Биофизические и физиологические процессы, вызывающие потерю кислорода коралловыми рифами

[Примечание редакции: ответы автора на первый раунд рецензирования приводятся ниже.]

Работа явно очень интересна, и все мы были убеждены, что основной тезис вполне может быть правильным, но на данном этапе данные не полностью подтверждают ваши выводы. Кроме того, я хотел бы отметить три момента из моего собственного прочтения работы и обзоров, которые могут помочь вам подготовиться к следующим шагам в этой работе:

1) Аргументы в пользу того, что микробное сообщество использует менее энергоэффективные способы потребления углерода, основаны на метагеномном анализе.Однако одних только метагеномных анализов недостаточно для определения того, чем на самом деле занимается микробное сообщество, они только раскрывают метаболические возможности сообщества. Транскриптомный или протеомный анализ будет иметь важное значение, чтобы показать, что в сообществе произошел сдвиг в использовании путей потребления углерода.

2) Было неясно, какой прогресс дает метагеномный анализ этой статьи по сравнению с достижениями, представленными в более ранней статье Haas et al., 2016, с использованием меньшего набора данных из 60 участков коралловых рифов (vs.87 здесь). Был ли использован тот же набор данных, что и у Haas et al. хотя и расширен на 27 дополнительных сайтов?

3) Как отметил первый рецензент, статистический анализ требует большой дополнительной работы.

Рецензент №1:

Я думаю, что наборы данных, представленные в этой рукописи, многообещающие и в конечном итоге могут подтвердить заявленные выводы. Однако в этой рукописи есть несколько проблем, которые, как я считаю, не могут быть адекватно рассмотрены в рамках данной заявки (то есть без дальнейшего раунда экспертной оценки).

В целом, я выделяю следующие основные проблемы:

1) Недостатки метагеномного подхода и связанной статистики: авторы поставили перед собой более сложную задачу, используя геномные, а не транскриптомные данные, и не показали убедительно, что геномные данные могут ответить на их вопрос об активности различных метаболических путей.

Предыдущие исследования показали быструю геномную адаптацию прибрежных бактериальных сообществ к среде рифа — от часов до дней, временной шкалы времени пребывания — и правомерность использования метагеномики для описания функциональной адаптации бактерий (Nelson et al., 2013, Wegley-Kelly et al., 2015). Эта геномная адаптация происходит на уровне штамма с быстрым отбором вариантов штамма с наивысшей приспособленностью при различных давлениях отбора (Martiny, 2006, 2008). Таким образом, метагеномный анализ является мощным инструментом для определения того, какие пути метаболизма углерода выбраны в среде рифов. Этот анализ предоставил гипотезу, которая была экспериментально подтверждена в наших экспериментах in vitro, то есть прямая количественная оценка бактериальной активности. Транскриптомика гораздо более разнообразна и, как и метагеномика, только демонстрирует потенциал, а не активность.Этот аргумент описан в первом абзаце подраздела «Изобилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова».

Авторы не объясняют выбор метода классификации вместо стандартных статистических инструментов, которые хорошо работают с такими данными, и представленных деталей недостаточно, чтобы показать, что результат является статистически устойчивым.

В нашем исследовании мы использовали регрессионный случайный анализ леса (не классификацию — подраздел «Изобилие генов метаболизма углерода в градиенте водорослевого покрова», второй абзац) с водорослевым покровом в качестве переменной ответа и тест перестановки с соответствующими p-значениями.Расшифровка взаимосвязей между составом микробного сообщества, функцией и переменными окружающей среды является статистически сложной задачей из-за многомерности этих наборов данных. Эту проблему можно решить, применяя инструменты машинного обучения, такие как случайные леса (Thompson et al., 2019, Chang et al., 2017, Edoardo et al., 2016, Hunter et al., 2016). Использование более стандартной множественной линейной регрессии, вывода и выбора модели требует допущений нормальности, которые не нужны для случайного леса.Поскольку случайный лес представляет собой метод на основе дерева, он имеет то преимущество, что он может быть реализован с большим количеством переменных-предикторов, а ранги важности переменных, полученные из случайного леса, могут использоваться в качестве инструмента выбора переменных. Мы включили параграф в Результаты и расширили Материалы и методы, описывающие методологию случайного леса:

«Взаимосвязь между покровом мясистых водорослей и относительной численностью генов ферментов была проанализирована с помощью метода статистического обучения случайных лесов с контролируемой регрессией (Breiman, 2001).[…] Важность переменной была выбрана на основе возрастающей среднеквадратичной ошибки, меры важности данной характеристики для правильного предсказания переменной отклика, с отсечкой α 0,05. Никакие выбросы не были удалены из анализов ».

2) Методологические и аналитические ошибки экспериментов по кипению кислорода: данные по кислороду, по-видимому, не прошли ОК / КК, что привело к ложным результатам, основанным на показаниях, полностью выходящих за пределы точного диапазона датчика и во многих случаях за пределами обнаружения датчика. пределы.Анализ неопределенности итоговых ставок отсутствует. Представленные значения чрезвычайно пересыщены по отношению к растворенному кислороду и характерны для условий равновесия в газовой фазе, а это означает, что результаты вряд ли будут иметь отношение к окружающей среде и могут не быть связаны с кипением.

Рецензент ошибочно принял значения, представленные на Рисунке 4 — исходные данные 1: эти значения не концентрации (мкМ), а фактическое количество молей с учетом объема инкубационной камеры, 1.5 L. Мы использовали откалиброванное зондирование и выполнили количественную оценку неопределенности, которая теперь включена в исходные наборы данных, прилагаемые к рукописи. В случаях, когда растворенный O ₂ был выше верхнего предела 20 мг / л, мы консервативно использовали значение 20 мг / л. Чтобы проверить, является ли кипение экологически значимым, мы провели дополнительные эксперименты с открытым резервуаром (рис. 5 — исходные данные 1).

3) Коэффициенты поглощения DOC и кислорода при инкубации, которые не соответствуют ожиданиям, изложенным в Обсуждении: скорости поглощения DOC и кислорода аналогичны ожидаемому соотношению 1: 1 для экссудатов мясистых водорослей, в то время как это контроль и коралловые эксперименты с неожиданными соотношениями.Это означает, что представленное математическое ожидание неверно (поскольку скорость увеличения DIC не равна скорости поглощения DOC), что в экссудате кораллов и контрольных образцах происходит необъяснимый процесс или что неточности являются существенными (были снова нет анализа неопределенности ставок в этом эксперименте).

Автор обзора заявляет, что «чтобы использовать респираторные коэффициенты с DOC, необходимо предположить, что поглощение DOC эквивалентно выбросу CO ₂ (DIC)».Однако часть DOC, потребляемого микробной клеткой, не окисляется до DIC, а вместо этого выделяется в биомассу. Эта фракция сильно варьируется в зависимости от физиологии клетки, как описано в Russel and Cook, 1995. Таким образом, мы не согласны с утверждением автора обзора о том, что отношения DOC: O ₂ эквивалентны респираторным коэффициентам.

4) Отсутствие обсуждения того, что составляет бактериальное сообщество в экспериментах по инкубации и как это влияет на интерпретацию экспериментальных результатов или препятствует их интерпретации: Без обсуждения того, что присутствует в экспериментах, трудно интерпретировать эти результаты.Меняется ли состав сообщества? Определенные клады доминируют в наблюдаемых ответах? Смещает ли неявный выбор структуры сообщества при инкубации результаты в сторону определенных результатов (например, сообщество, которое обычно растет рядом с водорослями, имеет более сильную реакцию на водорослевые экссудаты, чем на источник углерода, для которого оно не адаптировано?).

Бактериальное сообщество, используемое во всех экспериментальных условиях, было одинаковым: сообщества forereef, которые представляют собой прибрежные микробы, которые не подвергались воздействию биогеохимии плоских рифов и, следовательно, еще не были отобраны или не подлежали неявному выбору структуры сообщества (подраздел «Бактериальные бактерии»). Потребность в DOC и кислороде »).Состав бактериального сообщества не может объяснить тенденции в изобилии генов (Результаты: подраздел «Изобилие генов метаболизма углерода в градиенте водорослевого покрова»; Обсуждение: подразделы «Метаболизм избыточного бактериального обмена в рифах с преобладанием водорослей» и «Метаболизм переполнения предсказывает сдвиг в экосистеме»). распределение биомассы »). Ни один из таксонов, которые увеличиваются с покровом водорослей, не кодирует последовательно несколько копий изученных генов или не лишен этих генов.

Далее следует более подробное объяснение этих проблем (с конкретными деталями и некоторыми предложениями по дальнейшим действиям) с мыслью о том, что это может быть полезно для авторов, если они решат подать заявку повторно.

1) Метагеномика а) Метагеномика кажется косвенным инструментом для ответа на вопрос, поставленный авторами относительно экспрессии генов как функции водорослевого покрова. В отсутствие транскриптомных данных, идентифицирующих активную экспрессию генов, требуются некоторые логические шаги, чтобы связать изобилие генов с активными метаболическими путями в микробном сообществе, и текущая статья не предоставляет достаточно подробностей, чтобы обрисовать их или убедить читателя в их обоснованности. .

Как обсуждалось выше, предыдущие исследования показали быструю геномную адаптацию бактериальных сообществ к изменению окружающей среды — времени пребывания — и правомерность использования метагеномики для описания функциональной адаптации бактерий (Nelson et al., 2013, Kelly et al., 2014). Кроме того, метагеномный анализ был использован здесь как инструмент для создания гипотез, который затем был протестирован с помощью контролируемых экспериментов по бактериальной физиологии.

b) Статистический анализ метагеномных данных не описан в достаточной степени, чтобы я мог оценить, насколько он надежен. В частности, нет никаких указаний на то, что генетические данные были нормализованы к численности бактерий или какой-либо другой разумной схеме, чтобы избежать систематических ошибок из-за очень разных выборок сообществ (деления на количество хороших считываний недостаточно).Непонятно, что было, если какая-либо нулевая гипотеза была проверена. 14% -ная ковариация между различиями в сообществе генов и водорослевом покрове является слабым сигналом, учитывая, что пять генов были явно выбраны с ожиданием появления сигнала, и при выбранном значении альфа (0,05) 5% результатов по определению являются ложноположительными. . Используя подход случайного леса, авторы могут оценить нулевую гипотезу на основе распределения дисперсии, объясненной на ~ 1000 случайных подмножеств из пяти генов, а затем оценить значимость значения 14% относительно этого нулевого распределения (которое, по моему опыту, маловероятно, что среднее и стандартное отклонение будет равным 0%, что, по-видимому, подразумевается в текущем анализе).

Данные фактически состоят из 87 независимых метагеномов (подраздел «Изобилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова», первый абзац) и 23 генов лимитирующих стадий центрального углеродного метаболизма и управляющих генов (см. Второй абзац вышеупомянутого подраздела). и дополнительный файл 1). Покрытие из мясистых водорослей было переменной отклика случайного регрессионного анализа лесов. Мы включили более подробную информацию о количестве деревьев, выращиваемых в лесу, о проверке MSE и о тесте перестановки, который включает проверку нулевой гипотезы (см. Вышеупомянутый подраздел и подраздел «Пути центрального углеродного метаболизма», второй параграф, диагностический графики представлены на рис. 1 — дополнения к рисункам 2 и 3).Обилие бактериальных таксонов и потенциальный вклад таксонов с разными размерами геномов анализировался с помощью FRAP (Cobian-Guemes et al., 2016) (–подраздел «Пути центрального углеродного метаболизма», последний абзац).

c) Я задаюсь вопросом, почему использовался подход случайной классификации лесов и регрессии, когда что-то вроде ANOVA должно работать хорошо и обычно используется с данными -omics (с четко проверяемыми гипотезами или PCA, если нет). Поскольку использовался подход случайного леса, требуются дополнительные сведения о количестве деревьев и размере дерева, о разделении данных на обучающие, проверочные и тестовые подмножества и любых результирующих настроенных гиперпараметрах, и, наконец, о том, относятся ли указанные ошибки к нестандартным (классификация) или несоответствие (регрессия) ошибки.Мой личный опыт показывает, что параметры статистического программного обеспечения по умолчанию для случайных лесов могут привести к ненадежным результатам, поэтому необходимо соблюдать осторожность при выборе (и описании) этих характеристик.

Метагеномы были проанализированы с использованием случайной лесной регрессии с тестом перестановки. Выбор непараметрического подхода с машинным обучением был обусловлен его более высокой производительностью по сравнению с традиционной многомерной статистикой при анализе многомерных данных (Thompson et al., 2019; Ли, 2015; Лю и др., 2019). Случайные леса менее чувствительны к размеру обучающей выборки и так же хороши в прогнозировании важности признаков, как нейронные сети и традиционные подходы к видам-индикаторам. В нашем исследовании случайный лес был выращен с использованием 1000 деревьев и 4 переменных расщепления деревьев. Анализ графика среднеквадратичной ошибки случайного леса показывает, что было использовано достаточно деревьев (рисунки 1 — приложения 2 и 3). P-значения теста перестановки получены с использованием 100 повторов перестановок (подраздел «Изобилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова», второй абзац; подраздел «Центральные пути метаболизма углерода», второй параграф).ANOVA и PCA не являются подходящими тестами в нашем случае, поскольку мы не сравниваем группы и не выполняем кластеризацию.

d) Поскольку метагеномы уже собраны, авторы должны знать, какие бактерии на уровне видов / штаммов присутствуют. Таким образом, я считаю, что более убедительной оценкой влияния изменчивости числа копий было бы рассмотрение ортологов и паралогов на уровне видов / штаммов, а затем оценка того, связаны ли определенные крайности водорослевого покрова (очень низкие, очень высокие) с конкретными видами водорослей. виды со многими репликациями или делециями генов, которые определяют общую тенденцию.Выполнение этого на уровне родов, как это принято в настоящее время, может заглушить любой проблемный сигнал, если только род не является моноспецифическим. Однако в рукописи говорится, что на самом деле существует большой разброс уровня деформации, а это означает, что этот выбор потенциально маскирует проблему. Как минимум, хорошая ссылка должна оправдать выбор. И этот анализ по-прежнему не рассматривает потенциальное осложнение вариабельности экспрессии генов между сайтами. Наконец, из Дополнительного файла 1 следует, что автотрофный Prochlorococcus имеет более сильную связь с водорослевым покровом, чем гетеротрофные бактерии, которым посвящена эта работа.Может потребоваться подтвердить, что прохлорококк (синехококк и т. Д.) Не искажает ваш сигнал.

Таксономические профили сообщества представлены на Рисунке 1 — исходные данные 1 и обсуждаются (подраздел «Изобилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова», последний абзац; подраздел «Бактериальный метаболизм в рифе с преобладанием водорослей», последний абзац и подраздел «Метаболизм перелива предсказывает сдвиг в распределении биомассы экосистемы», последний абзац).Мы также включили его как рисунок 1 — исходные данные 1 в текущую версию. Ни один из этих таксонов, различающихся в зависимости от водорослевого покрова (включая Prochlorococcus ), не демонстрирует устойчивых тенденций в отсутствии, наличии или вариации числа копий в генах, имеющих наибольшее значение для функционального анализа. Прогнозы на основе функциональных метагеномных данных микробных сообществ in situ соответствовали физиологическому анализу in vitro, несмотря на высокую размерность данных и сложность влияния окружающей среды на микробы

2) Эксперименты по воспламенению кислорода a) На основании подтверждающих данных Рис. 4 — исходные данные 1, похоже, что в экспериментах с СОЗ не было проведено ОК / КК концентраций кислорода.Концентрация растворенного кислорода в конце всех неконтролирующих экспериментов выходит за пределы указанного точного диапазона для используемого прибора, 0-20 мг / л или 0-200% насыщения, в зависимости от того, что ниже (https: //www.hach .com / hq40d-портативный-мультиметр-ph-проводимость-соленость-tds-растворенный кислород-do-orp-and-ise-for-water / product-details? id = 7640501639). Так как это оптическая система на основе оптодов, диапазон, основанный на концентрации, является больше понятием, чем реальностью, и состояние насыщения всегда должно быть ограничивающим пределом в условиях высокого содержания кислорода.Датчики растворенного кислорода на основе оптодов имеют нелинейную реакцию на концентрацию, поэтому отклонение от истинного значения может изменяться непредсказуемым образом (даже в пределах диапазона 0–200% точность существенно варьируется). Мало того, что все эксперименты выходят за пределы точного диапазона, многие из них (включая все эксперименты CCA) выходят за рамки инструментов (внутренний фильтр QA, очевидно, установлен на 30 мг / л, учитывая постоянные значения конечной точки ~ 935 мкм во многих эксперименты).

Как описано выше, рецензент ошибочно принял значения, представленные на Рисунке 4 — исходные данные 1.Эти значения представляют собой не концентрации (мкМ), а количество молей в камере с учетом объема инкубационной камеры, 1,5 л. Мы использовали калиброванный зонд и выполнили количественную оценку неопределенности, которая теперь включена в исходные наборы данных, предоставленные с рукописью. В случаях, когда растворенный O ₂ был выше верхнего предела 20 мг / л, мы консервативно использовали значение 20 мг / л. Чтобы проверить, является ли кипение экологически значимым, мы провели дополнительные эксперименты с открытым резервуаром (рис. 5 — исходные данные 1).

b) Гипотетически вышеупомянутые экспериментальные данные, полученные ниже верхней границы обнаружения прибора, можно было бы спасти, если бы калибровка полного диапазона для титрования Винклера или другого сенсора проводилась на том же колпачке сенсора, который изначально использовался, при каждой из экспериментальных температур ( чувствительность фольги оптода к кислороду зависит от температуры). См. Пример того, как это может выглядеть, в Bushinsky and Emerson, 2013 (https://doi.org/10.1016/j.marchem.2013.05.001). Но характеристики сенсора существенно увеличиваются, если они новые, и изменяются, если они остаются сухими в течение продолжительного периода времени, поэтому наилучшие результаты были бы достигнуты, если бы колпачок сенсора уже использовался за несколько месяцев до экспериментов. и с тех пор постоянно поддерживается влажным.Но без сверхдетекционных образцов недостаточно экспериментальной мощности для определения значимости…

Неправильная интерпретация концентрации по сравнению с абсолютными значениями на Рисунке 4 — исходные данные 1 теперь были уточнены. Расчеты распространения неопределенности представлены в исходных данных для рисунков 2, 3 и 4 и описаны в разделе «Материалы и методы» (–подраздел «Количественная оценка неопределенности»).

c) Меня беспокоит, как описывается отбор проб газа из свободного пространства.В рукописи говорится, что газ был перенесен из шприца в контейнер с широким горлом, в который был помещен второй зонд. Газ быстро диффундирует, поэтому я не понимаю, как это может привести к точным измерениям, но я могу неправильно понять, и это относится к растворенному образцу? В любом случае это описание нуждается в уточнении.

Были использованы герметичные контейнеры и клапаны, а концентрация кислорода в образце была измерена сразу после сбора путем переноса объема газа в контейнер с широким горлышком, расположенный рядом с инкубационной камерой.Все контейнеры и инкубационные камеры находились под водой внутри более крупного сборного резервуара, и во время процедур количественной оценки потери газа не происходило (подраздел «O ₂ , выброс бентосных первичных продуцентов», первый абзац).

d) Не считая вопросов точности, описанных выше, все значения свободного пространства приблизительно находятся в равновесии с измеренным вами растворенным кислородом. Коэффициенты растворимости по закону Генри предсказывают концентрации 0,36-0,94 мг / мл и 1,3-20,6 мг кислорода в газовой фазе над пробами воды — близкие к 0.Измерено 4-0,85 мг / мл и 1,1-17 мг O ₂ (при давлении 1 атм и без учета любого запаздывания между производством и диффузией). Таким образом, я думаю, что наличие свободного пространства не является доказательством важности кипения в естественной среде — это доказательство того, что сильно перенасыщенный раствор будет выталкивать газ в свободное пространство (например, CO ₂ находится в неэкспериментальной популяции. бутылка). Я подозреваю, что зародышеобразование пузырьков было необходимо, поскольку контрольные элементы также были перенасыщены и не образовывали свободного пространства, но они были намного менее перенасыщенными, поэтому это было бы более убедительно с доказательствами подъема пузырьков в камерах — в противном случае достаточно одной термодинамики без каких-либо биофизических взаимодействий. .Во всяком случае, вышесказанное мне подсказывает, что эти камеры вряд ли будут отражать экологические последствия в отношении количества кислорода, выделяемого в пузырьках. В этом свете очень трудно подтвердить утверждение, что в рифах с преобладанием водорослей 1/3 кислорода улетучивается в виде пузырьков.

Теперь мы предоставляем данные, показывающие, что пузырьки образуются на водорослях и поднимаются на поверхность в открытой системе, где концентрация кислорода в воде может уравновешиваться с атмосферой (рис. 5 — исходные данные 1, видео 1 и 2).Никакой взаимосвязи между концентрацией растворенного кислорода в воде и скоростью кипения не наблюдалось, что свидетельствует о гетерогенном зародышеобразовании из-за перенасыщения поверхностного микроокружения водорослей (рис. 5B, видео 1 и 2 и подраздел «Производство, потребление и кипение кислорода», второй абзац).

e) Нет анализа неопределенности этих показателей. Учитывая относительно грубые измерения объема пузырьков (с точностью до 0,5 мл), короткую продолжительность (2-4 часа) и неопределенность состояния насыщения (даже когда прибор находится в пределах указанного диапазона), как производство газа, так и изменение растворенного кислорода должны изменяться. имеют значительные неопределенности, но они не определены количественно.Я думаю, что они должны быть такими, и показана относительная неопределенность каждого эксперимента, чтобы читатель мог оценить, насколько на самом деле значительны различия между категориями ящиков и усов. Кроме того, 2 балла не являются убедительной оценкой.

Мы выполнили количественную оценку неопределенности всех данных инкубации, которая представлена ​​в файлах исходных данных для рисунков 2, 3 и 4. Все ошибки, вызванные погрешностью прибора, были как минимум в пять раз меньше, чем статистические стандартные отклонения, и не учитывались в статистические тесты (–подраздел «Количественная оценка неопределенности»).

3) Эксперименты по поглощению DOC и кислорода

Отношения поглощения DOC и кислорода в этих экспериментах далеки от 1: 1, но это не так, как описано, чтобы поддержать аргументы о менее полном окислении органического вещества. Чтобы использовать респираторные коэффициенты с DOC, необходимо предположить, что поглощение DOC эквивалентно высвобождению CO ₂ (DIC). Аргументы, выдвинутые в этой рукописи о неполном окислении органического вещества, будут возражать против этого для макроводорослей, но я пока отложу это.В любом случае соотношение -DOC / -O ₂ для экссудата мясистых водорослей составляет ~ 0,9, что соответствует теоретическим и измеренным значениям + DIC / -O ₂ для бактериопланктона (Robinson 2019, https: // doi.org/10.3389/fmars.2018.00533). Вместо этого кажется, что у элементов управления и кораллов неожиданные значения порядка 0,3. Итак, я вижу три варианта: 1) соотношение скоростей -DOC / -O ₂ на самом деле не должно быть ~ 1: 1 (или, скорее, 0,9), и поэтому обсуждение респираторных коэффициентов — отвлекающий маневр.2) кораллы и регуляторы делают что-то необычное, что требует объяснения. 3) Есть серьезные отклонения в ставках. Я думаю, что анализ ошибок, который я рекомендовал для производственных флюсов O ₂ , также должен быть проведен здесь и может дать ответ на этот вопрос. Итак, в целом я согласен с тем, что инкубации показывают большее потребление кислорода на единицу DOC, потребляемого с контрольными и коралловыми экссудатами, чем с водорослевыми экссудатами, но, поскольку ни одна из этих категорий не соответствует заявленным ожиданиям, необходимо изучить более подробно, чтобы подтвердить, что результат реальный и надежный.

Как описано выше, мы не согласны с утверждением рецензента о том, что «чтобы использовать респираторные коэффициенты с DOC, необходимо предположить, что поглощение DOC эквивалентно высвобождению CO ₂ (DIC)», поскольку часть DOC потребляется микробной клеткой. не окисляется до DIC, а вместо этого выделяется в биомассу (обзор Russel and Cook, 1995). Когда респираторные коэффициенты упоминались в предыдущей версии, они относились к метаболизму первичных продуцентов, а не к потреблению бактерий.Мы перефразировали этот раздел, чтобы избежать путаницы (подраздел «Кипение вызывает потерю O ₂ коралловых рифов»).

Интерпретация о том, что увеличивающаяся часть органического углерода, потребляемого бактериями, не полностью окисляется, подтверждается разделением между потреблением органического углерода и кислорода (Рисунок 2), а также более высокой биомассой, накопленной на клетку (Рисунок 3).

4) Структура бактериального сообщества

Структура бактериального сообщества не обсуждается.На рисунке 1 сложно определить, как оно расходится в разных средах. Я не нахожу никакой информации о том, как выглядело бактериальное сообщество в различных экспериментах по инкубации.

Результаты по составу бактериального сообщества обсуждаются в подразделе «Бактериальный метаболизм перелива в рифе с преобладанием водорослей» и подразделе «Метаболизм перелива прогнозирует изменение распределения биомассы в экосистеме». Мы также включаем данные в качестве исходных данных для рисунка 1 в эту версию рукописи.

Таким образом, я не могу оценить, являются ли результаты инкубации функцией, например, инкубации сообщества, адаптированного к одной конкретной среде, таким образом, чтобы это повлияло на результаты экспериментов. Хотя есть упоминание об изменении структуры сообщества в отношении инкубаций (Обсуждение), в приложении нет данных относительно сообщества в этих экспериментах, и я не ожидал бы изменения генетического состава в ходе экспериментов, продолжающихся от нескольких часов до нескольких дней (опять же , вопрос к транскриптомике?).Это затрудняет интерпретацию того, что происходит в экспериментах, в которых оценивается изменение биомассы. Связаны ли изменения биомассы в основном с одной кладой? Отбираются ли определенные более крупные типы бактерий или отдельные бактерии становятся крупнее, а другие — нет? Это ожидаемый результат, основанный на том, где эти бактерии обычно являются экологически успешными?

Бактериальный инокулят для экспериментов представлял собой сообщество прибрежной водной толщи, которое представляет собой прибрежное сообщество, еще не адаптированное к среде рифа (подраздел «Бактериальный DOC и потребность в кислороде»).Эти сообщества достигают рифа с набегающими течениями и подвергаются воздействию источников углерода рифа и биогеохимической среды. Они выбираются во временном интервале времени пребывания в воде по мере того, как морская вода течет в рифовые лагуны и выходит из них (часы), такие же временные рамки экспериментов по инкубации, проводимых здесь (Nelson et al., 2011, 2013). В экспериментах бактериальные сообщества подвергаются воздействию таких же источников углерода и кислорода, с которыми сталкиваются прибрежные сообщества, когда они достигают рифов с преобладанием кораллов или водорослей.Следовательно, давление отбора одинаково и должно приводить к сходным физиологическим ответам и геномной адаптации.

В частности, изменения размера клеток, наблюдаемые in situ, не могут быть объяснены изменениями численности одной клады. Единственной кладой, показывающей высокую относительную численность, которая изменилась с покровом водорослей, была Prochlorococcus , объем клеток которой сопоставим с объемом клеток, наблюдаемым в прибрежной воде, ~ 0,1 мкм ³ (Kirchman, 2016), что является средним объемом клеток, наблюдаемым в инокуляте. сообщество наших инкубационных экспериментов.Другие группы со значительными связями с покровом мясистых водорослей составляли от 0,9 до 1,4% сообщества, и их средний размер клеток не согласуется с наблюдаемым увеличением размера клеток: Thermotoga имеет крупные клетки, но их количество уменьшилось с водорослями. . Leuconostoc, Rhodopirellula, и Methanobacterium также уменьшаются в численности с увеличением количества водорослей. Следовательно, ни одна из этих кладок не может объяснить изменение размера, наблюдаемое в этом исследовании.Мы включили это подробное описание в Обсуждение (подраздел «Метаболизм переполнения предсказывает сдвиг в распределении биомассы экосистемы»).

Рецензент № 2:

Это исследование обеспечивает теоретический и экспериментальный подход к доказательствам для объяснения наблюдений за истощением O ₂ в коралловых рифах с преобладанием водорослей. Постулируется, что процессы кипения и микробного метаболизма приводят к более низкому наблюдаемому уровню кислорода в рифах с преобладанием водорослей. В целом рукопись очень интересна и детализирует красивую комбинацию анализа на основе геномики окружающей среды, связанного с контролируемыми экспериментальными испытаниями.Постулируемые физические и биологические причины снижения уровней O ₂ подтверждаются экспериментальными данными, хотя выводы все еще носят несколько умозрительный характер. Однако этот подход представляет собой отличный подход к науке, основанной на гипотезах; и хотя он не может однозначно подтвердить, что эти процессы (то есть кипение и микробный метаболизм) как движущие силы истощения O ₂ , он устанавливает концепции для дальнейшего тестирования в условиях окружающей среды. Следовательно, рукопись достойна публикации с несколькими подробными ниже комментариями, в которых подчеркиваются потенциальные области для улучшения.

Мы благодарим рецензента за комментарии, которые мы полностью учли при написании пересмотренной версии, включая перефразирование выводов, чтобы избежать неправильной экстраполяции данных in vitro на динамику in situ.

[Примечание редакции: ответы автора на повторную рецензию приводятся ниже.]

Благодарим вас за то, что вы решили отправить свою работу под названием «Биофизические и физиологические процессы, вызывающие потерю кислорода коралловыми рифами» на рассмотрение в eLife.

Благодарим вас за то, что поделились своим опровержением. Мы приветствуем пересмотр вашей работы для нового цикла обзора и отмечаем, что пересмотр должен решить следующие проблемы:

В тексте отсутствует или неясно обоснование ряда статистических и аналитических вариантов, а также имеются слабые места в некоторых линиях доказательств, включая нерешенные проблемы с экспериментами по производству кислорода. Таким образом, настоящая рукопись, по мнению двух рецензентов, представляет интерпретации с уверенностью и убедительностью, которые, как мы думали, не оправдываются нынешней совокупностью наводящих на размышления (но не окончательных) свидетельств.Чтобы получить независимое мнение, вы можете проконсультироваться с доктором Кларой Фуксман (Лаборатория Хорн-Пойнт, [email protected]).

Благодарим редактора и рецензентов за комментарии. Мы расширили Материалы и методы для более подробного описания случайных лесов (подраздел «Центральные пути метаболизма углерода», второй абзац), а также предоставили обоснование для выбора случайных лесов (подраздел «Изобилие генов метаболизма углерода в градиенте водорослевого покрова», второй абзац) и другие выполненные статистические тесты (–подраздел «Статистические тесты»).

Что касается свидетельств для измерений кислорода, были внесены два важных изменения:

i) Были проведены дополнительные эксперименты для количественной оценки скорости вскипания кораллов и водорослей в открытой системе (рис. 5). Эти эксперименты показывают, что кипение происходит из-за образования пузырьков на поверхности водорослей. Эти пузырьки отделяются от водорослей и поднимаются через толщу воды (видео 1 и 2). Не было никакой связи между скоростью кипения и концентрацией растворенного кислорода в толще воды (рис. 5), что позволяет предположить, что кипение происходит не из-за перенасыщения в толще воды, а в результате гетерогенного зародышеобразования на поверхности водорослей.Скорости, наблюдаемые в новых экспериментах, находятся в диапазоне скоростей, которые, по оценкам, необходимы для объяснения газа, произведенного в предыдущих экспериментах с СОЗ (рис. 4). Описание того, как были рассчитаны эти прогнозируемые скорости, приведено в разделе «Материалы и методы» (подраздел «Оценки потерь кислорода из-за кипения»), а в разделе «Результаты» было обновлено указание на то, что в некоторых камерах для СОЗ наблюдалось пересыщение, и эта проблема была решена в эксперимент с открытым резервуаром (подраздел «Производство, потребление и кипение кислорода», второй абзац).

ii) Наш главный вывод состоит в том, что микробное дыхание и кипение вносят вклад в потерю значительной части кислорода, производимого первичными продуцентами рифа. Этот вывод подтверждается экспериментами in vitro в данном исследовании. В текущую версию мы включили взвешенную линейную модель (подраздел «Прогнозирующая модель», рис. 5D), которая включает показатели дыхания из экспериментов по инкубации в темноте (рис. 2), численность микробов, поддерживаемую первичными продуцентами (рис. 3), и продукцию кислорода. (рис. 4) в идеализированный риф с различным покровом кораллов и водорослей.Модель предсказала долю валового производства кислорода, потребляемого микробным дыханием и кипением в градиенте водорослевого покрова. Этот прогноз устанавливает основу для будущих исследований на местах.

Спасибо за разъяснение кислородных единиц. Тем не менее, все эксперименты с CCA и большинство экспериментов с мясистыми макроводорослями были вне пределов обнаружения вашего прибора (20 мг / л), о чем свидетельствуют постоянные конечные концентрации (937,5 мкмоль / 1,5 л = 625 мкМ = 20 мг / л) по всему периметру. несколько номинально независимых экспериментов.Концентрации в свободном пространстве также по-прежнему отражают условия равновесия с подстилающей водой, когда раствор сильно перенасыщен (как это было в большинстве неконтролирующих экспериментов). Насколько актуальны эти эксперименты для объяснения потери кислорода в реальных условиях окружающей среды (менее перенасыщенных и открытых для атмосферы)?

Мы описали эту проблему в текущей версии (подраздел «Производство, потребление и вскипание кислорода») и провели новые эксперименты с открытым резервуаром, которые ближе к реальным условиям окружающей среды из-за уравновешивания с атмосферным кислородом.Эти эксперименты показали значительно более высокую скорость кипения водорослей по сравнению с кораллами (рис. 5 — исходные данные 1, видеоролики 1 и 2). Скорость кипения не коррелировала с концентрацией растворенного кислорода в воде, что указывает на то, что кипение происходит из-за гетерогенного зародышеобразования на поверхности водорослей. Кипение было ранее обнаружено в поле на коралловых рифах (Odum and Odum, 1955, Bellamy and Risk, 1982; Clavier et al., 2008 Freeman, 2018), хотя его вклад в кислородный бюджет никогда не оценивался количественно.Недавно было продемонстрировано, что кипение является причиной потери до 21 и 37% продукции O ₂ в солончаке и озере, соответственно (Howard et al., 2018; Koschorreck et al., 2017). Это явление может приобретать все большее значение из-за текущих фазовых сдвигов водорослей, происходящих на коралловых рифах (рис. 5D).

Существуют статистические методы для работы с данными, не имеющими нормального распределения (или, точнее, с распределениями ошибок, не являющимися условно нормальными) .Регрессия случайного леса вполне может быть хорошим выбором для этого анализа, но необходимо объяснить обоснование и особенности четко указано, как это используется.

Мы согласны и включили обоснование использования случайного леса (подраздел «Изобилие генов метаболизма углерода в градиенте водорослевого покрова», второй абзац), а также описание используемых тестов и параметров (подраздел «Пути центрального углеродного метаболизма», второй абзац). ).

Независимо от того, 5 или 16 генов, корреляции с переменными окружающей среды требуют большего контекста. Наше беспокойство по-прежнему вызывает размер эффекта по сравнению с нулевой гипотезой о каком-то другом случайном наборе генов из ваших уже секвенированных геномов, которые намного больше, чем 16 генов.Деталей, необходимых для оценки «реальных» различий, в настоящее время недостаточно. например были ли данные нормализованы по численности бактерий? Один геном размером 100 мегабайт будет иметь гораздо больше считываний, чем геном размером 1 мегабайт, даже если организмов с меньшим геномом в 10 раз больше. Возможно, вы сделали обдуманный выбор в отношении этих и других потенциальных проблем в своем анализе, но вы не говорите читателю ничего из этого, даже в приложении.

Мы подошли к проблеме поиска генов, которые действительно коррелируют с покровом водорослей, двумя способами:

i) Мы выполнили перестановочную версию теста случайного леса, которая имеет неявный тест нулевой гипотезы.Пять указанных генов были единственными с p-значением менее 0,05 в этом тесте (- подраздел «Изобилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова», второй абзац и легенда на Рисунке 1). Данные не нормализованы по численности бактерий, потому что цель состоит в том, чтобы проверить относительного обогащения или истощения генов в сообществе. Нормализация по численности бактерий исказила бы этот анализ, потому что увеличение численности клеток будет приводить к увеличению численности генов даже без относительного обогащения для определенных функций.Мы также использовали контрольные гены, такие как rpoB, ген РНК-полимеразы, который является домашним и является единственной копией, относительная численность которого не изменится в зависимости от градиентов окружающей среды. Не изменилась и численность генов окислительного стресса.

ii) Чтобы проверить влияние различий в размерах геномов и вероятность того, что организмы с более крупными геномами вносят непропорциональный вклад в наблюдаемые тенденции, мы проанализировали влияние таксономического состава на функциональные изменения. Текущая версия включает анализ на уровне родов и видов.Численность каждого таксона рассчитывалась с использованием метода FRAP, который учитывает вероятность данного считывания отображения в геном с учетом размера генома (Cobian-Guemes et al., 2016) (–подраздел «Центральные пути метаболизма углерода», последний абзац). Затем мы проверили, постоянно ли таксоны, различающиеся по численности, демонстрируют вариации числа копий в генах, которые существенно различаются в зависимости от покрытия водорослями. Ни один из таксономических переходов не смог объяснить наблюдаемые функциональные тенденции (–подраздел «Изобилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова», последний абзац).Более подробная информация о влиянии численности Prochlorococcus приведена ниже в ответах рецензентам и в тексте (подраздел «Обилие генов углеродного метаболизма в градиенте водорослевого покрова», последний абзац; подраздел «Бактериальный метаболизм переполнения в рифе с преобладанием водорослей», последний абзац, –подраздел «Метаболизм перелива предсказывает сдвиг в распределении биомассы экосистемы», последний абзац).

Относительно вашего выбора подхода к метагеномным данным. Просьба представить контекст и обосновать выбор (и аспекты анализа этих данных) в тексте.Было бы неплохо осветить обоснование этого подхода в тексте столь же сжато, как вы это делаете в своем ответном письме.

Мы включили обоснование этого анализа в начало раздела «Результаты», непосредственно перед тем, как представить метагеномные результаты: «Различные пути потребления углерода, используемые бактериями, связаны с различными уровнями скорости потребления кислорода (Russell and Cook, 1995). […] На коралловых рифах метагеномные данные отражают геномную адаптацию на уровне штамма, которая происходит в пределах временного интервала времени пребывания, когда морские микробные сообщества переносятся в среду рифа, где водные массы обогащаются бентосными экссудатами, изменяя их биогеохимию (Nelson et al. ., 2011, Келли и др., 2015) ».

Микробиология устойчивости кораллов — с небольшой помощью моих друзей

05.11.2021

Прошло много времени с тех пор, как меня стали считать исследователем микробиома кораллов. И в отличие от многих моих друзей и коллег, я не являюсь традиционным микробным экологом, который занимается геномикой. На самом деле как раз наоборот. Традиционно я геномик.Мне нравятся данные, большие данные, и мне нравятся компьютеры. Мне нравятся систематические, крупномасштабные подходы и выяснение аналитических процедур, которые работают с большим набором выборок или данных. Но мне также нравится «отключиться» в буквальном смысле от современного мира технологий. С детства меня тянуло к мистике океана — такого огромного места, еще менее изученного, чем поверхность Луны, где предстоит сделать много захватывающих открытий! Я вырос в академической среде, когда стало возможно рассматривать все гены или белки организма одновременно — параллельно — и когда секвенирование генома перестало быть несбыточной мечтой, предназначенной только для нескольких модельных организмов, которые мы очень ценим, но стал ценным фундаментом для многих направлений исследований.Имея свою долю работы с плодовой мушкой и мышью во время учебы в магистратуре и докторантуре, только в качестве постдока я вернулся к своей страсти к океану, сделав это частью моей научной карьеры; это, кстати, составляло значительную часть моей жизни, поэтому я знал, что мне лучше делать то, что я люблю, чтобы любить то, что я делаю. Однако на этот раз я взял с собой целый арсенал модельной системной геномики, чтобы изучить широкий спектр симбиотических взаимодействий, происходящих в самых загруженных и биоразнообразных морских экосистемах из всех — коралловых рифах.

Коралловые рифы

Если вы изучаете коралловые рифы, вы должны сделать свой выбор. Буквально тысячи видов процветают на здоровых коралловых рифах — они изобилуют жизнью и на самом деле больше похожи на оживленный город. В конце концов, это вполне оправданное сравнение, поскольку коралловые рифы представляют собой крупнейшие биогенные структуры на Земле. Настолько большие, что их действительно можно заметить с Луны. Ну, Большой Барьерный риф в Австралии, который является самой большой системой рифов в мире. Около миллиарда человек зависят от коралловых рифов как источника средств к существованию, будь то источник белка, защита береговой линии или источник дохода (например, от туризма).Для меня всегда было ясно, что я выбираю кораллы, которые буквально являются основополагающими видами этих экосистем. Для неподготовленного взгляда они могут быть ошибочно приняты за разноцветные камни, но на самом деле это сидячие животные, которые «научились» жить, как растения. Это потому, что они содержат в своих тканях небольшие растения, то есть микроводоросли, называемые Symbiodiniaceae, которые обеспечивают их сахаром в результате фотосинтеза. Симбиотические отношения настолько успешны, что покрывают почти 100% потребностей кораллов в энергии и обеспечивают кораллам основу для построения скелетов из карбоната кальция.Это, в свою очередь, порождает трехмерную пространственную структуру рифов, которая затем обеспечивает среду обитания для множества видов, которые можно найти.

Коралловый метаорганизм

Но на этом история не заканчивается. Помимо Symbiodiniaceae, коралловые животные связаны со многими другими организмами, в первую очередь с бактериями, но также с грибами, другими водорослями, простейшими, археями и вирусами, которые так или иначе вносят свой вклад в биологию кораллов. Вот почему мы говорим о коралловых холобионтах, чтобы признать, что для создания рифа требуется сотрудничество многих организмов.Коралловые биологи уже довольно давно поняли это: симбиотические отношения с микроорганизмами являются строительным блоком успеха кораллов. Но только около десяти лет назад это было связано с более широким представлением о том, что метаорганизм — организм организмов, сумма многоклеточного хозяина и его микробных партнеров — представляет собой функциональную биологическую единицу, которую необходимо учитывать. Биология в целом пришла к признанию того, что микробы имеют значение не только сами по себе, но и как симбиотические партнеры животных и растений.Об этом мы тоже знали довольно давно. Подумайте о взаимосвязи между растением и ризобиями: это буквально хрестоматийный пример того, как почвенные бактерии взаимодействуют с корнями растений, производя азот в обмен на получение питательных веществ. Что изменилось, так это представление о том, что практически вся жизнь является симбиотической: метаорганизмы являются скорее правилом, чем исключением. Вместе с пониманием того, что бактерии расширяют возможности своих организмов-хозяев, является представление о том, что эти ассоциации в определенной степени гибкие. Следовательно, можно приобретать новые черты посредством ассоциации с новыми микробами и потенциально адаптироваться к изменяющейся окружающей среде, причем гораздо быстрее, чем посредством эволюции (хозяина).Все, что для этого требуется, — это замена микробов.

Обесцвечивание кораллов и изменение климата

Это возвращает нас к коралловым рифам. Жизнь кажется персиковой, как коралл, но на самом деле кораллы понесли беспрецедентные потери за последние десятилетия. Мы потеряли около половины всех кораллов. Частично это связано с местными факторами, такими как чрезмерный вылов рыбы, загрязнение и развитие прибрежных районов. Но симбиотические отношения между кораллами и их микроводорослями чрезвычайно чувствительны к повышению температуры воды по сравнению с ее историческим летним средним значением.Продолжительные периоды потепления приводят к так называемому обесцвечиванию кораллов, то есть физическому побелению коралловых животных из-за потери их красочных симбиотических микроводорослей. Без водорослей кораллы теряют источник пищи и в конечном итоге умирают от голода. Это явление было практически неизвестно до 1980-х годов, по крайней мере, в отношении широко распространенного отбеливания. В настоящее время изменение климата способствует потеплению океана и привело к трем глобальным событиям массового обесцвечивания кораллов за последние два десятилетия.Есть опасения, что мы рискуем потерять рифовые экосистемы в целом из-за продолжающегося прогнозируемого потепления. По иронии судьбы, но даже прогнозируемое сдерживание глобального потепления до уровня ниже 2 ° C может оказаться слишком теплым для многих кораллов, чтобы выжить. Итак, нам нужно что-то с этим делать.

Микробиология устойчивости кораллов

Известно, что обесцвечивание тесно связано с микробами, с которыми кораллы ассоциируют, в первую очередь с микроводорослями типа Symbiodiniaceae. Гипотетически потеря Symbiodiniaceae во время отбеливания дает возможность ассоциироваться с новыми, более термотолерантными микроводорослями, известными как «гипотеза адаптивного отбеливания».И действительно, круговорот микроводорослей можно наблюдать в дикой природе. Однако такие новые ассоциации обычно сохраняются только на время термической аномалии и вскоре после этого возвращаются к своей исходной конфигурации. Такая высокая «симбионтная верность» может быть объяснена длительной историей эволюции обоих организмов, которая может привести к совместной диверсификации, если не коэволюции. С точки зрения непрофессионала, кораллы и микроводоросли научились жить с особенностями своего партнера, и, возможно, будет не так просто завязать новые отношения.Однако с бактериями дело обстоит иначе. Большинство бактерий, связанных с кораллами, не обитают внутри клетки, а скорее находятся в так называемом поверхностном слое слизи, который обеспечивает защиту коралловой ткани, обеспечивая при этом обмен газов и метаболитов — очень похоже на поверхность слизистой оболочки нашего организма. кишки млекопитающих. В этом пространстве ассоциации гораздо менее устойчивы, и теперь мы знаем, что микробиомы многих кораллов адаптируются под воздействием термически стрессовой среды, которая может превратить чувствительные к обесцвечиванию кораллы в более устойчивые.Такая «гибкость микробиома» подпитывает надежду на то, что адаптация с помощью микробов к более напряженной среде может обеспечить альтернативный, более быстрый путь к адаптации организма. Действительно, совсем недавно манипуляции с микробиомами кораллов путем добавления природных полезных бактерий продемонстрировали способность коралловых пробиотиков смягчать обесцвечивание и их потенциал в качестве «терапии» для минимизации гибели кораллов. Хотя я был свидетелем ухудшения состояния коралловых рифов в течение своей жизни, обнадеживает то, что появляется потенциальное лечение.Остается много открытых вопросов, но одно можно сказать наверняка: мы — метаорганизмы в бактериальном мире, предоставляющие огромные возможности, которые еще предстоит изучить.

Дополнительная литература

Hughes TP, Kerry JT, Baird AH, Connolly SR, Dietzel A et al. Глобальное потепление трансформирует сообщества коралловых рифов. Nature 2018; 556: 492–496.

LaJeunesse TC, Parkinson JE, Gabrielson PW, Jeong HJ, Reimer JD et al. Систематический пересмотр Symbiodiniaceae подчеркивает древность и разнообразие коралловых эндосимбионтов. Curr Biol 2018; 28: 2570–2580. e6.

McFall-Ngai M, Hadfield MG, Bosch TCG, Carey HV, Domazet-Lošo T et al. Животные в бактериальном мире — новый императив для наук о жизни. Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 3229–3236.

Peixoto RS, Sweet M, Villela HDM, Cardoso P, Thomas T et al. Коралловые пробиотики: предпосылки, перспективы, перспективы. Annu Rev Anim Biosci 2021; 9: 265–288.

Voolstra CR, Ziegler M. Адаптация с помощью микробов: гибкость микробиома способствует быстрой реакции на изменение окружающей среды. BioEssays 2020; 42: e2000004.

Кристиан Р. Вулстра

Профессор генетики адаптации водных систем, факультет биологии, Констанцкий университет, Констанц 78457, Германия

[адрес электронной почты защищен]
@reefgenomics

Доктор Вулстра изучает функцию и адаптивную способность коралловых метаорганизмов, сочетая экологический, экологический, микробный и молекулярный подходы.Последние исследования доктора Вулстры позволили получить особенно продвинутые знания о том, как бактериальный микробиом влияет на восприимчивость кораллов к обесцвечиванию и стрессоустойчивость, выявление мелкомасштабных генетических различий между симбионтами микроводорослей, а также разработку пригодных для полевых работ
стандартизированные методы фенотипирования для лучшего понимания биологических и экологических характеристик, поддерживающих устойчивость кораллов.

Какие части вашей работы вам кажутся наиболее трудными?

Во-первых, для меня огромная честь иметь возможность выполнять ту работу, которую я делаю, взаимодействовать с таким количеством умных и мотивированных людей, а также узнавать и знакомиться с частями этого мира, которые видят немногие.Наверное, самое сложное для меня — это как реально изменить мир к лучшему. Исследования приносят удовлетворение, но мы обязаны выйти из «башни из слоновой кости» и принять участие в общественной дискуссии о том, в каком мире мы хотим жить и как мир должен выглядеть так, чтобы мы (и будущие поколения) могли жить в нем. Я ставлю перед собой задачу найти лучшие и другие способы участвовать в этом.

Что вы считаете своим самым большим достижением?

Я думаю, что у меня хорошо получается помогать людям и продвигать методы / подходы, действительно соединять точки вещей, которые частично присутствуют, но нуждаются в дальнейшем продвижении, чтобы «стать мейнстримом».Я горжусь SymPortal ( symportal.org ), потому что он стандартизирует то, как мы анализируем микроводоросли (Symbiodiniaceae), с которыми ассоциируются кораллы. Аналогичным образом, автоматизированная система стресса для отбеливания кораллов (CBASS) реализует стандартизированную диагностику восприимчивости кораллов к обесцвечиванию и пользуется все большей популярностью. Наконец, понятие «гибкость микробиома» обеспечивает основу для интерпретации возможности микробных манипуляций для поддержки устойчивости кораллов. Во всех этих случаях моя основная работа заключалась в обеспечении интеллектуального пространства, академической свободы или финансовых средств для поддержки невероятно талантливых людей или для соединения линий существующей предыдущей работы / исследований.

Изображение: Анна Ройк. Кораллы обеспечивают структурную и пространственную основу рифовых экосистем за счет их скелеты из карбоната кальция, которые служат средой обитания для множества видов и может напоминать сложность и загруженность больших городов.

Биофизические и физиологические причины микробиализации коралловых рифов

Abstract

Коралловые рифы сокращаются во всем мире по мере того, как сообщества их основных продуцентов переходят от каменистых кораллов к преобладанию мясистых макроводорослей.Ранее мы показали, что рост мясистых макроводорослей производит растворенный органический углерод (DOC), который приводит к микробиализации и гибели кораллов. Здесь мы проверяем гипотезу о том, что биофизической причиной накопления бактериальной биомассы является относительное уменьшение количества акцепторов электронов по сравнению с донорами электронов из-за потери O ₂ из макроводорослей. Мы показываем, что 37% фотосинтетического O ₂ , производимого рифовыми мясистыми макроводорослями, теряется в виде газа в результате кипения с поверхности водорослей.O ₂ потеря увеличивает соотношение DOC: O ₂ , отделяя фотосинтетически фиксированный углерод от окислительного потенциала для дыхания. Эта биогеохимическая среда заставляет гетеротрофных микробов увеличивать потребление DOC в клетках и увеличивать размеры клеток, накапливая биомассу. Напротив, кораллы не теряют кислород и поддерживают рост более мелких и меньшего количества бактерий. In situ биомасса и метагеномный анализ 87 рифов в Тихом океане и Карибском бассейне показывают, что на рифах, где преобладают водоросли, бактерии накапливают органический углерод за счет увеличения аэробного гликолитического метаболизма, как у Варбурга.Из-за своей биофизической основы микробиализация, согласно прогнозам, будет происходить в других морских экосистемах, перемещая сообщества первичных продуцентов, такие как планктонные сообщества, в условиях потепления и подкисления.

Введение

Антропогенное воздействие приводит к смещению состава сообществ основных продуцентов рифов с кальцифицирующих организмов на некальцифицирующие организмы во всем мире (Cinner et al., 2016; Smith et al., 2016). Эти изменения происходят по мере того, как мясистые водоросли получают конкурентное преимущество перед кораллами за счет взаимодействия с гетеротрофными микробами (Barott and Rohwer 2012; Jorissen et al.2016). Скорость высвобождения высокого растворенного органического углерода (DOC) мясистыми водорослями стимулирует рост так называемых супергетеротрофных бактерий (Haas et al. 2011; Nelson et al. 2013; Kelly et al. 2014). Усиленный гетеротрофный рост в зонах взаимодействия кораллов и водорослей потребляет большое количество кислорода, создавая зоны гипоксии, которые убивают кораллы (Haas et al. 2013a; Haas et al. 2014b; Roach et al. 2017). В масштабе рифа переход от доминирования кораллов к водорослям стимулирует микробный гетеротрофный метаболизм в воде над рифом (Silveira et al.2015; Haas et al. 2016; Silveira et al. 2017а). Такое потребление кислорода микробами создает петлю обратной связи, включающую гибель кораллов, разрастание водорослей и накопление микробной биомассы, описываемую как микробиализация рифов (Dinsdale and Rohwer 2011). Понимание перераспределения биомассы коралловых рифов в гетеротрофные бактериальные компартменты в ущерб макрогетеротрофам требует увязки фотосинтеза, дыхания и динамики распределения биомассы во время деградации рифа (McDole et al.2012; Haas et al.2016).

Различия в ответах микробов на доминирование кораллов и водорослей связаны с физиологией этих основных продуцентов. Кальцифицирующие организмы, в том числе склерактиниевые кораллы и корковые кораллиновые водоросли (CCA), вкладывают от 50 до 80% своего дневного фиксированного углерода в дыхание, чтобы поддерживать энергетические затраты на кальцификацию (Tremblay et al. 2012). Мясистые макроводоросли выделяют от 10 до 30% на дыхание и выделяют до 60% своей первичной продукции в виде растворенного органического углерода (DOC) (Jokiel and Morrissey 1986; Crossland 1987; Cheshire et al.1996; Peninsula et al. 2007). Соотношение между DOC и O ₂ , выделяемым мясистыми водорослями при инкубации в бутылках, выше по сравнению с кораллами (Haas et al. 2011; Haas et al. 2013b). Физиология кораллов и водорослей может предсказать противоположную картину, потому что (а) мясистые водоросли выделяют более высокую долю своего суточного синтезированного углерода в биомассу по сравнению с кораллами, поддерживая высокое давление травоядных (Falkowski et al.1984; Duarte and Cebrián 1996; Tremblay et al. 2016), и (b) кораллы выделяют большую часть своего углеродного бюджета на дыхание (Hatcher 1988; Houlbrèque и Ferrier-Pagès 2009; Tremblay et al.2016). Предполагается, что вместе эти процессы увеличат соотношение DOC-O ₂ в экссудатах кораллов по сравнению с водорослями, но экспериментальные данные показали обратное (Haas et al. 2011).

Гетеротрофные микробы, растущие на водорослевом экссудате, имеют низкую эффективность роста, определяемую как количество клеток, производимых на единицу потребляемого углерода (Haas et al. 2011; Nelson et al. 2013; Silveira et al. 2015). Микробы, растущие на рифах, где преобладают водоросли, смещают свой гликолитический метаболизм с пути Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (EMP) на пути пентозофосфата (PP) и пути Энтнера-Дудорова (ED) (Haas et al.2016). Все три пути потребляют глюкозу в серии окислительно-восстановительных реакций, в результате которых образуется пируват. EMP производит исключительно НАДН в качестве восстановительного потенциала, в то время как PP и ED хранят часть восстановительного потенциала в НАДФН (Klingner et al. 2015; Spaans et al. 2015). Эти два восстановленных кофермента имеют разные судьбы в клетке: НАДН в основном используется для производства АТФ посредством окислительного фосфорилирования, а НАДФН в основном используется для процессов биосинтеза (Fuhrer and Sauer 2009). Поскольку кислород является конечным акцептором электронов при окислительном фосфорилировании, эти пути имеют различные модели потребления O ₂ .Сравнительный термодинамический, кинетический и геномный анализ этих путей демонстрирует, что предпочтительное использование каждого из них отражает фундаментальные термодинамические и экологические ограничения и предсказывает влияние на метаболический бюджет клетки (Flamholz et al. 2013; Stettner and Segrè 2013).

Помимо физиологии первичных продуцентов, динамика органического углерода и кислорода коралловых рифов зависит от биофизических свойств этих организмов и окружающей среды. Мясистый дерн и макроводоросли выделяют в три раза больше DOC на фотосинтетически произведенный O ₂ , чем кальцифицирующие организмы (Naumann et al.2010; Haas et al. 2011; Нельсон и др. 2013; Silveira et al. 2015). Тем не менее, системы с преобладанием водорослей имеют постоянно более низкие концентрации DOC и более экстремальные суточные колебания концентраций O ₂ (Dinsdale et al. 2008; Martinez et al. 2012; Nelson et al. 2013). Мясистые водоросли производят пузырьки O ₂ в результате гетерогенного зародышеобразования в результате перенасыщения O ₂ на поверхности водорослей (Kraines et al. 1996). Газообразный O ₂ в пузырьках не обнаруживается приборами для растворения O ₂ , что приводит к недооценке автотрофности в методах первичной продуктивности на основе кислорода (Аткинсон и Григг 1984; Крайнес и др.1996). В то время как несколько исследований признают образование пузырьков на поверхности водорослей, доля фотосинтетического кислорода, потерянного в виде пузырьков от различных первичных продуцентов бентоса, никогда не оценивалась количественно (Odum and Odum 1955; Freeman et al.2018).

Здесь мы проверяем гипотезу о том, что относительное уменьшение количества акцепторов электронов по сравнению с донорами электронов из-за потери O ₂ в результате кипения отбирает метаболизм гетеротрофных бактерий на деградированных коралловых рифах. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разработали новые эксперименты по инкубации в камере и показали, что мясистые макроводоросли выделяют большее количество фотосинтетического O ₂ путем кипения по сравнению с кораллами.Когда O ₂ выходит из раствора, он больше не используется для биологического дыхания в водной толще, что увеличивает соотношение восстанавливающих и окисляющих эквивалентов. Затем мы количественно оценили физиологические реакции микробов на эти условия и наблюдали увеличение объема клеток и потребления органического углерода на клетку, а также переход к анаболическому метаболизму при инкубации водорослей. Наконец, мы показываем, что паттерны, выявленные в ходе наших инкубаций, наблюдаются in situ , с увеличением бактериальной биомассы и сдвигом в сторону анаболического метаболизма на 87 рифах в Тихом океане и Карибском бассейне.Эти метаболические переходы являются механической основой микробиализации, которая усиливает сокращение коралловых рифов.

Методы

O

Скорость образования растворенного и газообразного O ₂ бентических первичных продуцентов измеряли в двух экспериментах в резервуарах (эксперименты с СОЗ 1 и 2). В обоих экспериментах организмы инкубировались в специально изготовленных камерах, названных бутылями для производства периферического кислорода (POP) (рис. 1). Бутылки для СОЗ представляют собой колоколообразные бутылки из полиэтилентерефталата (ПЭТ) со съемным основанием и двумя портами для отбора проб: одно для отбора проб растворенных аналитов, а другое вверху для отбора проб газа.Первичные продуценты размещались внизу, а пузырьки, выходящие с их поверхностей во время инкубации, накапливались вверху. Первичные продуценты были размещены на дне бутылок для СОЗ внутри большего резервуара, наполненного рифовой водой. Затем контейнер в форме колокола помещали на основание, и бутылку закрывали. В конце инкубации газ, скопившийся в верхней части бутылок, собирали в шприц и записывали объем газа. Газ переносили в контейнер с широким горлышком, и парциальное давление O ₂ измеряли с помощью полярографического зонда (Extech 407510) сразу после сбора.Растворенный O ₂ определяли с помощью зонда Hatch-Lange HQ40 DO.

Производство периферического кислорода (POP) Описаны эксперименты, посвященные метаболизму первичного продуцента, и бутыли для POP, использованные в экспериментах. Параметры роста микробов были проанализированы в эксперименте POP 2 и инкубации в темноте в экспериментах 3 и 4. Микробная биомасса и пути метаболизма углерода были проанализированы в образцах рифовой воды.Конкретные переменные, проанализированные в каждом эксперименте, перечислены под номером эксперимента.

• POP Эксперимент 1: кораллы-склерактинии Montipora sp . и мясистые макроводоросли Chaetomorpha sp . были собраны из резервуаров длительного хранения кораллов и макроводорослей, находящихся в СДСУ. Непосредственно перед экспериментом образцы были собраны из резервуаров и помещены в бутылки для СОЗ. Три образца каждого организма были индивидуально инкубированы в течение 4 дней с искусственной морской водой из кораллового резервуара вместе с тремя контрольными флаконами при 12-часовом световом цикле (кванты 125 мкмоль м ^-2 с ^-1 ) и 12-часовом темноте при температуре 27 ° С.

• POP Эксперимент 2: Были проанализированы четыре бентосных первичных продуцента: кораллы-склерактинии Orbicella faveolata , CCA, мясистые макроводоросли Chaetomorpha sp . И дерновые водоросли. O. faveolata колонии были собраны на глубине 12 м от участка Water Factory (12 ° 10’91 ”с.ш., 68 ° 95’49” ​​з.д.) и разрезаны на фрагменты размером ~ 10 см. ² фрагментов. Фрагменты кораллов хранились в течение двух недель в проточной резервуарной системе исследовательской станции CARMABI. Резервуар подвергался циклам естественного тусклого света с интенсивностью света, сопоставимой с глубиной 10 м, согласно измерениям с помощью подвески HOBO UA-002-64.CCA, дерн и макроводоросли были собраны на CARMABI непосредственно перед экспериментом. Было проведено пять индивидуальных инкубаций для каждого организма. Площадь поверхности организмов указана в дополнительном наборе данных 1. Инкубация длилась 2 дня при 24 ° C с циклами естественного света.

Рост бактерий на экссудатах первичных продуцентов

Данные о росте бактерий, включая изменения численности, размера клеток и общей микробной биомассы, получены в трех независимых экспериментах: эксперимент 2 с СОЗ, эксперименты 3 и 4 (рис. 1).Подробная информация о каждом из этих наборов данных приведена ниже:

• POP Эксперимент 2: В начале и в конце инкубации (время 0 и 48 часов) были собраны образцы объемом 1 мл и проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии в соответствии с McDole et al. 2012. Вкратце, объем клеток рассчитывали, рассматривая все клетки как цилиндры с полусферическими крышками, и индивидуальные объемы микробных клеток были преобразованы в массу во влажном и сухом весе с использованием ранее установленных зависимостей от размера для морских микробных сообществ (Саймон и Азам, 1989).Различия в численности клеток, объеме клеток и общей микробной биомассе рассчитывали по разнице между конечными и начальными значениями.

• Эксперимент 3: пять экземпляров коралла Favia sp . были получены из резервуара длительного хранения в Гавайском институте морской биологии (HIMB) и помещены в независимые 5-литровые поликарбонатные контейнеры, заполненные морской водой, отфильтрованной 0,2 мкм. Пять экземпляров мясистой макроводоросли Gracilaria sp . были собраны с HIMB и помещены в независимые 5-литровые контейнеры.Дополнительные контрольные контейнеры были заполнены фильтрованной морской водой. Первичные продуценты инкубировали в условиях естественного освещения в течение 8 часов для выделения экссудата. В конце инкубации 2 л морской воды, содержащей экссудаты, фильтровали с размером пор 0,2 мкм и инокулировали 1 л нефильтрованной морской воды, содержащей сообщества рифовых микробов. Все флаконы инкубировали в течение 24 часов в темноте. Для определения численности микробов и биомассы образцы объемом 1 мл были собраны и проанализированы, как описано выше.Различия в численности клеток, объеме клеток и общей гетеротрофной микробной биомассе рассчитывали по разнице между конечными и начальными значениями.

• Эксперимент 4: Этот эксперимент по инкубации в темноте проводился в 2010 году в Мо’ореи, Французская Полинезия. Данные были впервые опубликованы в Haas et al. 2011 г. и был повторно проанализирован здесь, чтобы исследовать потребление углерода клетками и O ₂ . Вкратце, экссудаты кораллов и водорослей, выпущенные во время легкого инкубационного периода, были равны 0.Отфильтровано 2 мкм и засеяно рифовыми микробами. Посев в фильтрованную морскую воду использовали в качестве контроля. Все флаконы выдерживали в темноте 48 часов. DOC, растворенный O ₂ и численность микробов измеряли в начале и в конце каждой инкубации в темноте, как описано выше. Образцы DOC фильтровали через предварительно сожженные фильтры GF / F (Whatman, номинальное удерживание частиц 0,7 мкм) и переносили во флаконы из HDPE, промытые кислотой. Образцы хранили замороженными до анализа согласно Carlson et al.2010 (Карлсон и др., 2010). Нормы потребления DOC и O ₂ , нормализованные по выходу бактериальных клеток в конце каждого эксперимента, привели к специфическому для клетки углероду и потребностям O ₂ . Мясистые организмы, использованные в этом эксперименте, представляли собой дерновые водоросли и макроводоросли Turbinaria ornata и Amansia rhodantha , а кальцифицирующими организмами были CCA и кораллы Porites lobata .

Центральные пути метаболизма углерода

Микробные метагеномы были секвенированы из проб воды, собранных на коралловых рифах в Тихом океане и Карибском бассейне.Пробы из Тихого океана были собраны во время круизов NOAA RAMP в 2012–2014 годах на Гавайские острова, острова Лайн, Американское Самоа и острова Феникс. Карибские пробы были собраны вокруг острова Кюрасао во время экспедиции Института Уэйтта «Голубой ореол» в 2015 году. Географические координаты для каждого участка отбора проб представлены в дополнительном наборе данных 5 вместе с данными о бентическом покрове. На каждом участке отбора проб аквалангисты собирали воду с расстояния не более 30 см от поверхности рифа, используя бутылки Hatay-Niskin (Haas et al.2014а). Образцы доставили на корабль, профильтровали через цилиндрический фильтр 0,22 мкм в течение 4 часов и хранили при -20 ° C до лабораторной обработки. ДНК экстрагировали из фильтров с помощью наборов Nucleospin Tissue Extraction (Macherey Nagel, Германия) и секвенировали на платформе Illumina HiSeq (Illumina, США). Описанные здесь тихоокеанские микробные метагеномы были ранее проанализированы на предмет наличия элементов CRISPR, компетентных генов и разнообразия Шеннона в Knowles, Silveira et al. 2016.Исходные файлы fastq из метагеномов Pacific и Curaçao были отфильтрованы по качеству в BBTools с показателем качества> 20, удалением дубликатов, минимальной длиной 60 оснований и энтропией 0,7 (Bushnell 2014). Метагеномы доступны в Кратком архиве чтения NCBI (PRJNA494971). Относительное количество генов, кодирующих ограничивающие скорость ферменты в центральных путях метаболизма углерода, использовалось в качестве заместителя для представления этого пути в сообществе. Список анализируемых путей и ферментов представлен в дополнительной таблице 1.Фермент-специфические базы данных были построены с использованием аминокислотных последовательностей из NCBI бактериального RefSeq. Поиски BLASTx выполнялись с использованием метагеномных считываний для каждой базы данных ферментов, используя минимальную длину выравнивания 40, минимальную идентичность 60% и значение е <10 ^-5 . Сопоставление считываний с базой данных было нормализовано по общему количеству считываний высокого качества, что привело к процентному содержанию каждого фермента. Относительное количество генов представлено как дополнительный набор данных 5. Обилие бактериальных родов в метагеномах было получено с помощью профилей k-mer с использованием FOCUS2 (Silva et al.2016).

Статистические тесты

Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения R. Переменные отклика из экспериментов по инкубации были проверены на нормальность с использованием теста Шапиро-Уилка. Из-за отсутствия нормальности (Шапиро-Уилк, p <0,05) непараметрический критерий Краскела-Уоллиса использовался для проверки наличия различий в лечении с последующим апостериорным тестом Вилкоксона с поправкой на коэффициент ложного обнаружения (FDR) с помощью порог значимости p <0,05.Поскольку производство газообразного O ₂ и доля общего O ₂ в форме газа существенно не различались между экспериментами с СОЗ 1 и 2 (Краскал-Уоллис, p> 0,05), мы объединили результаты обоих экспериментов в последующих тестах. . Для анализа данных in situ микробная биомасса была преобразована в логарифмическом масштабе, чтобы соответствовать предположению о нормальности для проверки значимости наклона в линейной регрессии покрова мясистых водорослей на микробной биомассе. Взаимосвязь между покровом мясистых водорослей и обилием ферментов или таксономическими профилями анализировалась методом статистического обучения контролируемых случайных лесов.Значимость важности переменной случайных лесов определялась методом перестановки, применяемым к контролируемым случайным лесам с использованием пакета R rfPermute.

Результаты

Треть фотосинтеза водорослей O

Мы разработали новые инкубационные камеры, названные бутылями для производства периферического кислорода (POP), для количественного определения растворенного и газообразного O ₂ , выделяемого первичными продуцентами коралловых рифов ( Фигура 1). Продукция растворенного O ₂ значительно различалась среди обработок первичных продуцентов (рис. 2A, Kruskal-Wallis χ ² (4) = 19.5, p <0,05, дополнительный набор данных 1). Первичные продуценты показали более высокую продукцию растворенного O ₂ по сравнению с контролем (Wilcoxon p <0,05 для всех парных сравнений с поправкой на FDR с контролем). Продукция растворенного O ₂ сильно варьировала и существенно не различалась между мясистыми и кальцифицирующими организмами (5,99 ± 2,29 и 6,33 ± 2,20 мкмоль см ^-2 день ^-1 для мясистых и кальцифицирующих, соответственно, среднее значение ± стандартная ошибка); Wilcoxon p > 0,05). Газообразное образование O ₂ наблюдалось в большинстве бутылей первичного производителя, в то время как газ не наблюдался в контрольных бутылях (Рисунок 2B, Kruskal-Wallis χ ² (4) = 30.2, p <0,05, Wilcoxon p <0,05 для всех парных сравнений с контролем). Объединенные мясистые организмы продуцировали значительно больше газообразного O ₂ , чем кальцифицирующие (0,42 ± 0,35 и 2,33 ± 1,35 мкмоль см ^-2 день ^-1 для кальцинирования и мясистые, соответственно, среднее значение ± стандартная ошибка; Уилкоксон p <0,05). Мясистые макроводоросли имели самую высокую долю общего фотосинтетического O ₂ (сумма растворенного и газообразного O ₂ ), выпущенного в виде газа (37,33 ± 8,34%), за ними следовали дерновые водоросли (13.78 ± 1,33%), CCA (10,19 ± 2,88%) и кораллы (5,00 ± 5,55%) (рис. 2C). Разница во фракции O ₂ в виде газа была значимой при разных вариантах лечения (Kruskal-Wallis χ ² (4) = 29,2, p <0,05) и выше у мясистых организмов (Kruskal-Wallis χ ² (2) = 26,3, p <0,05; по Вилкоксону p <0,05 для мясистых и кальцифицирующих).

A) Растворенный O ₂ скорости продукции, нормализованные по площади поверхности организма.B) Газообразный O ₂ , нормализованные по площади поверхности организма. C) Доля общего фотосинтетического образования O ₂ в виде газа. Сплошные квадраты соответствуют эксперименту 1, а треугольники — эксперименту 2. Первичный продуцент оказал значительное влияние на все три переменные (Краскела-Уоллиса p <0,05), а буквы над прямоугольниками указывают на p <0,05 для парных тестов Вилкоксона с поправкой на FDR. Оранжевый указывает на кальцифицирующие и зеленые мясистые организмы.

Бактерии накапливают больше углерода при высоком DOC: O

Во время экспериментов с СОЗ изменение численности бактерий в бутылях с первичными продуцентами было выше по сравнению с контрольными (рис. 3A, Kruskal-Wallis χ ² (4) = 20 .6, p <0,05, Wilcoxon p <0,05 для всех парных сравнений с контролем, дополнительный набор данных 2). Изменение численности было выше при обработке мясистыми водорослями по сравнению с обработками кальцинированием (Kruskal-Wallis χ ² (2) = 16,4, p <0,05, Wilcoxon p <0,05 для попарного сравнения мясистых водорослей с кальцификацией). Объем микробных клеток изменялся по-разному при обработке во время инкубации (Рисунок 3B, Kruskal-Wallis x ² (5) = 1235,2, p <0,05, дополнительный набор данных 3).Бактерии, растущие в контрольных флаконах, не показали изменения объема (Wilcoxon, p> 0,05 для попарного сравнения контроля и T0h). При росте на экссудатах кораллов и ОСА бактерии становились меньше, в то время как рост на дерне и экссудатах макроводорослей приводил к увеличению объема бактериальных клеток (p <0,05 Вилкоксона для всех парных сравнений с T0h и с контролем). Если принять во внимание численность и объем клеток, изменение общей бактериальной биомассы значительно различается между обработками (рис. 3C, Kruskal-Wallis χ ² (4) = 21.6, p <0,05, дополнительный набор данных 2). Экссудаты кораллов уменьшили общую бактериальную биомассу, в то время как дерновина и макроводоросли увеличили общую бактериальную биомассу, а CCA не привели к изменениям (Вилкоксон, p <0,05 для попарного сравнения кораллов, дерна и макроводорослей с контролем). Изменение биомассы у двух мясистых водорослей вместе было больше, чем у кальцифицирующих организмов вместе (Kruskal-Wallis χ ² (2) = 16,6, p <0,05; Wilcoxon, p <0,05 для попарного сравнения мясистых и кальцифицирующих организмов).

A) Изменения численности микробов, нормированные на площадь поверхности первичного продуцента. Б) Распределение объема клеток. C) Изменения общей микробной биомассы с учетом численности и объема клеток, нормализованные по площади поверхности первичного продуцента. Обработка первичных продуцентов оказала значимое влияние на все три микробные переменные (Краскела-Уоллиса p <0,05), и буквы над квадратами указывают на p <0,05 для парных тестов Вилкоксона с поправкой на FDR.Оранжевый указывает на кальцифицирующие и зеленые мясистые организмы.

Инкубация в бутылке, проведенная в Гавайском институте морской биологии (HIMB) с отдельным набором первичных продуцентов, показала ту же картину в физиологии микробов (эксперимент 3, дополнительные наборы данных 2 и 3). После 24 часов инкубации в темноте с экссудатами, но в отсутствие первичного продуцента, численность микробов увеличивалась как при обработке кораллов, так и при обработке водорослей (Рисунок S1A, Kruskal-Wallis χ ² (2) = 7,2, p <0.05). Изменения в объеме клеток не были значимыми при лечении (Рисунок S1B, Kruskal-Wallis χ ² (2) = 3,8, p> 0,05). Однако результирующее изменение общей микробной биомассы при учете объема и численности клеток показало увеличение биомассы при обработке макроводорослей, в то время как обработка кораллов не изменилась, а контрольные значения биомассы уменьшились (Kruskal-Wallis χ ² (2) = 7,2, р <0,05).

Бактерии разделяют DOC и O

Специфичное для клеток потребление углерода и O ₂ потребление гетеротрофным метаболизмом было получено путем нормализации изменения концентраций DOC и O ₂ по выходу клеток в темноте инкубации (эксперимент 4 на рисунке 1, дополнительный набор данных 4).Количество DOC, потребляемого на клетку, было выше при обработке мясистых макроводорослей по сравнению с обработкой кораллов и контрольной обработкой (т. Е. Низкий выход клеток на израсходованный углерод, рис. 4A, Краскал-Уоллис χ ² (2) = 13,7, p <0,05; Wilcoxon , p <0,05 для попарного сравнения макроводорослей с контролем и с кораллами). Количество O ₂ , потребляемое на клетку, не различалось между обработками (рис. 4B, Kruskal-Wallis χ ² (2) = 0,5, p> 0,05).

Клеточно-специфический углерод и O ₂ данные о потреблении из эксперимента 4: инкубация микробных сообществ в темноте в экссудатах первичных продуцентов. A) Потребление DOC в зависимости от ячейки. B) Потребление O ₂ в зависимости от ячейки. Обработка первичных продуцентов оказала значимое влияние только на удельное потребление DOC (Краскела-Уоллиса p <0,05), а буквы над квадратами указывают на p <0,05 для парных тестов Вилкоксона с поправкой на FDR. Оранжевый указывает на кальцифицирующие и зеленые мясистые организмы.

Варбург-подобный метаболизм вызывает накопление бактериальной биомассы

Относительное количество генов, кодирующих ограничивающие скорость ферменты центральных путей метаболизма углерода, было количественно определено в микробных метагеномах рифов через градиент водорослевого покрова (дополнительный набор данных 5). В этом наборе данных микробная биомасса водяного столба увеличивалась с покровом мясистых водорослей (линейная регрессия, p <0,05, m = 0,009, R ² = 0,29 для сравнения между log10-преобразованной биомассой и покровом мясистых водорослей).Случайный анализ леса с генами, кодирующими ограничивающие скорость ферменты центрального углеродного метаболизма, объяснил 14,3% мясистого покрова водорослей. Гены с самой высокой объясняющей способностью были фосфоенолпируваткарбоксилаза, аспартатаминотрансфераза, оксоглутаратдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и KDPG альдолаза (среднеквадратичная ошибка увеличивалась на 15,78, 9,73, 9,21, 8,70 и 6,95% соответственно). Взаимосвязь между этими ферментами и покровом мясистых водорослей показана на рисунке 5.

Относительное содержание генов, кодирующих ограничивающие скорость ферменты в метагеномах рифов, нанесено на график по отношению к покрову мясистых водорослей (сумма мясистого дерна и макроводорослей). Индивидуальные метагеномы перечислены в виде рядов и отсортированы по покрову мясистых водорослей в диапазоне от 15 до 94,1%. Обилие ферментов масштабировали по колонке, чтобы можно было проводить сравнения между ферментами.Показаны только ферменты, достоверно предсказывающие покров мясистых водорослей в случайном анализе леса. Полный список ферментов и их распространенность представлен в качестве дополнительных данных 5.

Фосфоенолпируваткарбоксилаза и аспартатаминотрансфераза участвуют в анаплеротических реакциях, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа отводит глюкозу как по Энтнер-Дудорову, так и по пентозофосфатным путям, а KDPG является уникальным для всех путей путь Энтнера-Дудорова. Эти четыре фермента имели положительную взаимосвязь с покровом мясистых водорослей (случайное среднее уменьшение точности по лесам, p <0.05). Оксоглутаратдегидрогеназа представляет собой окислительный фермент в цикле Кребса, и его относительная численность снижается с ростом мясистых водорослей (точность уменьшения среднего случайного значения по лесам, p <0,05).

Чтобы проверить, можно ли объяснить эти изменения в относительной численности генов таксономическим доминированием бактериальных родов, кодирующих эти гены, мы проверили взаимосвязь между покровом мясистых водорослей и таксономическими профилями на уровне родов с использованием случайного леса. Несмотря на то, что несколько таксономических групп изменили свою численность по мере увеличения покрытия мясистых водорослей, ни одна из этих групп не имеет стабильного дефицита или кодирования ферментов центральных углеродных путей, описанных здесь, с высокой вариабельностью на уровне штаммов в их функциональном генетическом репертуаре (дополнительный набор данных 5 показывает относительную численность родов со значимой взаимосвязью с покровом мясистых водорослей в случайном лесу означает уменьшение точности, p <0.05).

Обсуждение

O

При фотосинтезе и дыхании теоретически молярное соотношение углерода и O ₂ составляет 1: 1 (Уильямс и др., 1979). У голобионтов с большим гетеротрофным компонентом, таких как кораллы, дыхание потребляет не менее 50% кислорода и органического углерода, производимого в процессе фотосинтеза (Tremblay et al., 2016). Коэффициенты дыхания симбиотических книдарийцев варьируются от 0.8 и 0,9, потребляя больше O ₂ , чем углерода (Muscatine et al. 1981). Основываясь на этих процессах, более высокие соотношения DOC: O ₂ , наблюдаемые в экссудатах мясистых водорослей по сравнению с кораллами, противоречат интуиции (Haas et al. 2011). O ₂ вскипание является правдоподобным объяснением этого наблюдения. Органический углерод, выделяемый водорослями, остается в растворе, в то время как часть O ₂ зарождается и улетучивается, оставляя высокое соотношение DOC: растворенный O ₂ . Дифференциальное распределение углерода в биомассе также может изменить эти соотношения, и количественный анализ включения углерода в сочетании с динамикой растворенного и газообразного O ₂ является следующим шагом к решению этих балансов.

O ₂ закипание и закачивание пузырьков с помощью гидродинамики признается источником ошибок при оценке добычи в мелководных экосистемах, однако степень, в которой кипение влияет на эти оценки, редко определяется количественно из-за методологических проблем (Kraines et al. 1996; Cheng et al.2014). O ₂ вскипание, наблюдаемое в этом исследовании, соответствовало 5 — 37% чистой первичной продукции и объясняло потерю до 21 и 37% фотосинтетически произведенного O ₂ в солончаке и озере, соответственно (Koschorreck et al. al.2017; Howard et al. 2018). Если in situ скорость зарождения и подъема пузырьков сравнима с таковыми при инкубации, наши результаты означают, что первичная продукция коралловых рифов была значительно недооценена (Howard et al. 2018). В коралловых рифах пузыри наблюдались на поверхности дерновых водорослей, на отложениях и внутри коралловых скелетов, колонизированных эндолитическими водорослями (Odum and Odum 1955; Bellamy and Risk 1982; Clavier et al. 2008; Freeman et al. 2018). Неоднородное распределение зарождения пузырьков по первичным продуцентам приводит к тому, что сдвиги состава бентосных сообществ определяют величину вскипания O ₂ при динамике O ₂ на уровне рифа.Для установления таких взаимосвязей требуется сочетание инкубации на месте и исследований газообмена.

Эффект Варбурга — это биофизический механизм микробиализации.

Высокий коэффициент высвобождения DOC: O ₂ водорослями отражает бактериальный метаболизм углерода и кислорода. При выращивании на водорослевом экссудате микробы увеличивали объем клеток и потребление DOC на клетку (рис. 3 и 4А). Эти клетки показали такое же специфичное для клеток потребление O ₂ по сравнению с небольшими клетками, растущими на коралловых экссудатах (рис. 4B).Эти результаты показали, что микробы, растущие на коралловых экссудатах, полностью окисляют потребляемый органический углерод, направляя метаболическую энергию на расходы на содержание (Russell and Cook 1995). В водорослевом экссудате бактерии имели более высокое потребление DOC, специфичное для клеток, с большей долей органического углерода, направленной на биосинтез (неполное окисление), и меньшим относительным потреблением O ₂ , что привело к увеличению биомассы сообщества. Этот процесс классически описывается как эффект Варбурга в эукариотических клетках, подвергающихся быстрому метаболизму и ограниченный каталитической скоростью фермента, а не концентрацией субстрата (Vander Heiden et al.2009 г.). У бактерий эффект Варбурга — это физиологический ответ, который оптимизирует энергетический биогенез и синтез биомассы перед изменяющимися протеомными требованиями (Basan et al. 2015). Этот биохимический переход происходит потому, что протеомные затраты энергии биогенеза при дыхании превышают затраты на ферментацию.

Разделение между специфическим углеродом бактерий и потреблением O ₂ , наблюдаемое на рисунке 4, предсказывает увеличение путей, которые отводят углерод на биосинтез, и неполное окисление, когда бактерии растут на водорослевых экссудатах (Russell and Cook 1995; Haas et al.2016). Пути пентозофосфата (PP) и Entner-Doudoroff (ED) являются альтернативой каноническому гликолитическому пути потребления углеводов (Embden-Meyerhoff-Parnas, EMP). И PP, и ED производят больше НАДФН, чем НАДН. Эти два восстановленных кофермента имеют разные функции: NADPH предпочтительно потребляется путями биосинтеза для синтеза липидов, аминокислот и нуклеотидов, тогда как NADH предпочтительно потребляется при окислительном фосфорилировании для производства АТФ (Pollak et al.2007; Spaans et al.2015). Следовательно, клетки, использующие больше путей НАДН, будут потреблять больше O ₂ по сравнению с углеродом по сравнению с клетками, использующими больше НАДФН. Наши метагеномные данные соответствуют этому прогнозу. Обилие генов, кодирующих глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и KDPG альдолазу, увеличивалось с покровом мясистых водорослей (рис. 5). Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа отклоняет глюкозу как по пути PP, так и по пути ED, а альдолаза KDPG уникальна для ED.

Цикл трикарбоновой кислоты (TCA или цикл Кребса) является канонически окислительным путем для полного декарбоксилирования пирувата.Но цикл TCA может работать как биосинтетический путь, предоставляя промежуточные продукты для синтеза аминокислот, азотистых оснований и жирных кислот (Sauer and Eikmanns 2005; Cronan and Laporte 2013). Стехиометрия цикла TCA поддерживается за счет пополнения запасов этих промежуточных продуктов за счет анаплеротических реакций с использованием пирувата (или фосфоенолпирувата) (Owen et al. 2002). Здесь мы обнаружили увеличение количества генов, кодирующих анаплеротические ферменты, и уменьшение количества генов, кодирующих оксоглутаратдегидрогеназу, катализирующих окислительное декарбоксилирование в цикле Кребса с увеличением водорослевого покрова.Эти результаты указывают на сдвиг в сторону использования цикла Кребса в качестве анаболического пути (Sauer and Eikmanns 2005; Bott 2007). Анаплеротическая активность увеличивается у быстрорастущих бактерий с высокой скоростью синтеза аминокислот (Bott 2007). Эти пути направляют органический углерод в накопление биомассы, в отличие от окисления с переносом электронов на O ₂ (Russell and Cook 1995). Это согласуется с моделями роста бактерий и потребления DOC, наблюдаемыми в наших экспериментах по инкубации.

Альтернативные гипотезы для DOC и O ₂ моделей потребления — это прерванные цикла TCA и детоксикация реактивных форм кислорода (ROS) (Mailloux et al.2007; Steinhauser et al. 2012). В нашем наборе данных не было доказательств увеличения количества генов, кодирующих эти пути (дополнительные данные 5). Наблюдаемые метагеномные переходы не могут быть объяснены появлением или исчезновением определенных таксономических групп, связанных с микробиализацией, таких как Vibrio, Flavobacteria и SAR11 (Dinsdale et al. 2008; Kelly et al. 2014). Гены, кодирующие обсуждаемые здесь пути, не всегда кодируются этими таксономическими группами, и наблюдаемые здесь функциональные геномные переходы, вероятно, являются результатом композиционных сдвигов на уровне штамма, не связанных напрямую с таксономической структурой сообщества на уровне рода или семьи, поскольку часто случается с коралловыми рифами (Klingner et al.2015; Silveira et al. 2017b).

O

O ₂ истощение, наблюдаемое в предыдущих инкубациях в темноте с экссудатом водорослей, было результатом высокой плотности бактерий, а не высокой скорости клеточно-специфического дыхания (Haas et al., 2016) . Изменения объема и численности клеток, наблюдаемые в наших экспериментах, объясняют микробной биомассы in situ (McDole et al. 2012; Haas et al. 2016). В деградированных рифах мясистые водоросли выделяют больше экссудата, чем кораллы, в корне изменяя биогеохимическую среду для гетеротрофного метаболизма (рис. 6).Последующее увеличение размеров бактерий, их численности и потребления DOC, описанное в наших инкубациях, приводит к тому, что бактериальные потребности в энергии превосходят потребности макробов, и объясняют наблюдаемое снижение постоянных запасов DOC в деградированных рифах (McDole et al. 2012; Haas et al. 2016; Somera и др., 2016). Увеличение избыточного метаболизма из-за разделения между анаболическими и катаболическими реакциями согласуется с большим количеством твердых частиц, наблюдаемых в рифах с преобладанием водорослей, влияющих на трофические взаимодействия в масштабе рифа (Russell and Cook 1995; Wilson et al.2003; Деат и Фабрициус 2010; Silveira et al. 2015; Haas et al. 2016). Метаболическое разделение, описанное здесь, вероятно, также будет происходить в планктонных океанических системах в ответ на глобальные изменения: более теплые, высокие pCO ₂ воды, обедненные питательными веществами из-за стратификации, изменяют состав сообщества первичных продуцентов, увеличивая выделение богатых углеродом экссудатов фитопланктоном. при уменьшении O ₂ (Boyd et al. 2010; Oschlies et al. 2018). Метаболизм пелагических гетеротрофных бактерий демонстрирует положительную взаимосвязь между плотностью энергии субстрата и временем оборота, без какой-либо связи с частотой дыхания (Casey et al.2015). Эта закономерность согласуется с описанными здесь метаболическими сдвигами, снижающими скорость оборота микробной биомассы в океанах (Vallino et al. 1996).

Экссудаты мясистых водорослей имеют более высокое соотношение DOC: O ₂ по сравнению с кораллами. Гетеротрофные бактерии реагируют на это различие, отделяя потребление органического углерода от окисления: более высокое потребление DOC на клетку без увеличения потребления O ₂ на клетку. Это метаболическое изменение приводит к накоплению микробной биомассы.

Заключение

Кипение вызывает разделение между фотосинтетическим фиксированным углеродом и O ₂ в мясистых макроводорослях. Потеря O ₂ в результате вскипания коренным образом меняет биогеохимическую среду рифов. Напротив, потери O ₂ из-за кипения, связанные с кораллами, практически отсутствуют, поскольку зооксантеллы находятся в тканях животного. На рифах с большим количеством мясистых макроводорослей в микробном сообществе преобладает анаболический метаболизм с соответствующим увеличением объема клеток, их численности и специфических путей потребления DOC.Эти физиологические изменения вызывают накопление микробной биомассы, что пагубно сказывается на здоровье кораллов и их трофических отношениях.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим команду и капитана корабля NOAA Hi’ialakai и корабль Plan B Института Уэйтта, которые внесли свой вклад в отбор проб. Мы благодарим команды CARMABI и HIMB за поддержку в проведении полевых экспериментов. Мы благодарим Роберта Эдвардса из SDSU за доступ к компьютерным серверам, финансируемым NSF (CNS-1305112 Роберту А.Эдвардс). Эта работа финансировалась Фондом Гордона и Бетти Мур (грант 3781 FR), Фондом Спруанса, NOAA и Институтом Уэйтта. CBS финансировалась CNPq (234702 для CBS) и Spruance Foundation. TNFR поддерживался NSF (от G00009988 до TNFR).

Сноски

• Заявление об авторстве : CBS, BR, LWK, MH, MV, YT, AH и FR разработали эксперименты и выборки; CBS, TR, HV, BR, ERP, AL, MV и AH проводили эксперименты; CBS, TR, AB, TL и SM генерировали микроскопические и метагеномные данные; CBS и BB провели статистический анализ; CS написал рукопись, и все авторы внесли существенный вклад в ее исправления.

• Заявление о доступности данных Экспериментальные данные представлены в виде вспомогательных наборов данных и в FigShare (https://doi.