлейкина-6.27 Пока нет опубликованных исследований, оценивающих влияние диетического глицина на атерогенез на моделях грызунов. Доказательства того, что глицин оказывает антигипертензивное действие у крыс, получавших сахарозу, обсуждаются ниже.

Глицин является биосинтетическим предшественником креатина, гема, нуклеиновых кислот и ключевого внутриклеточного антиоксиданта глутатиона. Меры, которые повышают или сохраняют уровни внутриклеточного глутатиона, могут быть полезны с точки зрения опосредованных окислителями механизмов, ухудшающих здоровье сосудов.В недавнем клиническом исследовании сообщается, что одновременный прием пожилых участников глицина и цистеина (100 мг / кг / день каждого, цистеин, вводимый в виде его производного ацетила N ) обращает вспять заметное возрастное снижение уровней глутатиона в эритроцитах при одновременном снижении сывороточные маркеры окислительного стресса28; Авторы, однако, не доказали, что дополнительный глицин имел решающее значение для этого эффекта.

Что касается диабета, интересно, что высокое потребление глицина может препятствовать образованию продуктов Амадори, предшественников конечных продуктов гликирования (AGE), которые опосредуют диабетические осложнения.29, 30 Действительно, добавление диабетикам глицина — 5 г, 3-4 раза в день — снижает гликирование гемоглобина.31, 32 Подобный эффект был зарегистрирован у крыс с диабетом, леченных стрептозотоцином. AGE как таковые, поэтому их выводы следует интерпретировать с осторожностью. Тем не менее, добавка глицина задержала прогрессирование катаракты, ингибировала образование микроаневризмы, нормализовала пролиферативный ответ мононуклеарных клеток крови и способствовала гуморальному иммунному ответу у диабетических крыс, эффекты, которые предполагают, что глицин может иметь потенциал для предотвращения некоторых диабетических осложнений.34–36 В недавнем контролируемом, но неслепом исследовании пациенты с диабетом, страдающие слуховой нейропатией, достигли улучшения остроты слуха и проводимости по слуховым нервам при приеме 20 г глицина ежедневно в течение 6 месяцев37.

Глицин защищает от метаболического синдрома, вызванного сахарозой

Особый интерес представляют исследования, показывающие, что высокое потребление глицина может противодействовать многим побочным эффектам диеты с высоким содержанием сахарозы на печень, жировую массу и функцию сосудов у крыс.38, 39 Глицин снижает повышенное содержание неэтерифицированных жирных кислот в печени крыс, получавших сахарозу, увеличивает степень окисления митохондрий печени в состоянии IV, корректирует повышение артериального давления, нормализует уровень триглицеридов и инсулина в сыворотке крови, предотвращает повышение уровня глюкозы в крови. абдоминальная жировая масса и, в сосудистой сети, усиление глутатиона, снижение окислительного стресса и нормализация эндотелий-зависимой вазодилатации. Вероятно, актуальным для этих результатов является недавнее клиническое сообщение о том, что дополнительное введение глицина (15 г в день в три приема), вводимое пациентам с метаболическим синдромом, уменьшало показатели окислительного стресса в эритроцитах и ​​лейкоцитах, одновременно снижая систолическое артериальное давление.40 Эти результаты представляют значительный интерес, особенно в свете доказательств того, что высокое потребление фруктозы с пищей может способствовать развитию метаболического синдрома и неалкогольной жировой болезни печени у людей, а также повышать уровень холестерина ЛПНП.41–43

Защитные эффекты глицина у крыс, получавших сахарозу, и у людей с метаболическим синдромом нелегко объяснить на основе известных метаболических эффектов глицина. Известно, что фруктоза оказывает неблагоприятное воздействие, прежде всего, через ее влияние на метаболизм в печени; он катаболизируется почти исключительно в печени, и его окисление, в отличие от глюкозы, не регулируется метаболическими потребностями.41, 44 В результате высокое потребление фруктозы наводняет печень субстратом и подавляет окисление жирных кислот печени, одновременно способствуя липогенезу de novo и синтезу триглицеридов; повышенное образование малонил-кофермента А отвечает за первые два эффекта, тогда как увеличение глицерин-3-фосфата вносит важный вклад в стимулирующее влияние фруктозы на синтез триглицеридов. Эти эффекты также увеличивают продукцию диацилглицеринов в печени, что снижает чувствительность печени к инсулину за счет активации протеинкиназы C-ε.45, 46 Можно ожидать, что повышенное содержание триглицеридов в гепатоцитах, подвергшихся воздействию фруктозы, стабилизирует апоВ100 и ускорит секрецию частиц липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) 47, 48; это явление может объяснить повышение холестерина ЛПНП, вызванное высоким потреблением фруктозы.42 Повышенная печеночная секреция триглицеридов ЛПОНП, по-видимому, ответственна за увеличение висцерального жира, наблюдаемое у грызунов и людей, получавших диету с высоким содержанием фруктозы41. метаболический синдром, включая повышение артериального давления, частично вызванное гиперинсулинемией49 (рис. 1).

Рисунок 1

Воздействие фруктозы на печень.

Недавно появились данные о том, что фруктоза может также косвенно действовать, усиливая глюконеогенез в печени. Фруктоза, но не глюкоза, может активировать AMP-киназу (AMPK) в определенных областях гипоталамуса, что приводит к увеличению выработки кортикостероидов кортикостероидами надпочечников, которые способствуют транскрипции в печени фосфоенолпируваткарбоксикиназы, ограничивающей скорость глюконеогенеза.50

Как глицин вмешивается в этот процесс? Мы предполагаем, что стимулированная глицином секреция глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) и самого глюкагона играет ключевую роль в этом отношении.

Глицин может стимулировать высвобождение GLP-1 и глюкагона

Gameiro et al. , 51, работая с клеточной линией GLUTag, полученной из L-клеток кишечника — типа клеток, специализирующихся на продукции GLP-1 в слизистой оболочке кишечника, — обнаружили, что глицин вызывает увеличение секреции GLP-1 в этих клетках. клетки. Это отражает активацию управляемых глицином хлоридных каналов, которая запускает снижение поляризации мембраны, что приводит к увеличению свободного кальция в цитоплазме и последующему высвобождению GLP-1.Способность этих хлоридных каналов уменьшать поляризацию мембран в этих клетках отражает тот факт, что они концентрируют хлорид через транспортер Na + -K + -2Cl . Лекарства, которые ингибируют каналы, управляемые глицином, или механизм захвата хлоридов, не позволяют глицину стимулировать высвобождение GLP-1 в клетках GLUTag. Поскольку апикальные микроворсинки L-клеток обращены к просвету кишечника, они идеально подходят для обнаружения увеличения глицина в содержимом просвета.Следовательно, можно ожидать, что добавка глицина повысит выработку GLP-1. Хотя, по-видимому, нет никаких исследований, в которых изучалась бы реакция GLP-1 на пероральный прием глицина как такового, есть два клинических исследования, демонстрирующих, что уровни GLP-1 в плазме повышаются после приема желатина, белка, чрезвычайно богатого глицином (составляющим 30% аминокислот) .52, 53 Это может объяснить, почему, когда глюкозу давали пациентам с диабетом 2 типа в сочетании с семью различными белками, желатин уступал только творогу в потенциале постпрандиального инсулинового ответа.54

Также сообщалось, что пероральное введение глицина людям (75 мг глицина / кг безжировой массы) стимулирует увеличение секреции глюкагона α-клетками поджелудочной железы.55 Этот ответ сводится на нет, если глюкоза попадает в организм одновременно, что, скорее всего, отражает влияние вызванная глюкозой секреция соматостатина из островковых δ-клеток.56 Утверждение о том, что пероральный глицин стимулирует выработку GLP-1, трудно согласовать с влиянием глицина на глюкагон, поскольку GLP-1, как известно, ингибирует секрецию глюкагона α-клетками, либо напрямую, либо провоцируя секрецию соматостатина δ-клетками.57 Однако недавно появились доказательства того, что глицин может действовать непосредственно на α-клетки как стимулятор секреции глюкагона — и, возможно, этот эффект превосходит эффект GLP-1 (влияние GLP-1 на секрецию соматостатина может быть незначительным, когда глюкоза находится на базальном уровне). , а экспрессия рецептора GLP-1 на α-клетках очень низкая57). Li et al. 58 показали, что α-клетки экспрессируют управляемые глицином хлоридные каналы, которые при активации запускают приток кальция и высвобождение глюкагона. Это предполагает, что α-клетки, подобные L-клеткам, обладают механизмом внутриклеточной концентрации хлоридов, так что опосредованное рецептором увеличение проницаемости мембраны запускает отток хлоридов и деполяризацию мембраны.Поскольку сродство глициновых каналов к глицину близко к концентрации глицина в плазме натощак 51, можно ожидать, что повышение уровня глицина в плазме, вызванное добавками, вызовет увеличение секреции глюкагона. В одном довольно старом исследовании не было обнаружено увеличения секреции глюкагона при внутривенном введении глицина до тех пор, пока глицин не достиг надфизиологического уровня59; неясно, почему результаты этого исследования кажутся несовместимыми с результатами двух ранее процитированных исследований.

Примечательно, что GLP-1 и глюкагон работают взаимодополняющими способами, способствуя окислению жирных кислот и противодействуя липогенезу в печени. 60–65 Эффекты глюкагона, по-видимому, опосредуются главным образом цАМФ, тогда как GLP-1 запускает активацию AMPK в печени. гепатоциты. Совместное действие GLP-1 и глюкагона на печень может легко объяснить способность дополнительного глицина противодействовать избыточному синтезу триглицеридов в печени, которому способствует кормление сахарозой или фруктозой (см. Рисунок 2).Действительно, было показано, что агонисты GLP-1 защищают от стеатоза печени у крыс, получавших сахарозу, и имеют клиническое применение при неалкогольной жировой болезни печени.66–70 К счастью, хотя можно было ожидать, что глюкагон будет способствовать глюконеогенезу в печени, GLP- 1-опосредованная активация AMPK будет иметь тенденцию нейтрализовать этот эффект.71 Действительно, AMPK подавляет транскрипцию фосфоенолпируваткарбоксикиназы в печени, потенциально компенсируя стимулирующее воздействие вызванного фруктозой кортизола в этом отношении.72–74

Рисунок 2

Гепатопротекторные механизмы глицина.

Интересно, что недавно были разработаны пептидные препараты с двойным агонизмом для рецепторов GLP-1 и глюкагона, и эти агенты продемонстрировали заметный положительный эффект у мышей с ожирением, вызванным диетой.75–77 Они могут вызывать потерю веса на 15–20%. , умеренно снизить потребление калорий при одновременном повышении термогенеза, снизить уровни триглицеридов в печени и сывороточные уровни триглицеридов и холестерина ЛПНП, улучшить чувствительность к инсулину и толерантность к глюкозе и противодействовать лептиновой резистентности.Эти полезные метаболические эффекты лишь частично можно отнести на счет связанной с этим потери веса и значительно превосходят преимущества, наблюдаемые только при применении агонистов GLP-1. Эти агенты обеспечивают постоянную стимуляцию своих рецепторов-мишеней и, следовательно, достигают более сильных эффектов, чем диетический глицин, который в лучшем случае может лишь эпизодически повышать уровни GLP-1 и глюкагона. Тем не менее, хотя глицин не вызывает потерю веса и не снижает потребление калорий у мышей, получавших сахарозу, он снижает запасы висцерального жира более чем на 50%, увеличивает термогенный потенциал митохондрий печени за счет увеличения дыхания в состоянии 4, облегчает стеатоз печени и улучшает чувствительность к инсулину и липиды сыворотки.Следовательно, его эффекты гомологичны, если не так драматичны, как эффекты, наблюдаемые с препаратами-коагонистами.

Дальнейшие последствия активации GLP-1

Если дополнительный глицин действительно увеличивает секрецию GLP-1, это может иметь интересные последствия для профилактики и лечения диабета, а также для сохранения здоровья сосудов. Как хорошо известно, функция GLP-1 усиливает секрецию инсулина, стимулированную глюкозой, и это является основой для терапевтического применения при диабете аналогов GLP-1, таких как лираглутид и экзенатид, которые активируют рецептор GLP-1, но в значительной степени более длительный период полураспада благодаря их устойчивости к разложению дипептидилпротеазой-4 (DDP-4).78 Эндогенно продуцируемый GLP-1 имеет период полураспада в плазме всего несколько минут из-за его быстрой деградации под действием DDP-4; следовательно, препараты, которые могут безопасно ингибировать DDP-4, такие как ситаглиптин, в настоящее время используются для продления эффективности эндогенно продуцируемого GLP-1 у пациентов с диабетом.79 Если дополнительный глицин действительно увеличивает выработку GLP-1, его, вероятно, можно использовать. в качестве адъюванта к терапии DDP-4 и, как самостоятельная мера, может иметь некоторый потенциал для первичной профилактики диабета.

Более того, если дополнительный глицин может способствовать физиологически значимому увеличению выработки GLP-1, он может иметь более широкий защитный потенциал, чем считается в настоящее время, что отражает разнообразные и в значительной степени защитные физиологические эффекты GLP-1.80 в отношении здоровья сосудов, GLP-1 агонистические препараты оказывают кардиозащитное действие на моделях инфаркта миокарда и застойной недостаточности у грызунов.81–84 Клинически они способствуют умеренной потере веса у пациентов с диабетом и не страдающими ожирением, а также оказывают благоприятное воздействие на систолическое артериальное давление, липиды сыворотки крови, маркеры воспаления и эндотелиальная функция.85, 86 Читатели, интересующиеся защитными свойствами сосудов агонизма GLP-1, могут быть отосланы к недавнему обзору Lorber.86 Оценка влияния дополнительного глицина на продукцию GLP-1 должна быть высокоприоритетной клинической задачей.

Воздействие на активацию клеток Купфера

Заметная полезность пищевого глицина в моделях алкогольного стеатоза на грызунах объясняется его способностью подавлять активацию клеток Купфера.9, 87 Кормление этанолом, способствуя кишечной проницаемости, способствует притоку бактериальных эндотоксинов в портал.В результате активации клеток Купфера гепатоциты подвергаются действию провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, которые играют ключевую роль в индукции стеатогепатита. Глицин противодействует активации клеток Купфера через каналы, управляемые глицином, как обсуждалось ранее.

Недавно появились данные о том, что диета с высоким содержанием фруктозы у крыс также нарушает барьерную функцию кишечника, что приводит к активации клеток Купфера, что усугубляет стеатоз, индуцированный фруктозой.88–90 Разумно подозревать, что диета с высоким содержанием глицина будет защитный в этом отношении, как это было в моделях грызунов вызванного алкоголем стеатоза.Неизвестно, играет ли активация клеток Купфера роль в стеатозе печени, вызванном диетой с высоким содержанием фруктозы.

К счастью, порошок глицина недорогой, хорошо растворим и имеет приятный сладкий вкус; действительно, его название происходит от греческого слова «сладкий» 16. Клинически полезные эффекты наблюдались у пациентов с метаболическим синдромом или диабетом при приеме глицина по 5 г 3–4 раза в день без заметных побочных эффектов.32, 40 Глицин легко вводится путем смешивания с выбранной жидкостью, и он должен хорошо подходить для включения в функциональные продукты питания.Потребление глицина также может быть увеличено за счет приема желатина.

Является ли мочевая кислота опосредующим фактором риска?

Предположение о том, что глицин может действовать как «противоядие» против неблагоприятного метаболического воздействия фруктозы, должно противоречить тому факту, что фруктоза может заметно усиливать выработку мочевой кислоты в печени. Болюсное введение фруктозы приводит к быстрой выработке АДФ в печени из-за нерегулируемой активности фруктокиназы; это, в свою очередь, может привести к ускоренному производству катаболитов АМФ, аденозина и пуринов, включая конечный катаболит (у людей) мочевую кислоту.Способность богатой фруктозой диеты повышать уровень уратов в сыворотке хорошо известна, и нет никаких оснований предполагать, что глицин может предотвратить этот эффект. Этот урат не представляет проблемы для грызунов, получавших фруктозу, поскольку их уриказная активность превращает урат в нетоксичный аллантоин, но люди не экспрессируют уриказу. Физиологические уровни уратов в организме человека явно токсичны для тканей грызунов, поскольку они способствуют окислительному стрессу за счет активации НАДФН-оксидазы.91–93

Повышенные уровни уратов у людей, помимо риска развития подагры или подагрической нефропатии, представляют собой хорошо установленный фактор риска коронарной болезни, гипертонии, диабета 2 типа и сердечной недостаточности, что подтверждается метаанализами 94–98, хотя воздействие часто оказывается слабым, когда корректируются другие факторы риска, связанные с метаболическим синдромом.Вопрос о том, является ли мочевая кислота опосредующим фактором риска этих расстройств, очень спорен. В пользу этой точки зрения говорят исследования, демонстрирующие, что ингибирование ксантиноксидазы аллопуринолом часто благоприятно влияет на эндотелиальную дисфункцию99–101; однако контраргумент состоит в том, что активность ксантиноксидазы генерирует супероксид, поэтому аллопуринол может просто действовать как антиоксидант в этих обстоятельствах.102

Более того, в нескольких исследованиях, в которых уровни уратов резко модулировались с помощью мер, отличных от ингибирования ксантиноксидазы — повышения их с помощью внутривенной инфузии, снижения с помощью инфузии уратоксидазы — не удалось выявить какого-либо неблагоприятного воздействия уратов на функцию эндотелия или другие сердечно-сосудистые показатели.103, 104 Действительно, было обнаружено, что инфузия уратов улучшает функцию эндотелия у пациентов с диабетом 1 типа, что, возможно, отражает полезность уратов в качестве поглотителя пероксинитрита.105 Долгосрочное заметное повышение уровня уратов при добавлении инозина — изучается на пациентах. с рассеянным склерозом в качестве антиоксидантной стратегии — не смог повлиять на артериальное давление.106 Возможно, наиболее убедительно то, что в ряде недавних менделевских рандомизационных анализов, сосредоточенных на полиморфизмах почечных канальцевых транспортных белков для уратов, которые влияют на уровни уратов в сыворотке, не было обнаружено какого-либо воздействия эти полиморфизмы по риску сердечных заболеваний, субклинического атеросклероза, диабета, гипертонии, метаболического синдрома или диабета107–111 — за исключением одного небольшого исследования, нацеленного на популяцию амишей, которое выявило связь с артериальным давлением.112 Общий вывод этих исследований состоит в том, что ожирение и метаболический синдром повышают уровень уратов в сыворотке, и что первые, а не ураты сами по себе, опосредуют повышенный риск, связанный с повышенными уровнями уратов. Гиперинсулинемия, связанная с метаболическим синдромом, способствует задержке уратов почками, по крайней мере частично объясняя гиперурикемию, которая является характерной чертой этого синдрома.113 Похоже, что у приматов выработалась устойчивость к прооксидантным эффектам уратов, продемонстрированным у грызунов, таким образом, что потеря их уриказная активность не ставила под угрозу их дарвиновскую жизнеспособность.

Следовательно, неспособность глицина справиться с опосредованным фруктозой повышением уровней уратов в сыворотке, что, к сожалению, с точки зрения риска подагры, не может быть неблагоприятным с точки зрения здоровья сосудов. Повышенные уровни уратов, по-видимому, обеспечивают некоторую защиту от болезни Паркинсона — открытие подтверждено методом менделевской рандомизации114, 115

Раскрытие потенциала аминокислот: страсть и немного удачи | Истории | Глобальный веб-сайт Ajinomoto Group

Некоторые научные открытия случаются случайно, например пенициллин.В 1928 году биолог Александр Флеминг вернулся в свою лабораторию из отпуска и обнаружил плесень, растущую в чашке Петри, содержащую бактерии, ответственные за многие распространенные инфекции. Он заметил, что бактерии не будут расти рядом с плесенью. Исследования показали, что плесень penicillium может использоваться для борьбы с патогенами, вызывающими различные заболевания, от пневмонии и дифтерии до менингита и скарлатины. Открытие Флеминга породило область антибиотиков и в конечном итоге спасло бесчисленные миллионы жизней.

Нечто подобное, хотя и менее важное, произошло в начале 2000-х, когда группа Аджиномото изучала физиологические эффекты двух аминокислот. В слепом исследовании участвовала контрольная группа, получавшая плацебо. Это плацебо содержало третью аминокислоту, глицин, которая, как считается, не имеет особых свойств. Один из исследователей, участвовавших в исследовании, иногда забывал принять свою дозу утром и вместо этого принимал две перед сном. В те ночи он заметил, что спал лучше, и просыпался отдохнувшим.Когда тест был закончен, он узнал, что принимал плацебо, содержащее глицин. Дальнейшие исследования привели к разработке в 2005 году добавки на основе глицина, которая помогает людям спать.

Это открытие послужило источником вдохновения для одного человека. В то время Чика Моришима была разработчиком продуктов питания, недавно переведенных в подразделение по доставке аминокислотных добавок Ajinomoto Group по почте. Добавка глицина была ее введением в область науки об аминокислотах. «Именно тогда я пришел к пониманию того, что аминокислоты являются наиболее важным компонентом человеческого тела, и к пониманию их способности приносить счастье в жизни людей», — вспоминает Моришима, ныне исполнительный директор, отвечающий за корпоративные коммуникации.

Опыт Моришимы также помог ей осознать связь между едой и здоровьем. Наш организм содержит более 100 000 различных белков, каждый из которых состоит из комбинаций всего двадцати аминокислот, девять из которых должны быть получены с пищей. Эти белки используются для наращивания мышц по мере нашего роста. «Мышечные белки расщепляются и используются для получения энергии, — объясняет Моришима, — поэтому потребление аминокислот важно для восстановления мышц, когда в них возникает дефицит белков». Это также особенно важно, когда мы тренируемся и с возрастом.

Сила аминокислот идет дальше. Они поддерживают все жизненно важные функции организма, включая сон, и поддерживают наше физическое благополучие. «Когда некоторых аминокислот не хватает или они не сбалансированы, эти функции перестают работать должным образом», — говорит Моришима. «Широкий спектр аминокислот поддерживает гомеостаз, нормальное состояние организма». Некоторые из них также делают пищу прекрасной на вкус, гарантируя, что мы получаем адекватное питание без необходимости в большом количестве соли, что крайне важно, поскольку чрезмерное потребление натрия является проблемой для здоровья во всем мире.

Помните те две аминокислоты, которые привели к случайному открытию полезных свойств глицина для сна? Это были цистин и теанин, и с тех пор они показали себя многообещающими в укреплении иммунной системы. Другие используются для выявления рака и заболеваний, связанных с ухудшением функций организма с возрастом, а некоторые могут даже улучшить когнитивные функции. «Исследования аминокислот — это уникальный подход Ajinomoto Group к бизнесу и очень сильная основная компетенция, — говорит Моришима, — но мы прошли лишь небольшой путь в выяснении функции аминокислот.Я сделаю все возможное, чтобы продолжать использовать их огромный потенциал, чтобы помочь людям хорошо питаться, жить хорошо и чувствовать себя счастливыми каждый день ».

Аутокринная обратная связь глицин-инсулин усиливает секрецию инсулина из человеческих β-клеток и нарушается при диабете 2 типа

Abstract

Секреция инсулина β-клетками островков поджелудочной железы имеет решающее значение для гомеостаза глюкозы. Нарушение секреции инсулина лежит в основе почти всех форм диабета, включая наиболее частую форму — диабет 2 типа (T2D).Контроль секреции инсулина сложен и зависит от циркулирующих питательных веществ, нервных импульсов и локальной передачи сигналов. В текущем исследовании мы изучили вклад глицина, аминокислоты и нейромедиатора, который активирует лиганд-зависимые токи Cl , в секрецию инсулина островками людей-доноров с СД2 и без него. Мы обнаружили, что островковые β-клетки человека экспрессируют рецепторы глицина (GlyR), особенно субъединицу GlyRα1 и изоформы переносчика глицина (GlyT) GlyT1 и GlyT2.β-клетки проявляют значительные индуцированные глицином токи Cl , которые способствуют деполяризации мембраны, проникновению Ca 2+ и секреции инсулина β-клетками от доноров без T2D. Однако экспрессия GlyRα1 и токи, индуцированные глицином, снижаются в β-клетках от доноров с T2D. Глицин активно очищается GlyT, экспрессируемым в β-клетках, которые накапливают и высвобождают глицин, который действует аутокринным образом. Наконец, существует значительная положительная взаимосвязь между инсулином и GlyR, поскольку инсулин усиливает ток, активируемый глицином, зависимым от фосфоинозитид-3-киназы образом, петля положительной обратной связи, которую мы обнаружили, полностью теряется в β-клетках от доноров с T2D.

Введение

Многие нейротрансмиттеры модулируют секрецию инсулина, изменяя электрическую активность β-клеток через ионные каналы и рецепторы (1–4). Эти сигналы могут исходить от кровообращения, нервных волокон и / или островков поджелудочной железы (5). Правильная передача сигналов нейромедиатора имеет решающее значение для координации секреции инсулина всеми островками поджелудочной железы, и дисфункция этой передачи сигналов может быть связана с патогенезом диабета. Множество недавних метаболических исследований, посвященных изучению биомаркеров диабета 2 типа (T2D), выявили глицин в качестве потенциального кандидата (6–16).Существует сильная корреляция между концентрацией глицина в плазме и чувствительностью к инсулину (7,13), утилизацией глюкозы (8) и ожирением (9,17). Концентрация глицина в циркулирующей плазме обратно пропорциональна риску СД2 (6–8). Кроме того, добавка глицина повышает уровень инсулина в плазме (18,19).

Глицин — это заменимая аминокислота, которая в большом количестве содержится в продуктах, богатых коллагеном. В центральной нервной системе глицин действует как тормозящий нейротрансмиттер, активируя семейство лиганд-управляемых каналов Cl , называемых рецепторами глицина (GlyR).Они принадлежат к семейству пентамерных лиганд-управляемых ионных каналов и состоят из двух α- и трех β-субъединиц (20). Помимо глицина, GlyR также активируется β-аланином и таурином, тогда как стрихнин является мощным и специфическим ингибитором (20). Концентрации внеклеточного глицина регулируются транспортерами глицина (GlyT), которые принадлежат к Na + -зависимым транспортерам переносчиков растворенных веществ семейства 6 (SLC6), где транспортер глицина 1 (GlyT1) переносит два Na + , один Cl . , и один глицин, и переносчик глицина 2 (GlyT2) совместно транспортирует три Na + , один Cl и один глицин (21).

Здесь мы исследовали роль глицина в секреции инсулина островками Лангерганса поджелудочной железы человека. Мы демонстрируем, что человеческие β-клетки экспрессируют GlyR, особенно GlyRα1, который опосредует деполяризующий ток Cl , который усиливает активацию потенциала действия, вход Ca 2+ и секрецию инсулина. Этот GlyR-опосредованный ток усиливается инсулином в β-клетках от доноров без T2D, но не в β-клетках от доноров с T2D, где мы обнаруживаем, что экспрессия белка GlyRα1 и токи, активируемые глицином, подавляются.Кроме того, человеческие β-клетки экспрессируют GlyT1 и GlyT2, которые опосредуют поглощение глицина, который высвобождается из β-клеток посредством Ca 2+ -зависимого экзоцитоза. Таким образом, аутокринная петля обратной связи глицин-инсулин положительно регулирует секрецию инсулина, и ее дисфункция может способствовать нарушению секреции при СД2 у человека.

Дизайн и методы исследования

Культура клеток и трансфекция

Островки от 50 человек-доноров были выделены Институтом диабета Альберты IsletCore (22) или Лабораторией клинических островков (23) в Университете Альберты при наличии соответствующего этического разрешения Совет по этике исследований человека Университета Альберты (Pro00013094; Pro 00001754).Информация о донорах описана в дополнительных таблицах 1 и 2. Островки мышей были получены от мышей-самцов C57 / Bl6 в возрасте 10–12 недель, и эксперименты были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Альберты (AUP00000291). Островки собирали вручную и диспергировали путем инкубации в буфере без Ca 2+ (Life Technologies) с последующим растиранием. Суспензию клеток высевали на чашки Петри или покровные стекла и культивировали в среде RPMI (Corning или Life Technologies), содержащей 7,5 ммоль / л глюкозы, в течение> 24 ч перед экспериментами.Для измерения высвобождения глицина клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей субъединицу GlyRα1 мыши (предоставленную G.E. Yevenes и H.U. Zeilhofer, University of Zurich [24]), используя Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Плазмида, кодирующая GFP, была включена в качестве маркера трансфекции (pAdtrackCMV).

Электрофизиология

Пипетки были извлечены из класса боросиликатов и отполированы огнем (сопротивление наконечника 4–7 Мегаом для большинства экспериментов и 3–4 Мегаом для экспериментов с инфузией Ca 2+ ).Регистрацию патч-зажим выполняли в стандартных конфигурациях целых клеток или в конфигурации с перфорированным патчем с использованием усилителя EPC10 и программного обеспечения Patchmaster (HEKA Electronik). Клетки непрерывно перифузировали внеклеточным раствором (за исключением экспериментов с остановленным потоком) при температуре бани ~ 32 ° C. После экспериментов типы клеток были установлены с помощью иммуноцитохимии, как описано ранее (25). Для регистрации мембранного потенциала и тока буфер Кребса-Рингера (KRB), состоящий из (в ммоль / л) 140 NaCl, 3.6 KCl, 0,5 MgSO 4 , 1,5 CaCl 2 , 10 HEPES, 0,5 NaH 2 PO 4 , 5 NaHCO 3 и 6 глюкозы (pH доведен до 7,4 с помощью NaOH) использовали в качестве раствора для ванны. . Для измерения высвобождения глицина внеклеточная среда содержала (в ммоль / л) 118 NaCl, 20 тетраэтиламмоний-Cl, 5,6 KCl, 2,6 CaCl 2 , 1,2 MgCl 2 , 5 HEPES и 6 глюкозы (pH доведен до 7,4). с NaOH). Для экспериментов с перфорированным пластырем раствор пипетки содержал (в ммоль / л) 76 K 2 SO 4 , 10 KCl, 10 NaCl, 1 MgCl 2 , 5 HEPES и 0.24 мг / мл амфотерицина B или 50 мкг / мл грамицидина (pH доведен до 7,35 с помощью КОН). Мембранные токи, вызванные глицином, регистрировали с помощью внутриклеточного раствора, содержащего (в ммоль / л) 130 KCl, 1 MgCl 2 , 1 CaCl 2 , 10 EGTA, 5 HEPES и 3 MgATP (pH доведен до 7,2 с помощью КОН). . Для измерения высвобождения глицина раствор пипетки состоял (в ммоль / л) из 120 CsCl, 1 MgCl 2 , 9 CaCl 2 , 10 EGTA, 10 HEPES, 3 MgATP и 0,1 цАМФ (pH доведен до 7,2 с помощью CsOH).Во время записи клетки зажимали при -70 мВ. Для экспериментов по высвобождению глицина анализ проводили с помощью программного обеспечения Mini Analysis 6 (Synaptosoft).

Иммуногистохимия

Депарафинированные срезы ткани поджелудочной железы человека нагревали в 10 ммоль / л цитрата Na + (pH 6) в течение 15 минут с последующей 15-минутной стадией охлаждения в том же буфере. Срезы промывали PBS и блокировали 20% козьей сывороткой в ​​течение 30 мин. Антитела против субъединицы GlyRα1 (разведены 1: 100 в 5% козьей сыворотке; Synaptic Systems), субъединицы GlyRα3 (разведены 1: 100 в 5% ослиной сыворотке; Santa Cruz Biotechnology), GlyT1 (разведены 1: 100 в 5% ослиной сыворотке; Santa Cruz Biotechnology) или GlyT2 (разведенный 1: 200 в 5% козьей сыворотке; антитела Atlas) затем добавляли к срезам и инкубировали в течение ночи.Срезы промывали PBS, а затем к срезам добавляли антитела к инсулину (разведенные 1: 1000 в козьей сыворотке [Sigma-Aldrich] и разведенные 1: 100 в 5% ослиной сыворотке [Santa Cruz Biotechnology]) и инкубировали их в течение 60 минут. После стадии промывки в PBS срезы инкубировали с флуоресцентно меченными вторичными антителами Alexa Fluor 594 и 488 (разведенные 1: 200; Thermo Fisher) в течение еще 60 мин. Образцы снова промывали, инкубировали с 300 нмоль / л DAPI (Thermo Fisher) в течение 5 минут и помещали в антифад ProLong (Life Technologies).Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного системой визуализации Zeiss Colibri. Количественное отображение GlyR в островках от доноров с СД2 и без него при постоянном времени воздействия анализировали с помощью Volocity (PerkinElmer). Вычитание фона выполняли с помощью программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Измерения [Ca

2+ ] i

Диспергированные островковые клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 1 мкмоль / л Fura-2 AM (Life Technologies) в течение 10 мин.Покровные стекла помещали в инвертированный микроскоп и обрабатывали KRB, содержащим 6 ммоль / л глюкозы (если не указано иное). Флуоресценцию возбуждали при длине волны 340 и 380 нм (соотношение интенсивностей 5: 2) с использованием источника света олигохрома (TILL Photonics) и объектива × 20 (Zeiss Fluar). Эмиссию контролировали на длине волны 510 нм, а изображения регистрировали при 0,5 Гц с использованием камеры устройства с усиленной зарядовой связью и программного обеспечения Life Acquisition (TILL Photonics). Типы клеток были идентифицированы после эксперимента с помощью иммуноцитохимии, как описано ранее (25).Коэффициенты возбуждения (340/380 нм) были впоследствии рассчитаны в автономном режиме на основе захваченных изображений в интересующих областях, соответствующих идентифицированным типам клеток, с использованием программного обеспечения ImageJ.

Секреция инсулина

Секрецию инсулина измеряли с помощью статических анализов секреции, как описано ранее (26), или путем перифузии при 37 ° C в KRB с (в ммоль / л) 115 NaCl, 5 KCl, 24 NaHCO 3 , 2,5 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 10 HEPES и 0,1% BSA (pH 7,4 с NaOH). Для перифузии перифузировали 15 островков на полосу (0.25 мл / мин) с 1 ммоль / л глюкозы KRB (с 1 мкмоль / л стрихнина или без него) в течение 24 минут, а затем в указанных условиях. Образцы собирали через 2-минутные интервалы. Островки лизировали в кислотно-этанольном буфере (1,5% концентрированной HCl, 23,5% уксусной кислоты и 75% этанола) для определения общего содержания инсулина. Образцы анализировали с использованием набора для обнаружения инсулина (Meso Scale Discovery).

Анализ данных

Данные выражены как средние значения ± SEM, если не указано иное. Статистическую значимость оценивали с помощью теста Стьюдента t или двухфакторного дисперсионного анализа.Значения P <0,05 считались значимыми.

Результаты

Экспрессия GlyR в островках человека от доноров с T2D и без него

Анализ

ОТ-ПЦР выявил экспрессию субъединиц GlyR α1, α3 и β в островках человека (дополнительный рисунок 1 A и B ) . Количественную иммунофлуоресценцию проводили на срезах ткани поджелудочной железы, взятых у доноров без T2D (4 донора) и от доноров с T2D (4 донора) для измерения уровней белка GlyRα1 и GlyRα3 в β-клетках.Иммуноокрашивание субъединиц GlyRα1 и GlyRα3 в срезах ткани поджелудочной железы выявило экспрессию в инсулин-положительных клетках от доноров с T2D и без них (рис. 1 и дополнительные рис. 2 и 3). Экспрессия GlyRα1 была выше у доноров без T2D (480 ± 35 средняя интенсивность пикселей [PI], 4 донора), чем у доноров с T2D (309 ± 24 средних PI, 4 донора; P <0,001) (Рис. 1 B и дополнительный рис.1 C ), тогда как экспрессия GlyRα3 оказалась ниже, чем у GlyRα1, и не различалась между донорами без T2D (304 ± 24 в среднем PI, 4 донора) и с T2D (268 ± 30 в среднем PI, 4 донора) (Инжир.1 C и D и дополнительный рис. 1 D ).

Рисунок 1

Экспрессия GlyR в островках человека. A : Типичные изображения экспрессии GlyRα1 в срезах ткани поджелудочной железы от доноров с и без T2D по количественной иммунофлуоресценции (GlyRα1, красный; инсулин, зеленый; DAPI, синий). B : Среднее значение PI GlyRα1 в инсулин-положительных клетках от доноров с СД2 и без него. C : Типичные изображения экспрессии GlyRα3 в срезах ткани поджелудочной железы от доноров с и без T2D по количественной иммунофлуоресценции (GlyRα3, красный; инсулин, зеленый; DAPI, синий). D : Среднее значение GlyRα3 PI в инсулин-положительных клетках от доноров с СД2 и без него. Диаграммы разброса представляют значения для отдельных островков от четырех доноров в каждой группе. *** P <0,001.

В соответствии с обнаружением субъединиц GlyR с помощью иммуноцитохимии, мы наблюдали существенные глицин-активированные токи Cl в человеческих β-клетках, которые были идентифицированы с помощью иммуноокрашивания инсулина после эксперимента (рис. 2 A и B ). ).Внеклеточное применение глицина (300 мкмоль / л) вызвало большие внутренние токи в 56 из 62 человеческих β-клеток (рис. 2 Ai ). Амплитуда тока в среднем составляла -316 пА (-26 ± 3 пА / пФ, 9 доноров) (рис.2 B ) и была активирована наполовину максимально под действием 90 мкмоль / л глицина ( n = 9 клеток, 2 донора). (Рис.2 C ). Вызванные глицином токи снижались на 92 ± 3% ( n = 7 клеток, 4 донора; P <0,001) в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина. Вызванные глицином, чувствительные к стрихнину токи также были обнаружены в α-клетках, но токи обнаруживались реже (3 из 10 клеток), а амплитуды были намного меньше по сравнению с β-клетками (−9.3 ± 2,1 пА и -3,2 ± 0,5 пА / пФ, 3 донора) (рис.2 Aii ). В β-клетках мыши глицин вызывал чувствительный к стрихнину ток только в 3 из 15 β-клеток (-26 ± 19 пА и -4,5 ± 2 пА / пФ) (рис. 2 Aiii ), тогда как глицин не вызывал ток в β-клетках крыс ( n = 11 клеток; данные не показаны), что предполагает видоспецифические различия в токах, вызванных глицином. Наконец, ток, активированный глицином, наблюдался в 36 из 52 β-клеток от доноров с T2D и имел среднюю амплитуду -151 пА.В соответствии со сниженным иммунным окрашиванием GlyRα1 островков от доноров с T2D, мы обнаружили в β-клетках от доноров с T2D, что токи, вызванные глицином, значительно меньше, чем у контрольных доноров без T2D (-12 ± 2 пА / пФ, мкФ). = 36 клеток, 5 доноров; P <0,001) (рис.2 Aiv и B ). Чувствительный к глицину ток продемонстрировал обратный потенциал, соответствующий ожидаемому от тока, опосредованного Cl , в наших растворах (13.5 мВ, n = 18 клеток, 4 донора) (рис.2 D ).

Рисунок 2

Обнаружение GlyR-опосредованных токов Cl путем фиксации фрагментами целых клеток в островковых клетках человека. A : Типичные кривые, показывающие глицин (300 мкмоль / л), вызванный внутренними токами (черные линии) в β-клетках от донора без T2D ( i ), в α-клетках ( ii ), в β-клетках мыши. -клетки ( iii ) и в человеческих β-клетках от донора с T2D ( iv ). Серые следы были получены в присутствии стрихнина 1 мкмоль / л.Обратите внимание на разные масштабные линейки. B : вызванные глицином внутренние токи, нормированные на размер клетки. C : кривая доза-ответ вызванных глицином токов в человеческих β-клетках. Ответы были нормализованы к ответам, полученным с глицином 300 мкмоль / л. D : Вольт-амперная зависимость токов, вызванных 300 мкмоль / л глицина. *** P <0,001 по сравнению с клетками от доноров без T2D.

Затем мы исследовали влияние глицина на мембранный потенциал β-клеток человека, используя конфигурацию перфорированного пластыря.В присутствии 6 ммоль / л глюкозы внеклеточное применение глицина (100 мкмоль / л) деполяризовало клетки и увеличило потенциал действия (рис. 3). В одной серии экспериментов (рис. 3 A – C ) глицин вызывал значительно более частое срабатывание потенциала действия (2,9 ± 0,5 Гц, n = 6 клеток, 2 донора) по сравнению с контрольными клетками (0,6 ± 0,2 Гц, n = 6 клеток, 2 донора; P <0,01) (рис.3 A и B ) и уменьшенная высота потенциала действия (46 ± 3 мВ, n = 6 клеток, 2 донора) по сравнению с контрольными клетками (56 ± 3 мВ, n = 6 клеток, 2 донора; P <0.05) (Рис.3 A и C ). В отдельной серии экспериментов этот эффект был предотвращен стрихнином (рис. 3 D ). Глицин деполяризовал β-клетки человека в среднем на 15 ± 3 мВ ( n = 7, 3 донора; P <0,01) (рис. 3 E ).

Рисунок 3

Влияние глицина на мембранный потенциал β-клеток человека. Регистрация мембранного потенциала выполняется с использованием конфигурации «перфорированный пластырь». A : Образец следа воздействия глицина (100 мкмоль / л) на β-клетки человека.Применение 100 мкмоль / л глицина вызывало значительное увеличение потенциала действия ( B ) и снижение высоты потенциала действия ( C ). D : образец следа глицин-зависимой (100 мкмоль / л) деполяризации β-клеток до, во время и после нанесения 1 мкмоль / л стрихнина. E : изменение мембранного потенциала в ответ на 100 мкмоль / л глицина. * P <0,05 и ** P <0,01.

Глицин модулирует [Ca

2+ ] i в β-клетках

Затем мы исследовали эффекты глицина на [Ca 2+ ] i в островковых клетках человека.Идентичность всех клеток была подтверждена после экспериментов иммуноокрашиванием (фиг. 4 A ). Типичная запись от β-ячейки показана на рис. 4 B . Применение глицина увеличивало [Ca 2+ ] и в 50% (72 из 144) всех протестированных β-клеток (7 доноров). Ответы были аналогичными после добавления 100 мкмоль / л и 300 мкмоль / л глицина (55% и 42% отвечающих клеток соответственно) и исчезли в присутствии стрихнина (фиг. 4 B и C ).Интересно, что в 7% (10 из 144) β-клеток содержание глицина уменьшилось, а не увеличилось [Ca 2+ ] и , но в остальных 43% клеток явного эффекта не наблюдалось (рис. 4 ). D ). Мы сравнили исходный уровень [Ca 2+ ] i (до добавления глицина, при 6 ммоль / л внеклеточной глюкозы) в клетках, которые показали увеличение, отсутствие изменений и снижение [Ca 2+ ] i при нанесении глицина соответственно (рис. 4 E ). Клетки, которые ответили повышением [Ca 2+ ] i , имели значительно более низкий исходный уровень [Ca 2+ ] i , чем неответчики, тогда как значительно более высокий исходный уровень [Ca 2+ ] i был наблюдается в клетках, показывающих снижение после введения глицина.При 1 ммоль / л глюкозы доля клеток, отвечающих увеличением [Ca 2+ ] i (73% [11 из 15 клеток], 2 донора), была выше, чем при 6 ммоль / л глюкозы (43% [41 из 97 клеток]) и при 10 ммоль / л глюкозы (56% [18 из 32 клеток], 4 донора). Это сопровождалось более низким исходным уровнем [Ca 2+ ] i при 1 ммоль / л глюкозы (0,74 ± 0,02 условных единиц [AU]) по сравнению с 6 ммоль / л глюкозы (1,08 ± 0,04 AU) и 10 ммоль / л. глюкоза (0,86 ± 0,02 ЕД). Четкое увеличение [Ca 2+ ] и при добавлении глицина иногда также наблюдалось в α-клетках (рис.4 F ), но доля отвечающих клеток была намного ниже по сравнению с β-клетками (11% [14 из 124 клеток], 6 доноров), что согласуется с более низкой долей α-клеток, которые проявляли глицин-активированный Cl ток. Они также обычно требовали более высокой концентрации глицина, при этом 7% клеток отвечали на 100 мкмоль / л и 19% отвечали на 300 мкмоль / л. Наконец, внеклеточный Ca 2+ был необходим для того, чтобы вызвать ответ (Fig. 4 G ), а отсутствие Ca 2+ подавляло ответ на глицин на 99.8% ( n = 35 клеток, 5 доноров; P <0,01) (рис. 4 H ). Дополнительные кривые и увеличенные временные шкалы для этих экспериментов показаны на дополнительном рисунке 4.

Рисунок 4

Влияние глицина на [Ca 2+ ] i в островковых клетках. A : ратиометрические изображения были записаны в диспергированных островковых клетках с последующим определением типов клеток с помощью иммуноокрашивания. SST, соматостатин. B : Типичный след показывает влияние глицина (Gly) (100/100/300 мкмоль / л) на [Ca 2+ ] i в β-клетке в отсутствие или в присутствии стрихнина (Strych) ( 1 мкмоль / л). C : Площадь под кривой (AUC) во время 1-минутного нанесения 100 мкмоль / л глицина в отсутствие или в присутствии стрихнина (1 мкмоль / л) в тех же клетках ( n = 39 клеток из 9 экспериментов). Исходные значения (до нанесения глицина) вычитали. D : Следы трех β-клеток из одного и того же эксперимента, иллюстрирующие различные типы [Ca 2+ ] i ответов на глицин (100/300 мкмоль / л). Кривые показаны в масштабе (т. Е. Без корректировки базовых значений). E : исходные соотношения флуоресценции (до нанесения глицина) в β-клетках, которые ответили увеличением, отсутствием изменений или уменьшением [Ca 2+ ] i , соответственно ( n = 38, 40, и 10). Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм (квадраты, средние; линии, медианы; прямоугольники, 25/75 процентили; усы, минимальные / максимальные значения). F : Влияние глицина (300 мкмоль / л) на [Ca 2+ ] и в α-клетке. G : характерный след показывает влияние глицина на [Ca 2+ ] i в отсутствие или в присутствии внеклеточного Ca 2+ и ответ Ca 2+ на 70 ммоль / л KCl. H : AUC во время 1-минутного нанесения 100 мкмоль / л глицина в отсутствие или в присутствии внеклеточного Ca 2+ . ** P <0,01 и *** P <0,001.

Взаимодействие между глицином и инсулином

Инсулин усиливает токи Cl в нейронах (27,28). Мы исследовали, играет ли инсулин роль в усилении передачи сигналов глицина в островках человека. В β-клетках, обработанных инсулином с концентрацией 10 мкмоль / л, вызванный глицином ток усиливался на 54 ± 17% ( n = 23, 8 доноров; P <0.01) по сравнению с контрольными клетками (рис. 5 Ai и B ). Мы подтвердили аналогичные результаты в ответ на лечение инсулином 100 нмоль / л (данные не показаны). Мы подозревали, что это было результатом передачи сигналов между рецептором инсулина и GlyR, поэтому мы предварительно инкубировали клетки с 100 нмоль / л вортманнина, ингибитора фосфоинозитид-3-киназы, для подавления передачи сигналов рецептора инсулина. Вортманнин предотвращал инсулинозависимое усиление вызванного глицином тока у доноров без СД2 (увеличение на 6 ± 4%, n = 12 клеток, 5 доноров; незначительно) (рис.5 Aii и B ). Интересно, что β-клетки от доноров с T2D не показали усиления вызванного глицином тока в ответ на инсулин (изменение на 5-9% от исходного уровня, n = 13 клеток, 4 донора; незначительно) (рис. Aiii и B ).

Рисунок 5

Взаимодействие глицина и инсулина. A : Типичный след инсулинозависимой амплификации тока глицина в человеческих β-клетках от донора без T2D ( i ), β-клетках, предварительно инкубированных с 100 нмоль / л вортманнина в течение 1 часа ( ii ) и β -клетки от доноров с T2D ( iii ).Контрольные токи глицина до лечения показаны черным цветом, а токи глицина после обработки инсулином 10 мкмоль / л в течение 1 мин — серым цветом. Аналогичные результаты были получены с инсулином 100 нмоль / л (данные не показаны). B : Площадь под кривой (AUC), нормализованная для управления токами глицина. При 6 ммоль / л глюкозы 300 мкмоль / л глицина умеренно увеличивает секрецию инсулина, тогда как 800 мкмоль / л глицин сильно увеличивает секрецию инсулина. C : Глицин индуцировал секрецию инсулина в интактных островках человека.Глицин дозозависимо увеличивал секрецию инсулина в зависимости от стрихнина. D : Динамическая перифузия секреции инсулина, стимулированная глюкозой, в контрольных и человеческих островках, обработанных стрихнином. P <0,001 с помощью двустороннего дисперсионного анализа. E : AUC стимулированной глюкозой перифузии инсулина в отсутствие или в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина. ** P <0,01 по сравнению с контролем 300 мкмоль / л глицина ( B ) или 0 глицина ( C ).

Как предполагалось в предыдущих исследованиях in vivo (18,19), мы подтвердили способность глицина индуцировать секрецию инсулина.При циркулирующих концентрациях 300 мкмоль / л глицин имел тенденцию увеличивать секрецию инсулина (изменение в 23 ± 8% по сравнению с контролем, n = 18 повторов, 6 доноров) (фиг. 5 C ) из интактных островков. Поскольку ожидается, что интерстициальная концентрация глицина превысит циркулирующий уровень, особенно потому, что β-клетки накапливают и высвобождают глицин (см. Ниже), мы также стимулировали интактные островки с помощью 800 мкмоль / л глицина. Эта концентрация, которая достигается при пероральном приеме глицина (18), дополнительно увеличивает секрецию инсулина (изменение в 34 ± 12%, n = 18 повторов, 6 доноров; P <0.01) (Фиг.5 C ) по сравнению с контролем. Антагонизм GlyR с 1 мкмоль / л стрихнина предотвращал глицин-зависимую секрецию инсулина в интактных островках при 300 и 800 мкмоль / л глицина (фиг. 5 C ). Мы дополнительно исследовали роль эндогенной передачи сигналов глицина в секреции инсулина, исследуя влияние стрихнина на динамические ответы секреции инсулина на высокий уровень глюкозы (фиг. 5 D ). Стрихнин снижает стимулированную глюкозой секрецию инсулина островками человека ( n = 10 повторов, 5 доноров; P <0.001 двусторонним дисперсионным анализом; площадь под кривой P = 0,054) (рис.5 E ).

Высвобождение глицина из β-клеток человека

Островки поджелудочной железы крысы содержат ~ 6 ммоль / л глицина (29). Иммуногистохимия и электронная микроскопия иммунного золота показывают, что β-клетки крысы экспрессируют везикулярный переносчик аминокислот (VIAAT / VGAT), который опосредует захват глицина синаптическими пузырьками в нейронах и накапливает глицин в секреторных гранулах (30). Эти данные и способность стрихнина ингибировать секрецию инсулина островками человека (см. Выше) предполагают, что β-клетки могут высвобождать глицин путем экзоцитоза, опосредуя аутокринную передачу сигналов.С помощью флуоресцентной иммуногистохимии мы обнаружили, что островковые клетки человека экспрессируют оба из GlyT, GlyT1 и GlyT2, которые, по-видимому, локализуются как в β-, так и в не-β-клетках (рис. 6 A и B и дополнительный рис. 5). . Мы исследовали высвобождение глицина из β-клеток, адаптировав анализ на основе патч-кламп, который ранее использовался для обнаружения экзоцитотического высвобождения γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и АТФ (3,31,32). Изолированные островковые клетки человека трансфицировали плазмидным вектором, сверхэкспрессирующим GlyRα1, что приводило к примерно семикратному увеличению вызванных глицином токов.Эти GlyR будут ощущать высвобождение глицина из одних и тех же клеток, вызывая токи, которые легко обнаружить. Трансфицированные клетки стимулировали инфузией 2 мкмоль / л свободного Ca 2+ . Типичный эксперимент показан на рис. 6 Ci . На фоновый ток накладываются спонтанные переходные внутренние токи (TIC). Они активировались быстро (6,4 ± 2,5 мс, время нарастания 10–90%, n = 7, 2 донора) и распадались более постепенно, с полушириной 10,5 ± 3,5 мс, напоминающей тормозные постсинаптические токи в нейронах.TICs полностью подавлялись стрихнином (Fig. 6 Cii ), предполагая, что каждый TIC отражает экзоцитоз глицинсодержащей везикулы.

Фиг.6.

Секреция глицина β-клетками человека и активность GlyT. Срезы ткани поджелудочной железы человека иммуноокрашивали на GlyT1 ( A ) (красный), GlyT2 ( B ) (красный) и инсулин (зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синий). C : β-Клетки, сверхэкспрессирующие субъединицы GlyRα1, зажимали при -70 мВ и вводили внутриклеточный раствор, содержащий ~ 2 мкмоль / л свободного Ca 2+ .Воспламенение TIC ( i ) подавлялось в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина ( ii ). D : суммарный след TIC глицина от контрольных клеток и после замены Na + на Li + для блокирования активности GlyT. E : Общее время затухания от TIC. F : Образец следа экспериментов с остановленным потоком для оценки клиренса глицина из контрольных клеток и после замены Na + на Li + для блокирования активности GlyT. G : Общее время затухания по результатам экспериментов с остановленным потоком.* P <0,05 по сравнению с контролем.

Концентрация глицина в спинномозговой жидкости составляет ∼5 мкмоль / л (33), тогда как уровни глицина в плазме примерно в 40 раз выше (150–400 мкмоль / л) (8,18). Эти уровни глицина в плазме выше полумаксимальной эффективной концентрации (EC 50 ) GlyR в β-клетках (см. Выше), и лиганд-зависимые ионные каналы снижают чувствительность во время длительного воздействия высоких концентраций агонистов. Для определения того, очищают ли β-клетки от глицина за счет активности GlyT, чтобы поддерживать низкую внутриостровную концентрацию глицина, использовали два метода.Во-первых, мы исследовали клиренс после высвобождения эндогенного глицина. Поскольку GlyT требует Na + для совместной транспортировки глицина, внеклеточный Na + был заменен на Li + для эффективного ингибирования как GlyT1, так и GlyT2 (34). β-Клетки, сверхэкспрессирующие GlyRα1, стимулировали к секреции глицина в присутствии и в отсутствие Na + , и был охарактеризован клиренс глицина. На рисунке 6 D показано усредненное событие TIC с заменой Na + на Li + и без нее ( n = 7 клеток, 21 событие, 2 донора для контроля; n = 5 клеток, 58 событий. , 2 донора на Li + замена ).Замена Li + значительно увеличила общее время распада TIC глицина с 18 ± 6 до 42 ± 6 мс ( P <0,05) (фиг. 6 E ).

Во-вторых, мы исследовали клиренс экзогенного глицина в эксперименте с остановленным потоком (34). После быстрого местного применения глицина 100 мкмоль / л вместо применения внеклеточного раствора для смывания локально высокой концентрации глицина и предотвращения десенсибилизации рецепторов системы перфузии были остановлены. В этом сценарии внеклеточный глицин в первую очередь удаляется за счет диффузии и активности GlyT.На рис. 6 F показан образец следа эксперимента с остановленным потоком. После замены Li + клеткам требовалось больше времени (74 ± 9 с) для возврата к исходному уровню по сравнению с их контролем (43 ± 4 с, n = 10 клеток, 3 донора; P <0,05) (рис. 6 G ).

Обсуждение

В текущем исследовании мы обнаружили, что GlyR и GlyT высоко экспрессируются в β-клетках человека и что активация GlyR стимулирует электрическую активность, увеличивает [Ca 2+ ] i и усиливает секрецию инсулина.Недавно сообщалось, что GlyR в островках человека экспрессируется специфически в α-клетках, но не в β-клетках (35), что подтверждается открытием, что глицин стимулировал секрецию глюкагона, но не секрецию инсулина из островков человека. Однако эксперименты проводились в отсутствие глюкозы, что приводит к активации нефизиологически больших токов K ATP в β-клетках и может предотвратить любое влияние глицина на мембранный потенциал. Ли и др. (35) наблюдали [Ca 2+ ] и ответы на применение глицина в подмножестве диспергированных островковых клеток, но однозначная идентификация типов клеток не проводилась.Наши данные ясно демонстрируют, что среди островковых клеток человека GlyR и токи Cl , активируемые глицином, наиболее активны в β-клетках.

Эффект глицина на [Ca 2+ ] i в β-клетках блокировался антагонистом GlyR стрихнином, демонстрируя, что он не был вторичным по отношению к Na + -зависимому захвату аминокислоты, как сообщалось ранее. для β-клеток мыши (36). Текущая активность GlyR была значительно ниже в β-клетках мыши по сравнению с β-клетками человека и не определялась в β-клетках крыс.Это наблюдение дополняет ранее описанные различия между островками человека и грызунов (25,37,38). Можно предположить, что это отражает различия в диетах: содержание глицина в мясе (6,5% аминокислот [39]) более чем вдвое превышает содержание белка пшеницы (2,8% аминокислот [40]).

В отличие от GlyR в центральной нервной системе, которые являются ингибирующими, мы демонстрируем, что активация GlyR поджелудочной железы увеличивалась [Ca 2+ ] i в большинстве β-клеток, но имела ингибирующий эффект в небольшой популяции клеток.Как можно объяснить эти расходящиеся эффекты? Активация проницаемого для Cl GlyR будет приводить мембранный потенциал к равновесному потенциалу Cl (E Cl ). Ранее мы сообщали, что E Cl в β-клетках составляет ~ -40 мВ, что выше порога для электрической активности (1). Наши данные предполагают, что некоторые β-клетки были деполяризованы за пределами E Cl перед добавлением глицина и что глицин, следовательно, гиперполяризовал, а не деполяризовал эти клетки и, таким образом, уменьшил [Ca 2+ ] i .В подтверждение этого, клетки, отвечающие снижением [Ca 2+ ] i , показали значительно более высокий исходный уровень [Ca 2+ ] i , чем клетки, которые ответили увеличением. Положительный E Cl по сравнению с нейронами (<–60 мВ) отражает более высокую внутриклеточную концентрацию Cl в β-клетках (41).

Концентрация глицина в плазме примерно в 40 раз выше, чем в спинномозговой жидкости, и выше EC 50 для активации GlyR.Действительно, мы полагаем, что локальная внеклеточная концентрация глицина в островках значительно ниже из-за GlyT-зависимого клиренса глицина. Эти переносчики очень эффективны при очистке от глицина (V max = 379 пмоль / мин / мг для GlyT1 и 5730 пмоль / мин / мг для GlyT2 [42]), и активность GlyT стимулируется по мере того, как клетка становится более гиперполяризованной (т. Е. в периоды покоя или между характерными медленными волнами деполяризации β-клеток [34]). Наши эксперименты показывают, что ингибирование GlyT посредством замены Li + приводит почти к удвоению эндогенного сигнала глицина, предполагая, что GlyT не только очищает глицин плазмы, но также регулирует передачу сигналов глицина в клетках.Точно так же экзогенное применение глицина в экспериментах с остановленным потоком продемонстрировало значительную потерю клиренса глицина во время ингибирования GlyT, и это, вероятно, преувеличено в ограниченном межклеточном пространстве, в отличие от изолированных клеток, изученных здесь.

Мы исследовали, секретируется ли глицин из β-клеток, выполнив эксперименты с патч-зажимом в клетках, сверхэкспрессирующих GlyR, которые служат сенсорами для глицина, высвобождаемого из той же клетки (т.е. аутосинапс). Хотя эксперименты в принципе должны быть осуществимы на нетрансфицированных клетках, сверхэкспрессия GlyR значительно повышает чувствительность анализа.Мы обнаружили, что инфузия Ca 2+ вызывает TIC, которые отражают экзоцитотическое высвобождение GlyR-активирующего соединения. Вероятно, что это соединение в основном представляет собой глицин, секретируемый гранулами инсулина, синаптическими микровезикулами или и тем, и другим (30), но мы не можем исключить таурин, который также присутствует в высоких концентрациях в островках (29). Подобно рецепторам GABA и GABA A (1) и рецепторам ATP и P2 (2,3), аутокринная активация GlyR может составлять положительную аутокринную петлю обратной связи в β-клетках человека.

Проглатывание глицина снижает уровень глюкозы в крови (18), и было высказано предположение, что глицин стимулирует секрецию инсулина у людей. Хотя физиологический глицин (300 мкмоль / л) имел тенденцию только увеличивать секрецию инсулина, глицин в концентрации 800 мкмоль / л значительно увеличивал секрецию инсулина. Мы полагаем, что в исследованиях секреции инсулина, где островки были интактными, клетки в ядре островков не испытывали таких же концентраций глицина, как клетки на внешней стороне, что объясняет несоответствие в концентрациях глицина, вызывающих ответ.Помимо демонстрации способности глицина стимулировать инсулин, мы продемонстрировали, что инсулин также отвечает за усиление тока глицина и что для этого требуется активация фосфоинозитид-3-киназы, которая находится ниже по течению от рецептора инсулина. Хотя мы не пытались использовать антагонисты рецепторов инсулина, наши результаты согласуются с зависимым от рецептора инсулином усилением тока глицина в спинномозговых нейронах мышей (27).

Наконец, мы продемонстрировали, что β-клетки от доноров с T2D имеют значительно более низкую экспрессию GlyR, более низкий ток глицин-активированного Cl , чем β-клетки от доноров без T2D, и невосприимчивы к эффектам инсулина, что, возможно, подразумевает Инсулинорезистентность β-клеток как вклад в снижение экспрессии GlyR при СД2.Точный механизм подавления GlyRα1 в этих клетках неясен, но может быть связан с нарушением транспорта или активности перед лицом инсулинорезистентности β-клеток или понижающей регуляцией уровней белка ниже экспрессии мРНК, которая увеличивалась при T2D (дополнительный рисунок 1 ). В ).

Таким образом, мы демонстрируем здесь, что каналы GlyR Cl высоко экспрессируются в β-клетках человека и способствуют регуляции электрической активности и передаче сигналов [Ca 2+ ] i через аутокринную петлю обратной связи с инсулином. .Наши результаты обеспечивают физиологическую основу для ранее наблюдаемого положительного влияния аминокислоты на толерантность к глюкозе у человека и потенциального механизма, способствующего нарушению секреции инсулина при СД2.

Информация о статье

Благодарности. Авторы благодарят старшего автора этой работы, покойного доктора Матиаса Брауна, за руководство и видение в этом исследовании, и их соавтора, покойного Стивена Чели, за его усилия и вклад во время его пребывания с их группой в Эдмонтоне.Авторы благодарят докторов наук. Куан Чжан и Патрик Рорсман (Оксфорд) за полезные комментарии, способствовавшие завершению этой рукописи, а также Алию Спигельман (Эдмонтон) и Нэнси Смит (Эдмонтон) за помощь в анализе человеческого инсулина. Островки человека были предоставлены Лабораторией выделения клинических островков Университета Альберты (доктора Джеймс Шапиро и Тацуя Кин) и Институтом диабета Альберты IsletCore. Авторы благодарят программы по закупке и обмену человеческих органов (HOPE) и Trillium Gift of Life Network (TGLN) за усилия по получению поджелудочной железы человека для исследований.

Финансирование. R.Y.-D. была поддержана стипендиями от Диабетического фонда Альберты. Завершение этой работы было частично профинансировано за счет операционного гранта P.E.M. от Канадского института исследований в области здравоохранения (MOP 310536). P.E.M. заведует кафедрой канадских исследований в области биологии островков.

Двойственность интересов. О потенциальных конфликтах интересов, относящихся к этой статье, не сообщалось.

Авторские взносы. R.Y.-D., E.D., J.E.M.F., X.D., K.S., S.K., A.B., M.F., J.L., X.W., S.C. и M.B. исследовали данные и проанализировали результаты. М.Б. написал частичный черновик рукописи, который завершил Р.Я.-Д. и P.E.M. P.E.M. является гарантом этой работы и, как таковой, имеет полный доступ ко всем данным в исследовании и берет на себя ответственность за целостность данных и точность анализа данных.

  • Получено 9 сентября 2015 г.
  • Принято 26 апреля 2016 г.
  • © Американская диабетическая ассоциация, 2016 г.Читатели могут использовать эту статью при условии, что произведение правильно процитировано, используется в образовательных целях, а не для получения прибыли, и если работа не изменена.

Аминокислота, связанная с жировой болезнью печени, может дать ключи к лечению

Новое исследование также указывает на причастность низкого уровня аминокислоты глицина к развитию неалкогольной жировой болезни печени или НАЖБП. Это также предполагает, что решение этой проблемы может стать ключом к будущему лечению болезни.

«Мы открыли новый метаболический путь и потенциально новое лечение», — говорит старший автор Ю.Юджин Чен, доктор медицинских наук, профессор внутренней медицины, кардиохирургии, физиологии, фармакологии и медицинской химии из Сердечно-сосудистого центра Michigan Medicine Frankel. Его команда сотрудничала с исследователями из Мичиганского университета, Государственного университета Уэйна и Израильского технологического института Техниона.

Чен говорит, что существует большая потребность в расширении возможностей лечения пациентов с НАЖБП. Хотя это наиболее распространенное хроническое заболевание печени, в настоящее время нет одобренных лекарств для его лечения.

Ведущий автор Орен Ром, доктор философии, доктор медицины, научный сотрудник Центра сердечно-сосудистых заболеваний штата Мичиган Medicine Frankel, говорит, что команда сосредоточилась на плохо изученной взаимосвязи между нарушением регуляции метаболизма аминокислот и НАЖБП.

«В частности, снижение циркулирующего глицина постоянно наблюдается у пациентов с НАЖБП и сопутствующими заболеваниями, включая диабет, ожирение и сердечно-сосудистые заболевания», — говорит Ром. «Наши исследования не только предлагают метаболическое объяснение нарушения метаболизма глицина при НАЖБП, но и раскрывают потенциальное лечение на основе глицина.”

Исследователи смогли улучшить состав тела и несколько других показателей на моделях мышей с помощью трипептида, известного как DT-109.

«Лечение на основе глицина ослабляет экспериментальную НАЖБП, стимулируя окисление жирных кислот в печени и синтез глутатиона, что требует клинической оценки», — пишут авторы.

Цитированная статья: «Лечение на основе глицина улучшает НАЖБП за счет модуляции окисления жирных кислот, синтеза глутатиона и микробиома кишечника», Science Translational Medicine .DOI: 10.1126 / scitranslmed.aaz2841

Описание: Чен является изобретателем соединения DT-109. Университет штата Мичиган запатентовал его и предоставил лицензию на использование Diapin Therapeutics . Чен и университет владеют долей в Diapin. Компания продолжает разработку комплекса.

Leave a Comment

Ваш адрес email не будет опубликован.