Лечение системной красной волчанки в клинике ЕМС в Москве

Рассказывает Евгений Жиляев, 

профессор, д.м.н., врач высшей категории.

Это классическая аутоиммунная болезнь, в основе которой лежит наследственный дефект иммунной системы, предположительно касающийся врожденного иммунитета (неспецифической защиты). Для болезни характерно появление разнообразных аутоантител, направленных против собственных белков и клеток организма. Заболевание поражает различные органы и системы: кожу, опорно-двигательный аппарат,  внутренние органы, очень часто наблюдаются изменения в крови. Частое осложнение системной красной волчанки — антифосфолипидный синдром, который проявляется образованием тромбов. Для заболевания характерна очень высокая чувствительность к различного рода инфекциям.

Изначально системную красную волчанку ошибочно считали кожным заболеванием. Общепринятое международное название заболевания — Lupus (в пер. с лат. — волк), название обусловлено тем, что проявления на коже похожи на последствия укуса волка.

Однако симптомы системной красной волчанки схожи с симптоматикой многих других заболеваний, что вызывает затруднения при постановке диагноза. Например, туберкулез кожи и саркоидоз имеют схожую симптоматику.

Доказано, что восполнение недостатка витамина D в некоторых случаях позволяет снизить риск развития волчанки у пациентов с отягощенной наследственностью и выявленными характерными аутоантителами.

Симптомы системной красной волчанки

В связи с тем, что заболевание поражает все органы и системы, его проявления могут быть очень разнообразны. Наиболее характерны высыпания на лице в форме бабочки. При появлении такого рода изменений рекомендуется незамедлительно обратиться к врачу.

Другие возможные симптомы системной красной волчанки:

• длительное повышение температуры,
• непереносимость солнечного света, — выраженная слабость или повышение температуры после пребывания на солнце,
• боли в мышцах,
• увеличение лимфатических узлов – лимфаденопатия.

При волчанке могут появляться боли в суставах, может развиться артрит. Возможны изменения в клеточном составе крови. Часто к ревматологу пациентов направляет гематолог после выявления анемии, панцитопении или тромбоцитопении.

Одни из наиболее серьезных проявлений системной красной волчанки — нефрит, поражение почек, изменения в анализах мочи. Даже боли в груди могут оказаться проявлением волчанки. Эпилептические припадки также могут быть одним из первых проявлений системной волчанки.

Диагностика системной красной волчанки

Основные методы – клинический осмотр и лабораторная диагностика. Дополнительно используются инструментальные методы: компьютерная томография, в частности, позволяет подтвердить наличие плеврита, эхокардиография – перикардита или эндокардита, магнитно-резонансная томография часто используется для уточнения характера поражения головного и спинного мозга у пациентов с волчанкой.

Лабораторная диагностика незаменима при выявлении системной красной волчанки. Для подтверждения диагноза проводится целый ряд исследований на аутоантитела. Их проведение имеет критически важное значение. Активность волчанки также во многом измеряется благодаря лабораторным исследованиям.

Лабораторно оцениваются обычно: антинуклеарный фактор, антитела к двухспиральной ДНК, антитела к антигенам SS-A. Выявляется также целый ряд других аутоантител, которые специфичны для волчанки.

Лечение системной красной волчанки

Современные протоколы лечения системной красной волчанки претерпели значительные изменения. До настоящего времени считалось, что основа лечения волчанки — это гормоны. На сегодняшний день основа лечения волчанки — витамин D и гидроксихлорохин. Противовоспалительные (глюкококортикоидные) гормоны приходится использовать в большинстве случаев активной волчанки, но они требуются далеко не всем пациентам и во многих случаях могут быть отменены при достижении устойчивой ремиссии.

При поражении почек и центральной нервной системы используются иммуносупрессоры (препараты, угнетающие иммунитет) и цитостатические препараты (препараты, которые нарушают процессы роста, развития и деления всех клеток организма, тем самым вызывая их гибель). При волчаночном нефрите нередко применяется препарат азатиоприн (иммуносупрессор). В случаях, когда болезнь протекает с повышенным тромбообразованием, используются антикоагулянты (препараты, препятствующие образованию тромбов).

Для лечения системной красной волчанки в отдельных случаях используются генно-инженерные препараты.

Благодаря современным технологиям появилась возможность достигать многолетней ремиссии, в разы повысилась эффективность лечения волчанки.

Преимущества Европейского медицинского центра в лечении системной красной волчанки

• Мультидисциплинарный подход к ведению пациентов: в лечении участвуют врачи различных специальностей (ревматологи, нефрологи, терапевты, врачи лучевой диагностики и др.).
• Все ревматологи ЕМС обладают значительным опытом диагностики и лечения пациентов с волчанкой и используют протоколы, эффективность которых доказана многочисленными исследованиями. В команде ревматологов ЕМС – профессор Евгений Валерьевич Жиляев.
• Круглосуточная экстренная и неотложная помощь, полный спектр необходимых диагностических обследований.
• Результаты исследований доступны пациентам в кратчайшие сроки.

Евгений Жиляев 

Чем опасна волчанка, которую нашли у Юлии Началовой

Одной из болезней, которые, по данным СМИ, привели к смерти певицы Юлии Началовой, стала системная красная волчанка. Что это за заболевание и чем оно опасно, разобралась «Газета.Ru».

16 марта умерла певица Юлия Началова. По данным СМИ, одной из болезней, ставших причиной ее смерти, стала системная красная волчанка.

Системная красная волчанка — это хроническое аутоиммунное заболевание соединительной ткани и сосудов. При нем антитела, вырабатываемые иммунной системой, повреждают здоровые клетки. Название болезнь получила из-за своего характерного признака — сыпи на переносице и щеках, которая, как считали в Средневековье, напоминает места волчьих укусов.

Впрочем, сыпь появляется лишь у 30-50% пациентов, а дерматологические проявления в целом — примерно в 65% случаев. На руках и туловище могут появиться толстые красные чешуйчатые пятна, в последующем способные привести к атрофии кожи, также среди возможных проявлений болезни — язвы на слизистой рта и влагалища, трофические язвы.

Многие пациенты жалуются на боли в суставах, в основном запястий и мелких суставов рук.

Болезнь способна приводить к деформации суставов, в 20% случаев изменения носят необратимый характер.

Болезнь поражает легкие, вызывая пневмонию и плеврит, сердечно-сосудистая система страдает от перикардита, миокардита, эндокардита Либмана-Сакса (воспалительных заболеваний различных частей сердца). Также у больных волчанкой чаще и быстрее развивается атеросклероз. При поражении желудочно-кишечного тракта выявляются стоматит, расширение пищевода, поражение печени, ишемия стенки желудка. Также при волчанке нередко встречается нефрит — воспалительное заболевание почек.

Возможны поражения нервной системы — двигательные расстройства, головные боли, менингит, судорожные расстройства. Одно из самых опасных неврологических проявлений волчанки — демиелинизирующий синдром, при котором разрушается оболочка нервных клеток. Это приводит к ухудшению проводимости сигналов в пострадавших нервах. В зависимости от локализации, синдром способен вызвать целый спектр осложнений, от дрожи и нарушения координации движений до слепоты и паралича.

Из неспецифических симптомов больных беспокоят необоснованные подъемы температуры, слабость, головные боли, боли в мышцах, быстрая утомляемость.

Волчанка влияет на продолжительность жизни.

Выживаемость через 10 лет после постановки диагноза — 80%, через 20 лет — 60%.

Основные причины смерти — нефрит и неврологические проявления болезни, а также инфекции, развившиеся на фоне основного заболевания. Есть случаи выживаемости 25—30 лет.

Вылечить волчанку нельзя, однако возможно облегчить ее симптомы. Для этого используются глюкокортикостероиды, терапия стволовыми клетками, иммуннодепресанты. При осложнениях применяется симптоматическое лечение.

Отметим, что врач Юлии Началовой опровергает наличие у нее красной волчанки.

Тем не менее, от этого заболевания страдают и за рубежом — в частности, певицы Леди Гага, Тони Брэкстон, Селена Гомес. Последняя из-за болезни пережила пересадку почки, орган ей пожертвовала подруга, актриса Франсия Райса.

Болеющие волчанкой матери рожают детей, страдающих аутизмом, в два раза чаще, чем остальные женщины,

выяснили американские ученые из нью-йоркского госпиталя Маунт-Синай.

К подобным выводам они пришли по итогам исследования, участницами которого стали 509 женщин с волчанкой и их 719 детей, а также 5900 женщин без волчанки и их 8500 детей.

В то же время развитие аутизма у ребенка ученые связывают со временем зачатия. По их мнению, оно не должно происходить в моменты активного проявления болезни.

Ранее был идентифицирован ген

, влияющий на осложнения при заболевании волчанкой. Оказалось, что неактивный белок ABIN1 не просто делает организм человек беззащитным перед болезнью, но и способствует деактивации путей, препятствующих воспалительному процессу.

Кроме того, ученым удалось связать функционирование этого белка с последующим влиянием на транскрипционный фактор NF-?B, что в будущем позволит эффективно бороться с заболеванием.

Российские же ученые разработали прототип принципиально нового лекарства для лечения аутоиммунных заболеваний, в том числе и волчанки.

Они смогли «отключить» способность белка TNF повышать риск развития тяжелых заболеваний, сохранив его способность бороться с опухолями и защищать от туберкулеза. В экспериментах на мышах исследователям удалось доказать действенность такого подхода.

«На основании этих результатов биомедицинская промышленность может сконструировать и испытать принципиально новые лекарства для терапии аутоиммунных заболеваний», — отметил Сергей Недоспасов, один из исследователей.

Чем опасна системная красная волчанка, если её не лечить?

Системная красная волчанка – это аутоиммунное заболевание, которое развивается из-за атаки иммунной системы тканей и органов своего же организма. При этом нарушении обширное воспаление затрагивает разные части тела – включая суставы, кожу, почки, кровяные клетки, головной мозг, сердце и легкие.

Так как симптомы волчанки очень часто имитируют признаки других заболеваний, её не всегда просто диагностировать. Некоторые люди родились с предрасположенностью к этому нарушению. В данном случае его вспышку могут провоцировать такие факторы внешней среды, как инфекции, прием некоторых препаратов и даже солнечный свет. Чаще всего с этим аутоиммунным заболеванием сталкиваются молодые девушки в возрасте 15-44 лет.

По словам специалистов из всемирно известной клиники Mayo Clinic, каждый случай не похож на 100% на другой. Симптомы могут появляться внезапно или развиваться постепенно, они могут быть как мягкими, так и очень тяжелыми, могут быть кратковременными или продолжительными. У большинства больных системная красная волчанка проявляется достаточно мягко. У людей случаются то эпизоды обострения, то облегчения, когда симптомы полностью уходят на какое-то время.

Самый отличительный симптом волчанки – высыпание на обеих щеках, которое по форме напоминает бабочку с расправленными крыльями. Этот симптом беспокоит многих, но не всех больных.

В целом симптомы болезни проявляются в зависимости от того, какой именно орган или систему организма поразило аутоиммунное воспаление. К самым распространенным признакам волчанки относятся:

• Усталость,
• Повышение температуры,
• Боль, отек и снижение подвижности в суставах,
• Напоминающие бабочку высыпания на щеках и мостике носа или сыпь на других участках тела,
• Повреждения на коже, которые появляются или усугубляются под воздействием солнца (фоточувствительность),
• Побледнение или посинение пальцев рук и ног под воздействием холода или из-за стресса (феномен Рейно),
• Одышка,
• Боль в груди,
• Сухость в глазах,
• Головные боли, спутанность сознания и потери памяти.

Человеку нужно обязательно показаться врачу, если у него появилась необъяснимая сыпь, продолжительное повышение температуры, постоянные боли или усталость.

Откуда берется системная красная волчанка?

Скорее всего, это заболевание развивается из-за сочетания генетической предрасположенности и воздействия факторов внешней среды. По мнению ученых, волчанка развивается после контакта с каким-нибудь раздражителем, который и вызывает приступ болезни. Однако в большинстве случаев установить точную причину развития этого нарушения так и не удается. Среди главных потенциальных триггеров:

1. Воздействие солнца. Оно может привести к поражению кожи или вызвать воспаление внутренних органов и систем у восприимчивых людей.
2. Инфекции. Присутствие в организме инфекции может вызвать первую вспышку красной волчанки. После повторного проникновения инфекции болезнь будет о себе напоминать.
3. Прием лекарств. Среди препаратов, которые способны вызвать эту болезнь – лекарства от кровяного давления, противосудорожные и антибиотики. Обычно для облегчения состояния достаточно прекратить прием этих препаратов, если это возможно. В данном случае врачи назначают альтернативные медикаменты.

Осложнения волчанки

Воспаление способно повлиять на многие участки тела и привести к таким последствиям:

• Серьезное повреждение почек и почечная недостаточность. Последняя является главной причиной смерти у больных волчанкой.
• Повреждение головного мозга и других участков центральной нервной системы. В данном случае больных беспокоят головные боли, головокружения, изменение поведения, провалы в памяти, трудности с выражением мыслей, проблемы со зрением, судороги и даже инсульт.
• Повышение риска кровотечений или излишнего свертывания крови, анемия, васкулит (воспаление сосудов).
• Воспаление оболочки в грудной полости (плеврит), кровотечения в грудной полости, пневмония.
• Воспаление сердечной мышцы, артерий или сердечной мембраны (перикардит). Также повышается риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и сердечного приступа.
• Повышение восприимчивости к инфекциям, поскольку и сама болезнь, и лекарства для её контроля ослабляют иммунную систему.
• Незначительный риск развития онкологического заболевания.
• Отмирание костной ткани (аваскулярный некроз). В данном случае снижается кровоснабжение костной массы, что приводит к крошечным разрывам в костях.
• Осложнения во время беременности, вплоть до преждевременных родов и выкидыша. Для снижения рисков врачи часто рекомендуют отложить планирование ребенка до тех пор, пока болезнь не будет находиться под контролем минимум 6 месяцев.

Лечение системной красной волчанки

Выбор медикаментов и общей тактики лечения зависит от симптомов. По мере проявления обострений и исчезновения симптомов врач и пациент будут менять препараты или их дозировку. К сожалению, это аутоиммунное заболевание не лечится – оно является хроническим. Все что можно сделать – держать его под контролем. Для этого назначают такие препараты:

• Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) – напроксен и ибупрофен. Эти лекарства назначают для устранения болей, отеков и повышенной температуры, если она связана с волчанкой. Более мощные препараты назначаются только по рецепту.
• Противомалярийные препараты. Обычно они назначаются для лечения малярии, но также применяются для снижения частоты приступов волчанки.
• Кортикостероиды. Преднизон и другие препараты могут противостоять воспалению. Если болезнь очень тяжелая и распространилась на почки или головной мозг, то в данном случае пациенту могут назначить высокие дозы таких стероидных лекарств, как метилпреднизон.
• Иммунодепрессанты. Эти препараты подавляют активность иммунной системы и могут назначаться при тяжелых формах болезни. Примеры таких лекарств – азатиоприн, мофетил микофенолата и метотрексат.
• Другие препараты, например белимумаб, который вводится внутривенно.
• Комбинация из разных препаратов.

Как облегчить жизнь больным системной красной волчанкой?

Главная задача больного – предотвратить обострение болезни или хотя бы снизить частоту проявления симптомов. Для этого рекомендуется:

• Регулярно ходить к врачу. Не стоит ждать, пока «придет» обострение. Лучше время от времени проходить осмотр и сдавать анализы.
• Опасаться жалящего солнца. Поскольку ультрафиолетовые лучи могут вызвать приступ симптомов волчанки, нужно от них защищаться. Рекомендуется носить шляпу, футболки с длинным рукавом и длинные штаны. Также можно использовать солнцезащитные кремы.
• Регулярно двигаться. Тренировки делают наши кости более крепкими, снижают риск сердечного приступа и просто улучшают качество жизни.
• Отказаться от вредных привычек, особенно от курения. Курение способно усугубить влияние волчанки на сердце и кровеносные сосуды.
• Питаться здоровой пищей и как можно более разнообразно – включать все основные группы продуктов с упором на фрукты, овощи, зерновые крупы, рыбу и постное мясо. Также не помешает хотя бы иногда посещать врача-диетолога, который поможет составить рацион. В некоторых случаях врачи разрабатывают специфическую противовоспалительную диету, которая помогает сдерживать воспалительные процессы в организме.

Дополнительные и альтернативные методы лечения волчанки

Существуют некоторые доказательства, что прием витамина D помогает людям, которые страдают от этого заболевания. Также для поддержания здоровья костей некоторым пациентам рекомендуют принимать кальций в дозировке 1200-1500 мг. Кроме того, некоторым больным помогает прием омега-3 жирных кислот.

Для облегчения мышечных болей, связанных с красной волчанкой, используется акупунктура.

Теперь вы знаете, чем опасно это заболевание. При появлении похожих симптомов нужно как можно раньше показаться врачу. Будьте здоровы!

Источники:

1. Lupus, Mayo Clinic,
2. Lupus Detailed Fact Sheet, Centers for Disease Control and Prevention,
3. Lupus, American College of Rheumatology.

причин, типов, симптомов, лечения и результатов

Обзор

У людей с волчанкой может появиться сыпь на лице. Этот симптом волчанки часто описывают как бабочку.

Что такое волчанка?

Системная красная волчанка (СКВ), обычно называемая просто волчанкой, представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, которое может вызывать отек (воспаление) и боль во всем теле. Когда у вас аутоиммунное заболевание, иммунная система организма борется сама с собой. Предполагается, что иммунная система борется с возможными угрозами организму — например, с инфекциями, — но в данном случае она действует в отношении здоровых тканей.

Если у вас волчанка, вы можете испытывать боль в суставах, повышенную чувствительность кожи и сыпь, а также проблемы с внутренними органами (мозгом, легкими, почками и сердцем). Многие из ваших симптомов могут появляться и исчезать волнообразно — их часто называют обострениями. Иногда симптомы волчанки могут быть легкими или незаметными (это означает, что они находятся в стадии ремиссии). В других случаях вы можете столкнуться с серьезными симптомами этого состояния, которые сильно повлияют на вашу повседневную жизнь.

Какие бывают типы волчанки?

Существует несколько различных типов волчанки.Системная красная волчанка является наиболее распространенным заболеванием. Другие типы волчанки включают:

• Кожная красная волчанка : Этот тип волчанки поражает кожу — термин «кожная» означает кожу. Люди с кожной красной волчанкой могут испытывать такие кожные проблемы, как чувствительность к солнцу и сыпь. Выпадение волос также может быть признаком этого состояния.
• Волчанка, вызванная лекарственными средствами : Эти случаи волчанки вызываются определенными лекарствами. У людей с лекарственной волчанкой могут быть многие из симптомов системной красной волчанки, но обычно они временные.Часто этот тип волчанки проходит после прекращения приема лекарств, которые ее вызывают.
• Неонатальная волчанка : Редкий тип волчанки, неонатальная волчанка — это заболевание, обнаруживаемое у младенцев при рождении. У детей, рожденных с неонатальной волчанкой, есть антитела, которые были переданы им от матери, которая либо болела волчанкой во время беременности, либо может иметь это заболевание в более позднем возрасте. Не каждый ребенок, рожденный от матери, страдающей волчанкой, заболеет этим заболеванием.

Кто страдает волчанкой?

Волчанка может быть у любого. Это может случиться с женщинами, мужчинами, детьми и даже новорожденными. Это гораздо чаще встречается у женщин, чем у мужчин, причем около 90% диагностированных случаев приходится на женщин репродуктивного возраста. Специалистам сложно оценить, сколько людей в Соединенных Штатах болеет волчанкой, потому что ее сложно диагностировать. Волчанка имеет множество симптомов, которые также могут быть признаками других заболеваний. Из-за этого могут быть люди, страдающие волчанкой, которые не диагностируются на протяжении всей жизни.

Волчанка также более заметна у некоторых этнических групп.Афроамериканки, латиноамериканки, азиатки и коренные американцы имеют больше шансов заболеть этим заболеванием, чем женщины европеоидной расы.

Ваш риск заболеть волчанкой также увеличивается, если у вас есть член семьи, страдающий волчанкой или другим аутоиммунным заболеванием.

Волчанка чаще встречается у женщин?

Волчанка гораздо чаще встречается у женщин, причем девять из 10 случаев возникают у женщин. Часто женщинам ставят диагноз в возрасте от 15 до 44 лет — в репродуктивном возрасте. Хотя причина волчанки неизвестна, считается, что гормон эстроген может играть определенную роль в этом заболевании.

Что делает волчанка с телом?

Волчанка может поражать многие части вашего тела. Это может вызвать ломоту и боли, а также серьезные осложнения для основных органов. Поскольку волчанка является аутоиммунным заболеванием, ваше тело атакует само себя. Со временем это может привести к повреждению органов.

Части тела, на которые может повлиять волчанка, могут включать кожу, кровь, суставы, почки, мозг, сердце и легкие.

• Кожа : Проблемы с кожей — частый признак волчанки.У некоторых людей с волчанкой появляется красная сыпь на щеках и переносице. Поскольку расположение этой сыпи такое же, как и у волков, много лет назад этому заболеванию было дано название «волчанка» (волк на латыни). Другие проблемы с кожей, которые могут возникнуть, включают большие красные круглые высыпания (бляшки), которые могут образовывать рубцы (так называемая дискоидная волчанка). Кожная сыпь обычно усугубляется солнечным светом. Также часто встречаются выпадение волос и язвы во рту.
• Кровь : Поражение крови может происходить с другими симптомами или без них.У людей с волчанкой может наблюдаться опасное снижение количества эритроцитов, лейкоцитов или тромбоцитов (клеток, которые помогают свертывать кровь). Иногда изменения показателей крови могут способствовать появлению симптомов усталости (низкое количество эритроцитов, анемия), серьезных инфекций (низкое количество лейкоцитов) или легкого образования синяков (низкое количество тромбоцитов). Однако у многих людей нет симптомов, указывающих на отклонения в крови, поэтому важно периодически сдавать анализы крови для выявления каких-либо проблем.При волчанке чаще наблюдаются сгустки крови. Сгустки часто возникают в ногах (сгусток вен, называемый тромбозом глубоких вен), легких (сгусток легкого, называемый тромбоэмболом легочной артерии) или головном мозге (инсульт). Сгустки крови, которые развиваются у пациентов с волчанкой, могут быть связаны с выработкой антифосфолипидных антител. Эти антитела представляют собой аномальные белки, которые могут увеличивать склонность крови к свертыванию.
• Суставы : Артрит очень часто встречается у людей с волчанкой. Может быть боль с отеком или без него.Скованность и боль могут быть особенно неприятными по утрам. Артрит может быть проблемой всего от нескольких дней до недель или может быть постоянным признаком болезни. К счастью, артрит обычно не приносит вреда.
• Почки : Поражение почек у людей с волчанкой потенциально опасно для жизни и может возникать почти у половины пациентов с волчанкой. Проблемы с почками могут стать очевидными, когда пациенты с волчанкой чувствуют себя больными артритом, у них появляется сыпь, жар и потеря веса. Реже заболевание почек может возникнуть при отсутствии других симптомов волчанки.Само по себе заболевание почек обычно не проявляет симптомов, пока не перейдет в запущенную стадию. Важно своевременно диагностировать и лечить заболевание почек. Самые ранние признаки заболевания почек обнаруживаются при анализе мочи, который называется анализ мочи.
• Мозг : К счастью, поражение мозга — редкая проблема у людей с волчанкой. Когда присутствует, это может вызвать спутанность сознания, депрессию, судороги и, в редких случаях, инсульты.
• Сердце и легкие : Поражение сердца и легких часто вызывается воспалением оболочки сердца (перикарда) и легких (плевры).Когда эти структуры воспаляются, у вас может развиться боль в груди, нерегулярное сердцебиение и скопление жидкости вокруг легких (плеврит или плеврит) и сердца (перикардит).

Симптомы и причины

Что вызывает волчанку?

Причина волчанки в настоящее время неизвестна. Исследователи все еще работают над тем, чтобы узнать больше о причине возникновения волчанки. Несмотря на то, что точная причина неизвестна, есть факторы, которые могут повлиять на это состояние. Возможные факторы, которые могут вызвать волчанку, могут включать:

• Гормональные изменения : женщины чаще страдают волчанкой, чем мужчины, и это может быть частично связано с гормонами, такими как эстроген. Волчанка часто наблюдается у женщин репродуктивного возраста (от 15 до 44 лет), когда уровень эстрогена выше.
• Факторы окружающей среды : Различные аспекты вашей окружающей среды также могут увеличить риск возникновения волчанки. Возможными причинами волчанки могут быть такие факторы, как количество солнечного света, которому вы подвергаетесь, лекарства, которые вы принимаете, вирусы, которым вы могли подвергнуться, или даже стресс. Причиной волчанки также может быть курение в анамнезе.
• История вашей семьи : волчанка может быть генетическим фактором.Если у вас есть члены семьи, страдающие волчанкой, риск заболевания повышается.

Каковы симптомы волчанки?

При волчанке у вас могут возникнуть самые разные симптомы. Не у всех больных волчанкой будет одинаковый набор симптомов. Кроме того, многие из этих симптомов частично совпадают с симптомами других заболеваний. Это одна из трудностей при диагностике волчанки.

Симптомы волчанки могут развиваться медленно.Со временем вы можете заметить новые симптомы. Серьезность ваших симптомов также может со временем измениться. Иногда симптомы могут практически отсутствовать (в стадии ремиссии), а в других случаях они могут обостриться. Обострение — это когда симптом внезапно становится более серьезным, чем раньше.

Симптомы волчанки могут включать:

Каковы симптомы волчанки у женщин?

Большинство людей, у которых диагностирована волчанка, — женщины. Женщины, как правило, испытывают общие симптомы волчанки, но также могут иметь осложнения, затрагивающие различные части тела.Эти осложнения могут включать проблемы с почками (чаще наблюдаемые у афроамериканских и латиноамериканских женщин, чем у других групп), остеопороз и болезни сердца.

Что такое волчаночная сыпь?

Кожная сыпь — один из распространенных симптомов волчанки. Высыпания при волчанке часто возникают в результате длительного пребывания на солнце и обычно длятся от нескольких дней до недель. У вас может появиться сыпь на лице, руках или запястьях. Когда у вас появляется сыпь на лице, она обычно распространяется на переносицу и на каждую из ваших щек.Это часто называют «сыпью бабочки» из-за формы лица.

Кожная сыпь может вызывать дискомфорт и зуд. Эти высыпания иногда могут исчезнуть через короткий промежуток времени. Однако некоторые высыпания и язвы на коже могут быть постоянными.

Почему волчанка вызывает выпадение волос?

Одним из осложнений волчанки может быть повреждение кожи и выпадение волос. У людей с волчанкой могут появиться рубцы на коже и волосистой части головы от высыпаний. Это может привести к истончению и выпадению волос.Вы также можете столкнуться с потерей волос как побочным эффектом некоторых лекарств, которые лечат волчанку — выпадение волос может быть побочным эффектом стероидов. Если ваши волосы истончаются или выпадают, обратитесь к врачу. Иногда с этой проблемой может помочь смена лекарств. Ваш врач может также порекомендовать использовать мягкие шампуни (детский шампунь).

Почему волчанка вызывает увеличение или снижение веса?

Многие люди с волчанкой могут похудеть. Это может быть вызвано лекарствами, которые используются для лечения волчанки, или дискомфортом самого заболевания.С другой стороны, некоторые люди могут набрать вес, если обнаружат, что они неактивны из-за боли в суставах. При волчанке важно придерживаться здорового питания. Поговорите со своим врачом и, возможно, с диетологом (специалистом по питанию), чтобы определить лучшую диету для вас.

Диагностика и тесты

Как диагностируется волчанка?

Диагностика волчанки может быть долгой и сложной. Симптомы, которые могут возникнуть при волчанке, могут совпадать с симптомами других заболеваний, например диабета и артрита.Для развития симптомов волчанки может потребоваться время, что усложняет диагностику заболевания.

Ваш лечащий врач обычно начинает с семейного анамнеза, чтобы узнать, есть ли волчанка у вас в семье. Затем ваш врач захочет обсудить любые симптомы, которые у вас возникли. После разговора с вами о ваших симптомах ваш врач, как правило, проводит несколько лабораторных анализов. Эти тесты ищут такие вещи, как низкое количество клеток крови, анемия и другие аномалии.

Провайдер может также провести тест на антинуклеарные антитела (ANA).Этот тест ищет антитела — белки в вашем организме, которые защищают от болезней, — которые могут быть признаком аутоиммунного заболевания. У людей с системной красной волчанкой обычно положительный результат теста на АНА.

Означает ли положительный результат теста на антинуклеарные антитела (ANA) волчанку?

Положительный результат теста только на антинуклеарные антитела не означает, что у вас волчанка. Тест на АНА является положительным у большинства людей с волчанкой, но он также положителен у многих людей, не страдающих волчанкой.Из-за этого одного положительного результата ANA недостаточно для диагностики волчанки. Ваш врач обычно будет искать как минимум три других клинических признака (включая симптомы и семейный анамнез), прежде чем поставить диагноз волчанки.

Ведение и лечение

Как лечится волчанка?

То, как ваш поставщик лечит волчанку, может зависеть от нескольких факторов, в том числе:

• Симптомы и осложнения, с которыми вы столкнулись.
• Серьезность вашего дела.
• Ваш возраст.
• Тип лекарств, которые вы можете принимать.
• Ваше общее состояние здоровья.
• Ваша история болезни.

Волчанка — это пожизненное (хроническое) заболевание, которое необходимо регулярно лечить. Цель лечения — добиться ремиссии (неактивности) ваших симптомов и ограничить ущерб, который болезнь наносит вашим органам. К сожалению, волчанка непредсказуема, и то, как она влияет, со временем может меняться.Вам нужно будет регулярно посещать вашего врача и адаптировать свой план обслуживания в соответствии с вашими симптомами.

Некоторым людям с легкой волчанкой может потребоваться ограниченное лечение. У этих людей могут быть симптомы, за которыми следят и наблюдают, чтобы убедиться, что они не ухудшаются, но в настоящее время они не нуждаются в лечении. Другим может потребоваться агрессивный план лечения. У этих людей, как правило, наблюдаются более серьезные осложнения (например, сердечные, легочные или почечные). Ваш лечащий врач обсудит с вами лучшие варианты лечения в зависимости от ваших симптомов, осложнений и истории болезни.

Какие распространенные лекарства от волчанки?

Лекарства, которые можно использовать для лечения волчанки, включают:

• Стероиды (кортикостероиды, включая преднизон): Кремы со стероидами можно наносить непосредственно на высыпания. Использование кремов обычно безопасно и эффективно, особенно при легкой сыпи. Использование стероидных кремов или таблеток в низких дозах может быть эффективным при легких или умеренных проявлениях волчанки. Стероиды также можно использовать в более высоких дозах, когда внутренние органы находятся под угрозой.К сожалению, высокие дозы также могут вызывать побочные эффекты.
• Гидроксихлорохин (Плаквенил®) : Это лекарство обычно используется для контроля легких проблем, связанных с волчанкой, таких как заболевания кожи и суставов. Он также используется для лечения усталости и язв во рту.
• Азатиоприн (Имуран®): Лекарство, первоначально использовавшееся для предотвращения отторжения пересаженных органов, обычно используется для лечения более серьезных проявлений волчанки.
• Метотрексат (Rheumatrex®): Это лекарство — еще один химиотерапевтический препарат, который используется для подавления иммунной системы. Его использование становится все более популярным при кожных заболеваниях, артрите и других не опасных для жизни формах заболеваний, которые не поддаются лечению такими лекарствами, как гидроксихлорохин или низкие дозы преднизона.
• Циклофосфамид (Cytoxan®) и микофенолят мофетил (CellCept®): Эти препараты представляют собой химиотерапевтические препараты, которые оказывают очень сильное воздействие на снижение активности иммунной системы.Они используются для лечения более тяжелых форм волчанки, особенно волчанки, поражающей почки.
• Белимумаб (Benlysta®): Это лекарство представляет собой моноклональное антитело, которое снижает активность лейкоцитов (лимфоцитов), вырабатывающих аутоантитела. Аутоантитела важны, поскольку они вызывают повреждение тканей. Белимумаб используется для лечения волчанки, которая не затрагивает почки, и не поддается лечению другими видами лечения.
• Ритуксимаб (Ритуксан®) : Это лекарство также является моноклональным антителом, которое снижает активность лейкоцитов (лимфоцитов), вырабатывающих аутоантитела.Иногда его используют для лечения волчанки, которая не поддается лечению другими видами лечения.

Перспективы / Прогноз

Можно ли вылечить волчанку?

В настоящее время лекарства от волчанки не существует. Лечение волчанки направлено на то, чтобы контролировать симптомы и ограничивать ущерб, который болезнь наносит вашему телу. С этим заболеванием можно справиться, чтобы свести к минимуму влияние волчанки на вашу жизнь, но оно никогда не исчезнет.

Можно ли умереть от волчанки?

В большинстве случаев смерть наступает не непосредственно из-за волчанки, а из-за симптомов и повреждений органов.Такие проблемы, как повреждение почек, сердечно-сосудистые заболевания и инфекции, могут причинить серьезный вред и быть опасными для жизни.

Заразна ли волчанка?

Волчанка не заразна и не может передаваться от одного человека к другому при прикосновении, чихании или кашле.

Жить с

Могу ли я забеременеть, если у меня волчанка?

Женщины с волчанкой могут забеременеть. Однако существует риск неблагоприятных исходов беременности (выкидыша) у людей с волчанкой. Если вы планируете беременность в будущем, поговорите со своим врачом за несколько месяцев до зачатия.Вашему провайдеру может потребоваться скорректировать лекарства от волчанки, чтобы убедиться, что они безопасны для беременности.

Если у меня волчанка, передам ли я ее своим детям?

Волчанка может быть генетическим фактором. Ваш риск заболеть волчанкой увеличивается, если у вас есть другие члены семьи, страдающие этим заболеванием. Мать с волчанкой может передать ее своему ребенку. Однако это случается не всегда и не часто. Некоторые женщины с волчанкой рожают ребенка с этим заболеванием, а другие нет. Если у вас есть семейная история волчанки или вы сами страдаете волчанкой и думаете о беременности, поговорите со своим врачом.

Что я могу сделать, чтобы предотвратить обострение волчанки?

Хотя волчанку невозможно предотвратить, вы можете изменить свою повседневную жизнь, чтобы избежать обострения симптомов. Вот несколько вещей, которые стоит попробовать:

• Избегайте пребывания на солнце : Для многих, страдающих волчанкой, пребывание на солнце может стать проблемой. Старайтесь не выходить на улицу в часы пик, когда выходит солнце, носить защитную одежду (с длинными рукавами и шляпу с полями) и пользоваться солнцезащитным кремом.
• Оставаться в движении : Боль в суставах может заставить вас сесть и отдохнуть, но выполнение упражнений с малой нагрузкой действительно может помочь.
• Поддержание здоровых привычек : Несколько привычек, о которых следует помнить, включают выбор здорового питания, много сна и сокращение стресса в своей жизни. Также существует сильная связь между волчанкой и сердечными заболеваниями. Убедитесь, что вы работаете со своим лечащим врачом, чтобы снизить риск сердечных заболеваний.

Записка из клиники Кливленда

Если вы испытываете симптомы волчанки, обратитесь к своему врачу.Диагностика волчанки может занять много времени из-за широкого спектра симптомов и того, что симптомы медленно нарастают с течением времени. Диагноз — это первый шаг к управлению этим заболеванием и улучшению качества жизни.

Сыворотка при системной красной волчанке откладывает C4d на эритроцитах, снижает деформируемость мембран эритроцитов и способствует выработке оксида азота

Задача: Системная красная волчанка (СКВ) характеризуется внутрисосудистой активацией системы комплемента и отложением фрагментов комплемента (С3 и С4) на плазматических мембранах циркулирующих клеток, включая эритроциты (эритроциты). Целью этого исследования было выяснить, влияет ли этот процесс на биофизические свойства эритроцитов.

Методы: Сыворотку и эритроциты выделяли у пациентов с СКВ и здоровых людей из контрольной группы. Эритроциты от здоровых универсальных доноров (тип O, отрицательный резус-фактор) инкубировали с СКВ или контрольной сывороткой. Мы использовали проточную цитометрию для оценки отложения фрагментов комплемента на эритроцитах. Деформируемость мембраны эритроцитов измеряли с использованием двумерных массивов микроканалов.Уровни фосфорилирования белков определяли с помощью вестерн-блоттинга.

Полученные результаты: Инкубация здоровых универсальных донорских эритроцитов с сыворотками пациентов с СКВ, но не с контрольными сыворотками, приводила к отложению фрагментов C4d на эритроцитах. Декорированные комплементом эритроциты демонстрировали значительное снижение как деформируемости мембраны, так и мерцания. Сыворотка пациентов с СКВ вызвала преходящий приток Са (++) в эритроциты, который был связан со снижением фосфорилирования β-спектрина и с повышенным фосфорилированием полосы 3, двух ключевых белков цитоскелета эритроцитов.Наконец, инкубация с сывороткой СКВ приводила к продукции оксида азота эритроцитами, тогда как с контрольной сывороткой этого не происходило.

Заключение: Наши данные предполагают, что активация комплемента у пациентов с СКВ приводит к кальций-зависимым изменениям цитоскелета в эритроцитах, которые делают их менее деформируемыми, вероятно, нарушая их ток через капилляры. Это явление может негативно повлиять на доставку кислорода к тканям.

Системное заболевание: виды и лечение

Артритный отек (рис. 1)
Артритный отек среднего сустава пальца называется узлом Бушара. Припухлость суставов мизинца называется узлами Гебердена.

Это один из типов окклюзионных заболеваний сосудов, которые могут поражать пальцы (см. Заболевания сосудов). Это связано с воспалительным заболеванием, называемым васкулитом, и обычно связано с курением.Это заболевание поражает средние и мелкие артерии, поэтому часто поражаются пальцы рук и ног. Заболевание может проявляться в виде болезненной и плохо заживающей раны или язвы / гангрены на кончике пальца. Часто задействовано несколько пальцев. Основное лечение — отказ от курения. Иногда необходима ампутация.

Дактилит (Рисунок 3)
Этот случай дактилита был связан с псориатическим артритом. На этой фотографии опухоль простирается от ладони, включая безымянный палец, до небольшого сустава.Скованность — обычное дело. Также может быть боль. Этот отек можно уменьшить с помощью лекарств, устраняющих причину его возникновения.

Слизистая киста (Рисунок 4)
Этот тип кисты называется слизистой кистой. Если кожа станет тонкой, киста может разорваться, что приведет к оттоку прозрачной липкой жидкости. Возникший в результате разрыв кожи может позволить бактериям достичь ближайшего сустава, вызывая инфекцию сустава или кости.

Красные точки (Рисунок 5)
Маленькие красные точки, показанные выше, находятся в тонкой части кожи вокруг ногтя.Они также могут встречаться в более толстой розовой части. Это наблюдается при дерматомиозите, системной волчанке и склеродермии.

Лейконихия (Рисунок 6)
Лейконихия наблюдается при вирусных инфекциях, заболеваниях кишечника и почек, отравлениях и лекарствах. Ноготь может оторваться от ногтевого ложа из-за грибковой инфекции или по другим причинам.

Красные полосы (Рисунок 7)
Красные полосы, видимые в области ногтей, могут быть следствием кровоизлияния (кровотечения). Они называются осколочными кровоизлияниями и наблюдаются при эндокардите (сердечной инфекции), хотя также сообщаются при псориазе и трихинеллезе.

Псориаз (Рисунок 8)
Псориаз обычно поражает ногтевое ложе. Могут возникнуть ямки в ногте, расшатывание, полосы крови под ногтем и другие изменения. Посередине видно пятно на коже псориаза.

Ноготь «клещи» (Рисунок 9)
Этот гвоздь «клещи» с аномальной кривой формы из стороны в сторону можно увидеть при рождении или просто из-за старения. Однако это также может быть вызвано изменениями в нижней кости из-за болезни (в данном случае подагры).

Пиогенная гранулема (Рисунок 10)
Это мясистая, влажная, легко кровоточащая масса / опухоль, которая может поражать пальцы, хотя сообщалось о многих других участках тела. На пальцах обычно обнаруживается после травм кожи. Если появляются множественные или повторяющиеся уплотнения, это может быть связано с действием лекарств или беременностью. Наиболее эффективным методом лечения является операция по удалению шишки, но если это связано с приемом лекарств, может помочь прекращение приема лекарств.

Terry’s Nails (Рисунок 11, ниже)
Ногти на руках будут молочно-белыми / непрозрачными, за исключением небольшой розово-красной полосы на конце ногтевого ложа.Впервые сообщалось, что это появление связано с заболеванием печени, а также с застойной сердечной недостаточностью, диабетом II типа и старением.

---

© 2017 Американское общество хирургии кисти

Это содержание написано, отредактировано и обновлено хирургами-ручными хирургами, членами Американского общества хирургии кисти. Найдите ближайшего к вам хирурга-ручного хирурга.

Клиническое значение ширины распределения эритроцитов у пациентов с системной красной волчанкой | Египетская ревматология и реабилитация

RDW — это параметр, который обычно оценивается для описания гетерогенности эритроцитов. В последние годы он считался полезным показателем для дифференциации талассемии и мегалобластной анемии, а также железодефицитной анемии [3].

Это исследование предназначено для оценки взаимосвязи между различными гематологическими параметрами, RDW, количеством нейтрофилов и лимфоцитов со статусом активности заболевания у пациентов с СКВ.

Была значительная разница между 3 группами относительно каждой из C3 и C4. Мы обнаружили, что C3 и C4 были ниже в активных случаях, чем в неактивных случаях и в контрольной группе.Наше исследование не согласуется с тем исследованием, которое не показало статистически значимой разницы между исследуемыми группами в отношении C3: 85 ± 32,2 мг / л в группе I и 76,7 ± 39,4 мг / л во II группе. Статистически значимая разница между исследуемыми группами по С4: 11,9 ± 5,4 мг / л в группе I и 9,2 ± 3 мг / л во II группе [15].

Среднее значение 24-часовых белков в моче было выше в активных случаях (1207,4), чем в неактивных случаях (183,6), и оно составило 77,8 в контрольной группе, с высокой достоверной разницей, что согласуется с исследованием, проведенным Zou et al.[17].

Широко признано, что С3, С4 и антитела против дцДНК полезны для оценки активности заболевания. Мы обнаружили, что пациенты с положительной анти-дцДНК имели среднюю RDW выше, чем пациенты с отрицательной анти-дцДНК с высокой достоверной разницей ( p <0,001). Однако в исследовании, проведенном Hu et al. [16], корреляции между RDW и другими показателями не наблюдалось. Это несоответствие может быть связано с медицинским вмешательством, которое оказывает большое влияние на антитела к C3, C4 и анти-дцДНК [21].

В этом исследовании средняя RDW была выше в активных случаях (16,64% ± 4,7%) по сравнению с двумя другими группами (13,16% ± 2,67%, 12,7% ± 1,13%, соответственно) с высокой достоверной разницей ( p значение < 0,001). Наши результаты согласуются с исследованием, проведенным Sabry et al., Которое показало, что существует статистически значимая разница между исследуемыми группами в отношении RDW: 15,5 ± 2% в группе I (высокая активность СКВ) и 18,5 ± 1,2% в группе. II группа (СКВ очень высокой активности) [15].

Кроме того, Gulkesen и Gozel (2018) [22] обнаружили, что значение RDW также было выше у пациентов с СКВ по сравнению со здоровой контрольной группой, а повышение RDW было статистически значимым; это было похоже на результаты Hu et al. [16], поскольку они обнаружили, что значение RDW было выше у пациентов с СКВ по сравнению со здоровыми людьми. Этот вывод также согласуется с недавним исследованием, проведенным Vayá et al. [14].

Корреляция между RDW и индексами активности заболевания показала, что RDW имеет положительно значимую корреляцию как с оценкой SLEDAI, так и с суточными белками, и это согласуется с данными Sabry et al., которые обнаружили, что существует очень значимая корреляция между оценкой SLEDI и RDW [15]. И не было значимой корреляции с каждым из лейкоцитов, HGB, тромбоцитов (PLT) и отрицательно коррелировали с C3 и C4, что можно объяснить низким титром этих параметров во время активности. Также наши результаты согласуются с некоторыми результатами исследования, которое показало, что существует значительная отрицательная корреляция между оценкой SLEDAI и Hgb, PLT, C4 и C3 [17].

В нашем исследовании была выявлена ​​положительная корреляция между RDW и ESR, что согласуется с предыдущими исследованиями, которые показали, что RDW положительно коррелирует с воспалительными индексами, такими как CRP и ESR [23], и что RDW также ассоциируется с повышенной активностью заболевания. воспалительного заболевания кишечника [8, 9] и РА [10].Также другое исследование показало, что результаты анализа показали, что RDW положительно коррелировал с CRP, ESR и оценкой SLEDAI-2-K [14]. Эти результаты позволяют предположить, что RDW может быть потенциальным индексом для оценки активности заболевания при СКВ.

Наше исследование показало, что существует несущественная корреляция между RDW и HGB, что не согласуется с Vayá et al. [14], которые пришли к выводу, что у пациентов с СКВ RDW тесно связана с уровнем гемоглобина ( r = -0,639, p <0.001), но не у пациентов без анемии ( r = — 0,076, p > 0,05).

Наше исследование показало, что не было никакой корреляции между средним числом нейтрофилов и средним числом лимфоцитов с C3, C4, SLEDAI, 24-часовыми белками и тромбоцитами, но значимо только с уровнем гемоглобина, что не согласуется с результатами другого исследования, в котором был сделан вывод о том, что лимфопения и лейкопения часто встречаются у пациентов с СКВ и в значительной степени связаны с волчаночным нефритом, потреблением комплемента, более высокими дозами стероидов и введением циклофосфамида [5].Кроме того, предыдущее исследование выявило значительную связь лимфопении и нефрита и связь лимфопении с потребляемым C3 [24], в то время как, с другой стороны, исследование согласилось с нашими результатами и не показало связи между лимфопенией и нефритом и потреблением C3 [25]. ].

В отличие от предыдущих исследований [26, 27], не было корреляции между SLEDAI и лимфопенией, что также согласуется с данными другого предыдущего исследования, где лимфопения не имела статистической значимости с SLEDAI [24].

Hu et al. [16] также предположили, что RDW является потенциальным индексом для оценки активности болезни при СКВ. По сравнению с традиционными инструментами оценки активности заболевания, следует отметить следующие преимущества RDW: (I) RDW — простой и дешевый требуемый воспалительный параметр, (II) длительный срок жизни красных кровяных телец, который составляет примерно 130 дней [12], и (III) RDW не могут быть затронуты недавними инфекциями. Это последнее преимущество делает RDW особенно полезным для оценки активности заболевания у пациентов с СКВ с инфекциями.

Мастоцитоз — NHS

Мастоцитоз — редкое заболевание, вызванное скоплением избыточного количества тучных клеток в тканях организма.

Существует 2 основных типа мастоцитоза:

• кожный мастоцитоз, который в основном поражает детей — когда тучные клетки собираются в коже, но не встречаются в больших количествах в других частях тела
• системный мастоцитоз, который в основном поражает взрослых — там, где тучные клетки собираются в тканях тела, таких как кожа, внутренние органы и кости.

Существует также несколько подтипов системного мастоцитоза в зависимости от симптомов.

Информация:

Консультации по коронавирусу

Получите консультацию о коронавирусе и мастоцитозе от UK Masto

Тучные клетки

Тучные клетки производятся в костном мозге, губчатой ​​ткани, обнаруженной в полых центрах некоторых костей, и живут дольше, чем нормальные клетки. Они являются важной частью иммунной системы и помогают бороться с инфекциями.

Когда тучные клетки обнаруживают вещество, которое вызывает аллергическую реакцию (аллерген), они выделяют гистамин и другие химические вещества в кровоток.

Гистамин вызывает расширение кровеносных сосудов, а также зуд и опухание окружающей кожи. Это также может привести к скоплению слизи в дыхательных путях, которые сужаются.

Симптомы мастоцитоза

Симптомы мастоцитоза могут различаться в зависимости от типа.

Кожный мастоцитоз

Наиболее частым симптомом кожного мастоцитоза являются аномальные новообразования (поражения) на коже, такие как бугорки и пятна, которые могут образовываться на теле, а иногда и волдыри.

Системный мастоцитоз

Некоторые люди с системным мастоцитозом могут испытывать эпизоды тяжелых симптомов, которые длятся 15–30 минут, часто со специфическими триггерами, такими как физическая нагрузка или стресс. У многих проблем нет.

Во время эпизода у вас могут быть:

• кожные реакции, такие как зуд и покраснение
• кишечные симптомы, такие как тошнота и диарея
• боли в мышцах и суставах
• изменения настроения, головные боли и приступы усталости (утомляемости)

Существует 3 подтипа системного мастоцитоза.Это:

• индолентный мастоцитоз — симптомы обычно от легкой до умеренной и варьируются от человека к человеку; вялотекущий мастоцитоз составляет около 90% случаев системного мастоцитоза у взрослых
• агрессивный мастоцитоз — когда тучные клетки размножаются в органах, таких как селезенка, печень и пищеварительная система; симптомы более обширны и тяжелы, хотя поражения кожи встречаются реже
• системный мастоцитоз с ассоциированным заболеванием крови (гематологическим) — при котором также развивается состояние, поражающее клетки крови, такое как хронический лейкоз

Тяжелая аллергическая реакция

Люди с мастоцитозом имеют повышенный риск развития тяжелой и опасной для жизни аллергической реакции.Это известно как анафилаксия.

Повышенный риск анафилаксии вызван аномально большим количеством тучных клеток и их способностью выделять большое количество гистамина в кровь.

Если у вас или у вашего ребенка мастоцитоз, вам может потребоваться автоинжектор адреналина, который можно использовать для лечения симптомов анафилаксии.

Подробнее о симптомах мастоцитоза.

Причины мастоцитоза

Причина или причины мастоцитоза до конца не известны, но считается, что существует связь с изменением генов, известным как мутация KIT.

Мутация KIT делает тучные клетки более чувствительными к воздействию сигнального белка, называемого фактором стволовых клеток (SCF).

SCF играет важную роль в стимулировании производства и выживания определенных клеток, таких как клетки крови и тучные клетки, внутри костного мозга.

В очень немногих случаях мастоцитоза мутация KIT передается через семьи. Однако в большинстве случаев мутация происходит без видимой причины.

Диагностика мастоцитоза

Физикальное обследование кожи — первый этап диагностики кожного мастоцитоза.

Лечащий врач вашего ребенка или кожный специалист (дерматолог) может потереть пораженные участки кожи, чтобы увидеть, не покраснели ли они, не воспалились и не зудят. Это известно как признак Дарье.

Обычно можно подтвердить диагноз путем проведения биопсии, при которой берется небольшой образец кожи и проверяется на наличие тучных клеток.

Следующие тесты обычно используются для поиска системного мастоцитоза:

• анализов крови — включая полный анализ крови (FBC) и измерение уровней триптазы в крови
• ультразвуковое сканирование для поиска увеличения печени и селезенки, если это кажется вероятно
• сканирование DEXA для измерения плотности кости
• тест биопсии костного мозга — где используется местный анестетик и длинная игла вводится через кожу в кость под ней, обычно в таз

Диагностика системного мастоцитоза обычно делается путем обнаружения типичных изменений при биопсии костного мозга.

Лечение мастоцитоза

Лекарства от мастоцитоза нет, поэтому цель лечения — попытаться облегчить симптомы.

Варианты лечения будут зависеть от типа мастоцитоза и тяжести симптомов.

Легкие и умеренные случаи кожного мастоцитоза можно лечить с помощью стероидного крема (местных кортикостероидов) в течение короткого времени.

Стероидный крем уменьшает количество тучных клеток, которые могут выделять гистамин и вызывать отек (воспаление) кожи.

Антигистаминные препараты также можно использовать для лечения симптомов кожного или вялотекущего мастоцитоза, таких как покраснение кожи и зуд.

Антигистаминные препараты — это лекарство, блокирующее действие гистамина, и часто используются для лечения аллергических состояний.

Подробнее о лечении мастоцитоза.

Осложнения мастоцитоза

У детей симптомы кожного мастоцитоза обычно улучшаются со временем, но остаются стабильными у взрослых.

Во многих случаях состояние улучшается само по себе к тому времени, когда ребенок достигает половой зрелости.

Перспективы системного мастоцитоза могут различаться в зависимости от вашего типа.

Индолентный системный мастоцитоз не должен влиять на продолжительность жизни, в отличие от других типов мастоцитоза.

У некоторых людей в течение жизни развивается серьезное заболевание крови, такое как хронический лейкоз.

Последняя проверка страницы: 19 июня 2019 г.
Срок следующей проверки: 19 июня 2022 г.

Параметры, влияющие на эффективность RNAi

Образец цитирования: Miller SC, Miyata K, Brown SJ, Tomoyasu Y (2012) Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum : Параметры, влияющие на эффективность RNAi.PLoS ONE 7 (10): e47431. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047431

Редактор: Алистер П. МакГрегор, Оксфордский университет Брукса, Великобритания

Поступила: 26.05.2011; Одобрена: 17 сентября 2012 г .; Опубликовано: 25 октября 2012 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Финансирование: Компания SCM получила награду STAR-стажер от KINBRE, номер премии P20 RR016475 от Национального центра исследовательских ресурсов. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (SJB: HD29594), стартовым грантом Университета Майами (YT) и Национальным научным фондом (YT: IOS 0950964). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

РНК-интерференция (РНКи) — это механизм подавления гена, запускаемый двухцепочечной РНК (дцРНК) [1] — [3]. дцРНК может вызывать молчание генов как на посттранскрипционном уровне (посредством расщепления мРНК и / или антисмысловой супрессии), так и на уровне транскрипции (посредством модификации ДНК) [3], [4]. Хотя путь РНКи является эндогенным путем, который, как известно, участвует в регуляции экспрессии эукариотических генов, защите от вирусной инфекции и контроле активности транспозонов, он также используется в качестве обратного генетического инструмента для подавления экспрессии генов во многих организмах.Посттранскрипционный путь РНКи инициируется нуклеазой РНКазы III Dicer, которая расщепляет дцРНК на фрагменты длиной 21–23 п.н., называемые короткими интерферирующими РНК (миРНК) [5] — [7]. Затем миРНК связываются комплексом белков, известным как комплекс индуцированного РНК молчания (RISC) [8], [9]. Этот комплекс связывает мРНК, комплементарную миРНК, и вызывает расщепление мРНК за счет действия каталитических белков Argonaute [10] — [13]. Расщепление мРНК снижает количество мРНК, доступной для трансляции, и, таким образом, фенокопирует мутацию потери функции.

Феномен РНКи был описан и использовался в качестве генетического инструмента в классических генетических модельных организмах более десяти лет. В последнее время появилось множество публикаций, в которых РНКи рассматриваются как эффективный инструмент во многих новых модельных системах (например, см. [14] — [23]). Однако многие исследования в этих новых модельных системах ограничены по объему, при этом большая часть данных иллюстрирует эффект РНКи для ограниченного числа генов в определенных тканях, на определенных этапах жизни.Поскольку RNAi является относительно новым инструментом и имеет ограниченное применение в Drosophila [24], было проведено мало исследований параметров, необходимых для того, чтобы сделать RNAi успешными у насекомых. Кроме того, использование РНКи у млекопитающих затруднено из-за интерферонового ответа, который может запускаться дцРНК и приводить к гибели клеток [25]. Следовательно, подавляющее большинство данных, доступных для правильного дизайна экспериментов с РНКи, получено из одной модельной системы на животных, нематоды Caenorhabditis elegans .Целью данной работы является предоставление информации, полезной для экспериментального дизайна проектов RNAi на Tribolium castaneum и других насекомых. Наши результаты показывают, что размер и концентрация дцРНК имеют решающее значение для эффективности ответа РНКи, при этом более длинная дцРНК более эффективна в отношении начального нокдауна и продолжительности эффекта РНКи. Кроме того, наши анализы с использованием серии коротких dsRNAs и химерных dsRNA предоставляют доказательства того, что клеточное поглощение dsRNA (а не сам ответ RNAi) является основным этапом, на который влияет длина dsRNA в Tribolium .Мы также обнаружили, что при введении нескольких дцРНК может происходить конкуренция между дцРНК, что приводит к менее эффективному ответу РНКи. Изучение этих основных характеристик РНКи в Tribolium не только поможет в дизайне экспериментов, но также даст представление о молекулярном механизме системного ответа РНКи у красного мучного жука.

Результаты

Размер дцРНК

Для экспериментов с РНКи длина используемой дцРНК широко варьируется в зависимости от контекста и модельного организма (обычно от 21 до 1000 пар оснований).У растений длина дцРНК не вызывает большой разницы в эффективности РНКи, поскольку было показано, что и миРНК, и длинные дцРНК распространяются, подавляя функцию генов как локально, так и системно [26]. У животных и siRNAs, и длинные dsRNAs, по-видимому, способны запускать ответ RNAi, если эти молекулы RNA доставляются непосредственно внутрь клеток (посредством инъекции, трансфекции и сверхэкспрессии конструкции в виде шпильки) [27]. Исключение составляют клетки млекопитающих, в которых длинные дцРНК вызывают интерфероновый ответ, приводящий к гибели клеток [25].Длина молекул дцРНК влияет на эффективность РНКи более заметно, когда дцРНК размещены вне клеток у животных. У нематоды C. elegans малые dsRNAs и siRNAs не эффективно поглощаются клетками и недостаточны для того, чтобы вызывать системные RNAi [10], [28] — [31]. Следовательно, длинные dsRNAs необходимы для того, чтобы вызвать системный ответ RNAi (минимальная длина для эффективных системных RNAi у C. elegans составляет от 50 до 100 bp) [30], [31]. У насекомых мало что известно о требованиях к длине дцРНК.Хотя Drosophila не обнаруживает устойчивого системного ответа РНКи [24], Drosophila S2 клетки (которые обладают гемоцитоподобными свойствами) могут эффективно захватывать длинные dsRNAs [32]. Однако короткие dsRNA и siRNAs не захватываются клетками S2 без помощи реагента для трансфекции [33], что отражает сходную тенденцию у C. elegans . У насекомых, не находящихся в условиях культивирования клеток S2, диапазон размеров эффективной дцРНК полностью не исследован. В большинстве сообщений о РНКи используются длинные дцРНК, хотя имеется ограниченное количество сообщений об успешном использовании миРНК у насекомых (включая гороховую тлю и термитов) [34], [35].

Для проверки требований к размеру дцРНК в Tribolium, мы вводили длинные дцРНК или миРНК, соответствующие EGFP , в трансгенную линию pu11 [15], [36]. pu11 экспрессирует вариант EGFP в нервной системе первых личиночных возрастов, в крыльевых дисках и глазах личинок на последней личиночной стадии, а также в глазах и крыльях на стадии куколки (Рисунок 1 B. См. также раздел анализа флуоресценции EGFP в Методы). Когда длинная дцРНК (520 п.н.) вводилась личинкам последнего возраста, эффективный нокдаун EGFP наблюдался у 100% особей как на личиночной, так и на стадии куколки (n = 29) (рисунок 1 C, таблица S1.Данные для стадий куколки не показаны). Однако, когда использовалась миРНК (21 п.н.) (сайленсирующая РНК, Ambion), соответствующая EGFP , нормальные уровни экспрессии EGFP наблюдались у каждого инъецированного человека (n = 28) (рисунок 1 E, таблица S1), что позволяет предположить, что siRNA недостаточно для индукции системного ответа РНКи на личиночной стадии у Tribolium .

Рис. 1. Влияние размера дцРНК на эффективность нокдауна РНКи.

(A) Расположение дцРНК EGFP относительно гена EGFP .Зеленый: полноразмерный ген EGFP (за вычетом некодирующей части). Красный: длинная дцРНК (520 п.н.). Пурпурный: промежуточная дцРНК (69 п.н.). Синий: короткая дцРНК (30/31 п.н.). (B) Неинъектированные личинки pu11 Tribolium . (C-H) pu11 Личинкам Tribolium инъецировали дцРНК или миРНК EGFP . (C) дцРНК 520 п.н. (D) дцРНК 69 п.н. (E) миРНК 21 п.н. (F) дцРНК 31 п.н. (142–172 п.н.). (G) Две дцРНК 31 п.н. (H) Восемь дцРНК ∼30 п.н. (I, J) pu11 Личинкам Tribolium инъецировали в эмбрионы дцРНК EGFP .(I) верхние личинки; неинъектированные, средние личинки; инъецировали восемь дцРНК размером ~ 30 п.н., нижние личинки; инъецировали дцРНК 520 п.н. (J) Изображение (I) при световой микроскопии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047431.g001

Для дальнейшего определения длины дцРНК, необходимой для достижения эффективного нокдауна EGFP, мы синтезировали дцРНК промежуточной длины (69 п.н.) и короткую дцРНК (31 п.н. ). Наши результаты показывают, что фрагмент длиной 69 п.н. был эффективен в подавлении EGFP у всех людей (n = 8) (рисунок 1 D, таблица S1), в то время как фрагмент 31 п.н. — нет (n = 20) (рисунок 1 F, таблица S1). .Результаты инъекций siRNA и 31 bp dsRNA предполагают, что короткие dsRNA не распознаются эффективно клеточным механизмом захвата dsRNA и поэтому нелегко встраиваются в клетку, вызывая более слабый системный ответ RNAi. Однако известно, что не все siRNA одинаково эффективны [37], [38], поэтому может быть специфическая последовательность, а не размер, который вызвал разницу в эффективности ответа RNAi.

Чтобы определить, является ли неэффективность коротких дцРНК из-за отсутствия разнообразия последовательностей, мы увеличили разнообразие последовательностей, синтезируя вторую дцРНК длиной 31 п.н. и одновременно вводя два фрагмента дцРНК размером 31 п.н.Вместе две дцРНК размером 31 п.н. покрывают почти всю область EGFP , на которую нацелен эффективный фрагмент размером 69 п.н. (Рисунок 1 A). Однако эти два фрагмента также были неспособны подавить экспрессию EGFP, поскольку зеленая флуоресценция все еще наблюдалась у 100% людей (n = 19) (рис. 1 G, таблица S1). Для дальнейшего увеличения разнообразия последовательностей мы синтезировали восемь перекрывающихся дцРНК размером ~ 30 п.н., охватывающих 100 п.н. кодирующей области EGFP (рис. 1 A). Таким образом, мы смогли резко увеличить разнообразие последовательностей без увеличения длины дцРНК.Когда эти восемь фрагментов дцРНК размером ~ 30 п.н. были введены в личинок Tribolium (n = 21), они все еще не смогли подавить EGFP (рис. 1 H, таблица S1), что позволяет предположить, что отсутствие разнообразия последовательностей вызывает неэффективность. Чтобы определить, является ли неэффективный ответ РНКи следствием неэффективного поглощения клетками, мы инъецировали восемь фрагментов размером ~ 30 п.н. в эмбрионы Tribolium на стадии синцитиальной бластодермы. На этой стадии эмбриогенеза клеточные мембраны еще не сформированы вокруг множества ядер, и поэтому дцРНК вводится непосредственно в клетку.После вылупления личинок из яиц наблюдали за экспрессией EGFP в нервной системе. Мы обнаружили, что восемь фрагментов размером ~ 30 п.н. были способны подавлять экспрессию EGFP при инъекции непосредственно в яйцо, поскольку 89% вылупившихся личинок не показали экспрессии EGFP (n = 16) (Рисунок 1 I, Таблица S1). Эти данные подтверждают идею о том, что малые дцРНК неэффективны на многоклеточных стадиях в Tribolium , потому что они не могут быть поглощены клетками.

Концентрация дцРНК

Чтобы определить, какие концентрации дцРНК эффективны в Tribolium , мы выполнили серийное разведение (от 1 мкг / мкл) дцРНК EGFP (520 п.н.) и вводили дцРНК личинкам pu11 (рис. 2 A).Мы увидели полное отсутствие экспрессии EGFP у всех людей, которым вводили такую ​​низкую концентрацию, как 0,001 мкг / мкл (1000-кратное разведение) (рис. 2 A1, A2, таблица S2). При концентрации 0,0001 мкг / мкл (10000-кратное разведение) экспрессия EGFP была снижена, но все еще видна (рис. 2 A3, таблица S2), а при концентрации 0,00001 мкг / мкл (100000-кратное разведение) экспрессия EGFP оказалась сопоставимой с дикой -типа (Рисунок 2 A4, Таблица S2).

Рис. 2. Влияние концентрации дцРНК на эффективность нокдауна РНКи.

(A) Серия разведений по массе из 520 п.н. EGFP дцРНК, введенных личинкам pu11 Tribolium . (1) 0,01 мкг / мкл. (2) 0,001 мкг / мкл. (3) 0,0001 мкг / мкл. (4) 0,00001 мкг / мкл. (B) Серия разведений массы 69 п.н. EGFP дцРНК, инъецированная личинкам pu11 Tribolium . (1) 0,01 мкг / мкл. (2) 0,001 мкг / мкл. (3) 0,0001 мкг / мкл. (4) 0,00001 мкг / мкл. (C) Серия молярных разведений 520 п.н. EGFP дцРНК, введенных личинкам pu11 Tribolium . (1) ∼0,07 мкг / мкл.(2) ∼0,007 мкг / мкл. (3) ∼0,0007 мкг / мкл (4) ∼0,00007 мкг / мкл. (D) Серия разведений массы 520 п.н. EGFP дцРНК, введенных в тубулин личинок EGFP Tribolium . (1) 0,01 мкг / мкл. (2) 0,001 мкг / мкл. (3) 0,0001 мкг / мкл. (4) 0,00001 мкг / мкл.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047431.g002

Затем мы спросили, влияет ли длина введенной дцРНК на эффективность нокдауна EGFP при низких концентрациях. Мы выполнили серийное разведение (от 1 мкг / мкл) дцРНК EGFP (69 п.н.) (рис. 2В), так как это была протестированная нами дцРНК самого короткого размера, которая эффективно работала при более высокой концентрации.Как видно из 520 п.н. дцРНК, дцРНК из 69 п.н. приводила к полному отсутствию экспрессии EGFP у большинства людей при такой низкой концентрации, как 0,001 мкг / мкл (1000-кратное разведение) (рис. 2 B1, B2, таблица S2). Однако при 0,0001 мкг / мкл (10 000-кратное разведение) экспрессия EGFP у 100% людей оказалась сопоставимой с нормальными уровнями (рис. 2 B3, таблица S2). Это предполагает, что дцРНК размером 69 п.н. может быть немного менее эффективной, чем более длинный фрагмент 520 п.о., хотя необходимо проводить более мелкие разведения, чтобы определить, при какой концентрации фрагмент в 69 п.н. начинает терять эффективность.

Описанные выше разведения были рассчитаны на основе веса дцРНК. Более длинная дцРНК весит больше на молекулу, чем более короткая дцРНК. Следовательно, когда серийные разведения основаны на весе, разведения более длинной дцРНК будут иметь меньше исходных молекул дцРНК, чем разведения более короткой дцРНК. Однако в пути РНКи дцРНК расщепляется на миРНК, которые являются функциональными единицами, которые связываются с сообщением-мишенью. Одна более длинная молекула дцРНК даст больше миРНК, чем более короткая молекула дцРНК.Следовательно, когда расчеты основаны на весе, начальное количество молекул дцРНК будет отличаться для дцРНК 520 и 69 пар оснований, но конечное количество миРНК должно быть приблизительно эквивалентным.

Мы задались вопросом, является ли количество введенных молекул дцРНК или количество продуцируемых миРНК определяет эффективность РНКи. Если эффективность системного ответа РНКи определяется эффективностью клеточного захвата дцРНК, то количество молекул дцРНК, а не количество продуцируемых миРНК, может быть более важным.Чтобы ответить на этот вопрос, мы выполнили серию молярных разведений дцРНК EGFP размером 520 п.н. (рис. 2С), так что количество исходных молекул в каждом разведении было эквивалентно серии разведений дцРНК 69 п.н., описанной выше (рис. 2В). . В этой серии разведений количество инъецированных молекул дцРНК 520 п.н. и 69 п.н. было одинаковым, но было больше миРНК, продуцируемых в каждом из разведений 520 п.о., потому что фрагмент 520 п.н. длиннее, чем фрагмент 69 п.н. Мы обнаружили, что при выполнении молярного разведения дцРНК 520 п.н. не было экспрессии EGFP ни у одного из инъецированных лиц при 100-кратном, 1000-кратном или 10000-кратном разведении (фигура 2 C1-C3, таблица S2).EGFP не был эффективно снижен, когда дцРНК 520 п.н. разводили в 100000 раз (рис. 2 C4, таблица S2). Поскольку 10000-кратное разведение дцРНК 520 п.н. (рис. 2 C3), но не дцРНК 69 п.н. (рис. 2 B3), смогло подавить EGFP, эффективность РНКи определяется не исходным количеством молекул дцРНК, а количеством миРНК. произведено. Эти данные предполагают, что лимитирующая стадия, влияющая на эффективность ответа РНКи, определяется внутриклеточным механизмом РНКи, а не эффективностью захвата дцРНК.

Приведенные выше данные предоставляют информацию о концентрации дцРНК, необходимой для достижения эффективного нокдауна EGFP в дисках крыльев Tribolium . Однако РНКи не всегда эффективны во всех типах тканей. У Drosophila, известно, что РНКи менее эффективны в имагинальной ткани крыльев [39]. У C. elegans, некоторые нервные ткани невосприимчивы к РНКи из-за экспрессии нуклеазы Eri-1, которая разрушает миРНК [40]. Ранее мы показали, что практически все ткани личинок и куколок Tribolium чувствительны к РНКи при использовании высоких концентраций дцРНК [24].Однако возможно, что не всем тканям требуется одинаковое количество дцРНК. Чтобы определить, требуют ли какие-либо ткани в Tribolium более высокий уровень дцРНК, мы выполнили серийное разведение дцРНК EGFP (520 п.н.) и вводили ее трансгенным жукам, у которых EGFP управляется α-тубулином промотор, вызывающий экспрессию EGFP во всех тканях [41] (Рисунок 2 D). Наши данные предполагают, что все ткани личинок Tribolium одинаково восприимчивы к РНКи, поскольку экспрессия EGFP эффективно снижалась во всех тканях при концентрации 0.001 мкг / мкл у большинства людей (1000-кратное разведение) (рис. 2 D1, D2, таблица S2).

Количественная оценка зависимости размера и концентрации дцРНК с помощью количественной ОТ-ПЦР

Для дальнейшей оценки зависимости размера и концентрации дцРНК в системных РНКи в Tribolium мы использовали количественную ОТ-ПЦР (кПЦР). Мы разработали несколько новых молекул дцРНК EGFP (480 п.н., 60 п.н. и 30 п.н.), чтобы избежать сайта праймера qPCR (рис. 3 A). Эти молекулы дцРНК вводили личинкам последнего возраста в концентрации 1 мкг / мкл с последующим количественным определением мРНК EGFP через пять дней после инъекции (таблица S3).Среди трех тестируемых дцРНК длиной 480 п.н. дцРНК вызывала наиболее эффективный нокдаун, демонстрируя более чем 90% снижение уровня мРНК EGFP по сравнению с контрольными образцами, инъецированными дцРНК dsRed (рис. 3 B). ДцРНК размером 60 п.н. индуцировала умеренный уровень нокдауна (снижение на 70%), тогда как дцРНК из 30 п.н. была наименее эффективной (снижение на 30%). Эти данные предоставляют количественные доказательства зависимости размера дцРНК в системных РНКи у Tribolium , причем более длинная дцРНК более эффективна для запуска системных РНКи.

Рисунок 3. Уменьшение мРНК EGFP различными размерами и концентрациями дцРНК EGFP.

(A) Расположение дцРНК EGFP и ампликона кПЦР относительно гена EGFP . (B) Снижение мРНК EGFP, индуцированное различными размерами дцРНК EGFP . (C) Восстановление мРНК EGFP , индуцированное различными концентрациями дцРНК EGFP 480 п.н. (D) Восстановление мРНК EGFP , индуцированное различными концентрациями дцРНК EGFP 60 п.н.Стрелки в C и D указывают потенциальную пороговую концентрацию для индукции эффективных РНКи.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047431.g003

Мы также протестировали химерную дцРНК, которая состоит из дцРНК EGFP длиной 30 п.н. дополнительные 30 п.н. Ultrabithorax ( Ubx ) дцРНК. Ubx кодирует фактор транскрипции [42] и не имеет какой-либо гомологии с геном EGFP .Следовательно, эта химерная дцРНК длиннее (60 п.н.) по сравнению с дцРНК из 30 п.н. EGFP без увеличения разнообразия последовательностей для части, важной для индукции РНКи EGFP . Инъекция этой химерной дцРНК вызвала значительное снижение мРНК EGFP , достигнув более 80% снижения (ср. 30% снижение с 30 п.н. дцРНК) (рис. 3 B). Этот результат явно исключает возможность того, что отсутствие разнообразия последовательностей привело к тому, что короткие dsRNAs были неэффективными триггерами ответа RNAi, поскольку та же последовательность 30 bp может запускать эффективные RNAi, когда длина dsRNA увеличивается.Следовательно, малые дцРНК менее эффективны для запуска системных РНКи, скорее всего, из-за неэффективного поглощения клетками в Tribolium .

Зависимость концентрации дцРНК в системных РНКи была также подтверждена с помощью количественной ПЦР. Последовательное разведение (от 1 мкг / мкл) дцРНК EGFP (480 п.н.) вызывало постепенное снижение эффективности РНКи (от 90% при 1 мкг / мкл до 10% при 10000-кратном разбавлении. Рисунок 3 C), поэтому КПЦР обеспечила лучшую визуализацию зависимости концентрации дцРНК в системном ответе РНКи.Мы также заметили, что, по-видимому, наблюдается большее снижение эффективности РНКи между 100-кратными и 1000-кратными разведениями по сравнению с другими разведениями, что может означать потенциальный пороговый эффект в дополнение к постепенному снижению эффективности РНКи (стрелка на рисунке 3 C). Результаты серийного разведения с использованием дцРНК EGFP меньшего размера (60 п.н.) согласовывались с результатами дцРНК 480 п.н. Наблюдалось постепенное снижение эффективности РНКи, хотя и меньшая общая эффективность РНКи, возможно, из-за более короткой длины дцРНК (рис. 3 D).Взятые вместе, эти данные предоставляют дополнительные доказательства того, что эффективность системных РНКи в Tribolium зависит от концентрации исходной дцРНК.

Стоит отметить, что потенциальная пороговая точка серийного разведения дцРНК 60 п.н. (стрелка на рисунке 3 D) соответствует таковой для серийного разведения дцРНК 480 п.н. (стрелка на рисунке 3 C), причем оба значения находятся между 100-кратным и 1000-кратные разведения. Как упоминалось ранее, эти разведения были рассчитаны на основе веса дцРНК.Следовательно, начальное количество молекул дцРНК будет отличаться для дцРНК 480 и 60 п.н., но конечное количество siRNA должно быть приблизительно эквивалентным. Тот факт, что потенциальные пороговые точки для дцРНК размером 480 и 60 п.о. совпадают при расчете на основе веса дцРНК, дает дополнительное свидетельство того, что количество продуцируемых миРНК (а не начальное количество предоставленных молекул дцРНК) определяет эффективность РНКи.

Продолжительность эффекта РНКи

Продолжительность эффекта РНКи варьируется у организмов, которые проявляют системный ответ РНКи.Эффект РНКи может исчезнуть по мере истощения дцРНК, если дцРНК не экспрессируется постоянно в клетке, не поддерживается клеткой или не поступает в организм постоянно посредством непрерывного кормления, замачивания или множественных инъекций [30], [43]. Было идентифицировано несколько процессов, влияющих на продолжительность эффекта РНКи. Один из процессов — образование гетерохроматина под действием миРНК. У C. elegans siRNA не только вызывает посттранскрипционное молчание, но также вызывает транскрипционное молчание, делая неактивным статус хроматина целевого гена [44].Эта модификация хроматина, возможно, вызывает длительный эффект РНКи даже после истощения триггерной дцРНК. Другой процесс, который может влиять на продолжительность эффекта РНКи, — это поддержание молекул дцРНК in vivo . Хотя молекулярный механизм этого процесса еще предстоит определить, было показано, что введенная дцРНК, по-видимому, сохраняется даже через несколько недель после инъекции у медоносных пчел [17]. Третий механизм, который может влиять на продолжительность РНКи, — это амплификация молекул дцРНК.У растений и C. elegans, дцРНК, предоставленная клетке, может быть амплифицирована под действием РНК-зависимых РНК-полимераз (RdRP) [45] — [48]. Этот механизм амплификации использует мРНК в качестве матрицы для синтеза большего количества дцРНК, тем самым увеличивая количество дцРНК, доступной для пути РНКи. Было высказано предположение, что механизм амплификации необходим для организмов, которые проявляют пролонгированный эффект РНКи [43]. Однако доступные скрининги генома не смогли идентифицировать RdRPs у большинства многоклеточных животных, включая насекомых [49], [50].Следовательно, если метод амплификации существует в Tribolium, , он должен осуществляться через другой механизм.

Независимо от того, существует ли метод амплификации в Tribolium, эффект РНКи, по-видимому, является долгоживущим. Хотя это наблюдение было сделано анекдотично, продолжительность не была изучена количественно.

Чтобы определить, влияет ли концентрация на продолжительность РНКи, мы вводили дцРНК 520 п.н. для EGFP в двух разных концентрациях (0.01 мкг / мкл и 1 мкг / мкл) личинок pu11 и еженедельно отслеживали их возвращение экспрессии EGFP (рис. 4). Мы отслеживали экспрессию EGFP во взрослом глазу, а не в крыльях, поскольку экспрессия крылового EGFP исчезает после созревания крыльев. При более низкой концентрации экспрессия EGFP впервые была обнаружена в некоторых, но не во всех омматидиях некоторых людей через 98 дней после инъекции (n = 15) (рис. 4 A, 4C, таблица S4). К 175 дню все люди демонстрировали экспрессию EGFP в некоторых омматидиях (n = 14) (рис. 4А, 4С, таблица S4).При высокой концентрации экспрессия EGFP не возвращалась ни у одного человека в течение 175 дней, за которыми они наблюдались (n = 11) (Рисунок 4 A, 4B, Таблица S4). Эти данные предполагают, что концентрация дцРНК действительно влияет на продолжительность эффекта РНКи в Tribolium , при этом более высокие концентрации дцРНК более эффективны.

Рис. 4. Влияние размера и концентрации дцРНК на продолжительность эффекта РНКи.

(A) Линейный график, показывающий процент лиц, экспрессирующих EGFP, после инъекции EGFP дцРНК в трех различных условиях.(B) pu11 Tribolium , инъецированный дцРНК 520 bp EGFP в концентрации 1 мкг / мкл. (C) pu11 Tribolium , инъецированный дцРНК 520 bp EGFP в концентрации 0,01 мкг / мкл. (D) pu11 Tribolium , инъецированный дцРНК EGFP 69 п.н. в концентрации 0,01 мкг / мкл. Звездочка указывает на то, что экспрессия EGFP в первый день была обнаружена в глазу взрослого человека.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047431.g004

Чтобы определить, влияет ли размер дцРНК на продолжительность эффекта РНКи, мы сравнили людей, которым инъецировали либо фрагмент размером 69 п.н., либо 520 п.н. при концентрации 0.01 мкг / мкл (что должно дать примерно такое же количество миРНК) (рис. 4). Как упоминалось выше, при использовании фрагмента дцРНК размером 520 п.н. в концентрации 0,01 мкг / мкл первый человек начал проявлять экспрессию EGFP в некоторых омматидиях на 98 день (n = 15) (рис. 4 A, 4C, таблица S4). . Напротив, у лиц, которым инъецировали фрагмент размером 69 п.н. в концентрации 0,01 мкг / мкл, экспрессия EGFP впервые наблюдалась в некоторых омматидиях через 28 дней после инъекции (n = 8) (рис. 4 A, 4D, таблица S4).Все люди в этой группе экспрессировали EGFP к 77-му дню (n = 7) (рис. 4 A, 4D, таблица S4). Эти данные предполагают, что размер также влияет на продолжительность эффекта РНКи в Tribolium , при этом более длинные фрагменты увеличивают продолжительность.

Конкурс дцРНК

Иногда эксперименты требуют нокдауна нескольких генов. В этих ситуациях комбинаторная доставка дцРНК может использоваться для устранения функции нескольких генов одновременно [51]. Однако исследования показали, что перенасыщение аппарата RNAi может происходить, когда доставляются множественные dsRNA или siRNAs [30], [52] — [54].Это перенасыщение вызывает несколько проблем. Во-первых, поскольку пути miRNA и RNAi имеют общие компоненты, перенасыщение этих компонентов во время ответа RNAi может приводить к непреднамеренному ингибированию пути miRNA, что приводит к фенотипам, связанным с потерей функции miRNA. Поскольку miRNAs необходимы для роста, развития и гомеостаза тканей, это ингибирование может привести к летальному исходу [50], [54]. Во-вторых, наличие смеси дцРНК может привести к конкуренции между дцРНК за компоненты механизма РНКи и / или компоненты входа в клетку и транспорта, что приводит к конкурентному ингибированию.Это конкурентное ингибирование приводит к невозможности одновременного отключения нескольких генов [55] — [61]. Было показано, что некоторые миРНК обладают большей конкурентной способностью, чем другие [58], [59], [62]. Следовательно, в зависимости от комбинации используемых дцРНК могут возникать разные уровни конкуренции.

Чтобы определить, при какой концентрации происходит конкурентное ингибирование в Tribolium , мы вводили две дцРНК одновременно личинкам pu11. Одна дцРНК (конкурент) использовалась в более высокой концентрации, а одна дцРНК (репортер) использовалась в более низкой концентрации.Для конкурента мы использовали одну из двух дцРНК, DsRed или Ubx (рис. 5). Мы решили использовать эти дцРНК в качестве конкурентов по нескольким причинам. Во-первых, поскольку некоторые siRNA могут обладать большей конкурентной силой, чем другие, возможно, что мы увидим разные результаты при использовании двух разных конкурентов dsRNA. Во-вторых, возможно, что наличие мишеней мРНК может повлиять на уровень конкуренции. Экспрессия DsRed у жуков pu11 отсутствует, что позволяет нам проверить уровень конкуренции, когда конкурентом является экзогенная дцРНК без мРНК-мишени. Ubx экспрессируется в заднем крыле жука, но не в переднем [42]. Следовательно, в одном диске крыла у конкурента будет комплементарная мишень мРНК, а в другом диске — нет. Если наличие цели влияет на уровень конкуренции, мы можем увидеть различия между двумя крыльевыми дисками. И в-третьих, Ubx дает очень отчетливый фенотип крыла [42], позволяющий нам оценить, эффективен ли конкурент Ubx в подавлении регуляции Ubx . В обоих случаях (эксперименты с DsRed и Ubx ) в качестве репортерного гена используется EGFP .Контролируя экспрессию EGFP в крыле, мы можем определить, предотвращает ли конкурент ( DsRed или Ubx ) нокдаун EGFP.

Рис. 5. Влияние конкуренции дцРНК на эффективность нокдауна РНКи.

(A) Конкурентная дцРНК, вводимая отдельно. (1) DsRed dsRNA. (2) Ubx дцРНК. (B) Конкурентная и репортерная дцРНК вводили совместно в соотношении 10: 1. (1) DsRed dsRNA, введенная из расчета 1 мкг / мкл (конкурент). EGFP дцРНК, введенная в 0.1 мкг / мкл (репортер). (2) Ubx, дцРНК, инъецированная в дозе 1 мкг / мкл (конкурент). EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,1 мкг / мкл (репортер). (C) Конкурентная и репортерная дцРНК вводили совместно в соотношении 100: 1. (1) DsRed dsRNA, введенная из расчета 1 мкг / мкл (конкурент). EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,01 мкг / мкл (репортер). (2) Ubx, дцРНК, инъецированная в дозе 1 мкг / мкл (конкурент). EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,01 мкг / мкл (репортер). (D) Конкурентная и репортерная дцРНК вводили последовательно в соотношении 100: 1.(1) DsRed dsRNA, введенная из расчета 1 мкг / мкл (конкурент). EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,01 мкг / мкл (репортер). (2) Ubx, дцРНК, инъецированная в дозе 1 мкг / мкл (конкурент). EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,01 мкг / мкл (репортер). (E) DsRed dsRNA или DsRed dsDNA используются в качестве нуклеиновой кислоты конкурента. EGFP дцРНК вводится совместно в качестве репортера. Отношение конкурента к репортеру составляет 100: 1. (1) DsRed дцРНК, вводимая в дозе 1 мкг / мкл. EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,01 мкг / мкл. (2) DsRed dsDNA, введенная из расчета 1 мкг / мкл. EGFP дцРНК вводили в концентрации 0,01 мкг / мкл.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0047431.g005

Когда дцРНК конкурента вводили в концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию дцРНК EGFP , мы не наблюдали конкуренции на уровне, который приводил бы к неэффективному нокдауну EGFP, поскольку экспрессия EGFP была эффективно снижена у 100% людей (n = 23 и n = 17) (рисунок 5 B, таблица S5).Напротив, когда мы вводили дцРНК конкурента в концентрации, в 100 раз превышающей концентрацию EGFP и дцРНК, мы действительно наблюдали конкуренцию, которая приводила к неэффективному нокдауну EGFP у некоторых людей (n = 18 и n = 10) (Рисунок 5 C, Таблица S5. ). Тот же результат был получен, когда в качестве конкурента использовался либо dsRed , либо Ubx , и не было никакой разницы между экспрессией EGFP в двух крыльевых дисках в эксперименте Ubx . Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что наличие мишеней мРНК не влияет на уровень конкуренции.

Конкуренция между дцРНК может происходить на нескольких уровнях. Это может происходить во время клеточного поглощения и транспорта дцРНК или может происходить во время процессинга дцРНК и замалчивания мРНК. Мы рассудили, что если конкуренция происходит на уровне захвата дцРНК, последовательная инъекция конкурирующей дцРНК и репортерной дцРНК может снизить уровень конкуренции. Мы вводили дцРНК либо для dsRed , либо для Ubx , ждали два дня, а затем вводили дцРНК для EGFP .Когда эта задержка была введена между инъекцией дцРНК конкурента и дцРНК EGFP , мы больше не видели конкуренции, которая приводила к неэффективному нокдауну EGFP у любого человека (n = 11 и n = 19) (Рисунок 5 D, Таблица S5). , даже при концентрации в 100 раз выше. Эти данные показывают, что последовательная инъекция может уменьшить количество конкуренции, которая происходит между дцРНК, предполагая, что конкуренция может иметь место, когда дцРНК проникает в клетку.

Механизм захвата дцРНК у насекомых в настоящее время неизвестен.Недавно было показано, что введенная дцДНК может эффективно поглощаться клетками и временно экспрессироваться по крайней мере у одного насекомого [63]. Мы предположили, что методы поглощения дцРНК и дцДНК могут быть связаны. Если захват всех нуклеиновых кислот происходит по одному и тому же механизму и если наблюдаемая нами конкуренция происходит на уровне захвата, то дцДНК может конкурировать с дцРНК. Чтобы проверить эту гипотезу, мы совместно вводили дцДНК для dsRed и дцРНК для EGFP личинкам pu11.Концентрация дцДНК была в 100 раз выше, чем дцРНК. На этом уровне концентрации при совместной инъекции двух дцРНК возникает конкуренция (рисунок 5 E1, таблица S5), что приводит к неэффективному нокдауну EGFP. Напротив, когда использовалась дцДНК, мы не наблюдали конкуренции ни у одного из инъецированных лиц (n = 29) (рисунок 5 E2, таблица S5). Эти результаты предполагают, что либо механизм транспорта дцРНК специфичен для РНК, либо конкуренция происходит на другом уровне.

Обсуждение

За последнее десятилетие РНКи превратилась в генетический инструмент, который сделал функциональное исследование генов в немодельных системах легкодоступным.Несмотря на то, что идет гонка за определением следующего организма, в котором можно будет использовать РНКи, детали часто упускаются из виду. Учитывая очевидное разнообразие механизмов, лежащих в основе RNAi, оптимальные условия для достижения эффективных RNAi, вероятно, варьируются между видами. Описанная здесь работа предоставляет конкретные данные об основных параметрах РНКи у красного мучного жука, а также побуждает исследователей исследовать эти параметры при планировании экспериментов с РНКи на других организмах.

Размер

дцРНК и системные РНКи в

триболии

Что касается размера дцРНК, мы установили, что длинная дцРНК, по-видимому, является наиболее эффективной в отношении как начального нокдауна, так и продолжительности эффекта РНКи.В то время как дцРНК размером 69 п.н. и 520 п.н. были способны приводить к нокдауну гена, фрагмент 520 п.н. был более эффективным. Наши исследования qPCR также предоставили доказательства того, что длинная дцРНК более эффективна. Возможны несколько объяснений того, почему дцРНК размером 69 п.н. была менее эффективной. Во-первых, хотя дцРНК размером 69 п.н. будет давать такое же количество миРНК (по сравнению с равной массой дцРНК 520 п.н.), типы продуцируемых миРНК будут более ограниченными в отношении последовательности. Следовательно, существует возможность, что более длинная дцРНК более эффективна не потому, что она длиннее, а потому, что она продуцирует большее разнообразие миРНК, некоторые из которых могут быть более эффективными в подавлении молчания, чем ограниченное количество миРНК, продуцируемых более коротким фрагментом дцРНК.Другая возможность состоит в том, что хотя дцРНК размером 69 п.н. наиболее гарантированно захватывается клеткой, эффективность этого захвата может быть не такой высокой, что приводит к меньшему количеству миРНК, доступных для сайленсинга. Наконец, если механизм амплификации или хранения дцРНК происходит в Tribolium , на эти процессы также может влиять размер дцРНК.

В то время как дцРНК размером 60 п.н. и более действительно приводила к нокдауну гена, меньшие дцРНК (30, 31 и 21 п.н.) были неэффективны в подавлении гена при инъекции в Tribolium на многоклеточной стадии.Наши данные ясно показывают, что это связано с неэффективным захватом более коротких фрагментов дцРНК. Данные для клеток C. elegans и Drosophila S2 подтверждают эту гипотезу [10], [28] — [31]. Интересно отметить, что использование миРНК эффективно привело к нокдауну генов у гороховой тли [34], термитов [35] и паутинных клещей [64], что может свидетельствовать о том, что клетки насекомых разных видов могут распознавать и / или поглощать дцРНК в различные пути. Альтернативное объяснение состоит в том, что образцы миРНК содержали смесь длинных дцРНК и миРНК, поскольку миРНК были получены из длинной дцРНК, расщепленной in vitro ферментом Dicer в этом эксперименте [34], [35].

Ранее мы сообщали, что даже дцРНК размером 31 п.н. способна запускать системный ответ РНКи в Tribolium [15]. Однако мы обнаружили, что это было связано с загрязнением более длинных молекул дцРНК. Создавая матричную ДНК с помощью ПЦР для синтеза дцРНК, мы заметили, что праймер, который мы использовали, связывается со вторичным сайтом, производя более длинную матричную ДНК, чем мы предполагали. Последовательный синтез дцРНК с использованием этой матричной ДНК продуцировал молекулы дцРНК длиной более 50 п.н. в дополнение к предполагаемым молекулам 31 п.н.Мы использовали de novo синтезированную ДНК-матрицу, чтобы избежать этой проблемы в этом исследовании (см. «Материалы и методы»), и получили другой результат (исправление будет представлено).

Продолжительность системного ответа РНКи в

Триболии

Мы заметили, что размер дцРНК, по-видимому, более решительно влияет на продолжительность РНКи, чем на начальную эффективность РНКи. Например, когда фрагмент размером 69 п.н. использовали в концентрации 0,01 мкг / мкл, первый человек начал экспрессировать EGFP через 28 дней после инъекции.Напротив, это заняло 98 дней с дцРНК 520 п.н. при той же концентрации. Этот результат может указывать на зависящий от длины механизм поддержания или амплификации дцРНК у жуков.

В C. elegans амплификация с помощью RdRP является важным шагом для достижения любого эффекта РНКи [46], [47]. Поэтому было высказано предположение, что механизм амплификации необходим для всех организмов, которые проявляют пролонгированный эффект РНКи. Однако не только RdRPs не были обнаружены у насекомых [50], но также было показано, что РНКи, специфичные для изоформ, могут выполняться в Tribolium [65], предполагая, что амплификации с использованием эндогенной мРНК в качестве матрицы не происходит.Остается возможность того, что амплификация происходит посредством другого механизма (возможно, с использованием дцРНК в качестве матрицы, поскольку это по-прежнему позволяет использовать РНКи, специфичные для изоформ). Однако амплификация может не потребоваться для достижения эффективного длительного эффекта РНКи. Возможно, что насекомые с сильным системным эффектом РНКи просто обладают способностью эффективно поглощать и / или хранить дцРНК. В Tribolium эффективность РНКи, по-видимому, хорошо коррелирует с начальной дозой введенных молекул дцРНК (т.е.е. количество первоначально введенных молекул дцРНК определяет степень эффекта РНКи. См., Например, дополнительный рисунок 4 в [66]). Дозозависимая РНКи с меньшей вероятностью будет наблюдаться, если начальные триггеры РНКи будут амплифицированы, что также подтверждает идею об отсутствии надежного механизма амплификации в Tribolium .

Хотя механизм продолжительности РНКи в Tribolium не был определен, мы смогли показать, что когда дцРНК вводится на последней стадии личинки, эффект может длиться в течение многих месяцев, возможно, даже в течение всей продолжительности жизни особи.Также было показано, что родительские РНКи (в которых куколкам женского пола или взрослым особям вводят дцРНК, и эффект наблюдается у потомства) также могут быть эффективны в течение нескольких месяцев [14], указывая на чрезвычайно эффективный ответ РНКи. Однако родительская РНКи оказывается менее эффективной, когда личинкам последнего возраста вводят дцРНК (данные не показаны. Общность этой тенденции требует дальнейшего подтверждения). Одно из объяснений этого состоит в том, что женские репродуктивные органы не завершают формирование до стадии куколки.Возможно, для того, чтобы ооциты могли эффективно поглощать дцРНК, они должны образоваться во время введения дцРНК в полость тела. Если это правда, мы можем ожидать, что эффект РНКи будет длиться дольше в сформировавшейся ткани и менее эффективен в ткани, которая постоянно переворачивается.

У C. elegans РНКи могут иногда существовать более чем в одном поколении за счет ремоделирования хроматина [44], [67]. Длительный эффект РНКи в Tribolium может указывать на аналогичный тип эпигенетического контроля.Однако эффект РНКи в Tribolium , по-видимому, не является постоянным, поскольку экспрессия EGFP в конечном итоге вернулась после инъекции дцРНК EGFP , предполагая, что длительный эффект РНКи в Tribolium не вызван эпигенетическим контролем.

В дополнение к данным о влиянии размера и концентрации дцРНК на продолжительность РНКи, эксперименты с продолжительностью выявили несколько других интересных наблюдений. Когда эффект РНКи исчезает у взрослого, экспрессия EGFP, по-видимому, возвращает по одному омматидию за раз в виде мозаичного рисунка на поверхности глаза.В процессе, который занимает недели (или даже месяцы), все больше и больше омматидий начинают экспрессировать EGFP, пока EGFP в глазу не достигнет уровней дикого типа. Характер возврата EGFP предполагает, что, по крайней мере, в глазу, RNAi действует клеточно автономно. Кроме того, мы также заметили огромные различия во времени, необходимом для возврата EGFP в одной экспериментальной группе. Например, когда фрагмент размером 69 п.н. использовали в концентрации 0,01 мкг / мкл, первый человек начал экспрессировать EGFP через 28 дней после инъекции.Однако EGFP не наблюдался у всех людей до 77 дней после инъекции. Эти различия, вероятно, представляют собой небольшие различия в объеме инъекции между людьми, но также могут отражать различия в месте инъекции (расстояние от глаза) или в способности отдельного жука поглощать, хранить или амплифицировать дцРНК.

Применимость к другим генам

Важно отметить, что в отношении параметров, протестированных в этом исследовании, результаты, вероятно, зависят от гена.Например, экспрессия EGFP была удалена с концентрацией всего 0,001 мкг / мкл, что может быть неэффективным для истощения экспрессии других генов. В наших лабораториях эксперименты по РНКи, которые должны привести к полному нокдауну гена, обычно проводятся с концентрациями дцРНК, варьирующимися от 1 до 4 мкг / мкл. Ранее мы показали, что Ubx РНКи на личиночной стадии также обнаруживают зависимость концентрации дцРНК в Tribolium [66]. Кроме того, мы протестировали несколько разных размеров молекул дцРНК для Ubx (480 п.н., 60 п.н. и 30 п.н.) и увидели, что эффективность РНКи Ubx также зависит от длины дцРНК (данные не показаны).Следовательно, хотя точный размер и требуемая концентрация дцРНК, а также точное количество дней, в течение которых будет действовать эффект, вероятно, будут различаться для разных генов, мы ожидаем, что тенденции останутся такими же; более длинные дцРНК и более высокие концентрации дцРНК должны приводить к более эффективному нокдауну гена и более длительной продолжительности нокдауна.

В этом исследовании мы сосредоточили наш анализ на экспрессии EGFP . Экзогенная природа гена EGFP дает нам менее предвзятый взгляд на то, как параметры, относящиеся к молекулам дцРНК, влияют на эффективность РНКи, поскольку на экспрессию EGFP не влияют сложные эндогенные регуляторные сети генов (такие как положительные или отрицательные обратные связи) или другие посттранскрипционные правила (например, альтернативный сплайсинг).

Таким образом, результаты нашего исследования параметров, влияющих на эффективность РНКи, с использованием EGFP в качестве модели, вероятно, будут применимы к другим генам.

Конкуренция дцРНК в триболии

Поскольку для захвата, транспорта и процессинга дцРНК требуются конечные клеточные компоненты и белки, конкуренция за эти компоненты будет происходить на определенном уровне. Вопрос в том, какой уровень наиболее чувствителен к перенасыщению.Как только дцРНК вводится индивиду, дцРНК, которая не попадает в клетки, предположительно выводится из организма. Следовательно, захват дцРНК должен происходить относительно быстро. Однако продолжительность эффекта РНКи предполагает, что молчание мРНК происходит в течение длительного периода времени. Следовательно, тот факт, что последовательная инъекция нескольких дцРНК, по-видимому, снижает уровень конкуренции, предполагает, что конкуренция, наблюдаемая в нашем анализе, происходит на уровне захвата дцРНК (хотя конкуренция на уровне механизма также может происходить в определенных соотношениях).Независимо от стадии, на которой происходит конкуренция, наши данные показывают, что при определенных соотношениях комбинаторная доставка дцРНК может привести к конкурентному ингибированию. Поскольку конкурентная сила может варьироваться между дцРНК, это соотношение может варьироваться в зависимости от комбинации используемых дцРНК.

Наши конкурентные эксперименты не показали заметного влияния на путь miRNA. miRNAs необходимы для роста и развития и, как известно, необходимы для метаморфоза у насекомых [68].Кроме того, мы показали, что нокдаун Tc-Argonaute-1 (важный компонент аппарата miRNA) приводит к летальности личинок [50]. Однако мы никогда не наблюдали летальности или фенотипов развития, указывающих на нарушение пути miRNA из-за перенасыщения компонентов пути miRNA. Более высокие концентрации дцРНК могут потребоваться для ингибирования пути miRNA в Tribolium . Также возможно, что ингибирование miRNA за счет перенасыщения аппарата RNAi может быть более трудным для достижения в Tribolium из-за субфункционализации компонентов аппарата.И Drosophila , и Tribolium , по-видимому, имеют белки, такие как Argonaute-1 и Argonatue-2, которые дублированы и субфункциональны, так что один белок участвует в пути miRNA, а другой — в пути RNAi [69]. . Следовательно, не исключено, что у этих насекомых случайное ингибирование пути miRNA может происходить реже.

Методы

Штаммы жуков

В этих исследованиях использовали две трансгенные линии жуков.Жуки pu11 [15], [36] представляют собой линию энхансеров-ловушек, в которой вариант EGFP экспрессируется в нервной системе личинок первого возраста, в глазах и крыльевых дисках личинок последнего возраста, в глазах и крыльях куколок и в глазах взрослых. Хотя эта линия опубликована как линия-ловушка энхансера, которая экспрессирует EGFP [36], мы недавно обнаружили, что она фактически экспрессирует один из вариантов EGFP (EYFP) вместо EGFP. Существует всего семь нуклеотидных различий между генами EGFP и EYFP (рисунок S1), и мы подтвердили, что дцРНК для EGFP так же эффективна, как дцРНК для EYFP, для подавления EYFP в pu11 (данные не показаны).AT ¹¹ представляет собой трансгенную линию, в которой EGFP управляется промотором α-тубулина [41]. В линии AT ¹¹ EGFP экспрессируется повсеместно на всех стадиях жизни.

Синтез дцРНК

Приготовление матрицы для синтеза дцРНК Ubx и DsRed для конкурентного эксперимента выполняли с помощью ПЦР. Праймер был разработан против последовательности вектора pCR4-TOPO, фланкирующей сайт вставки, с последовательностью промотора Т7 на 5′-конце, как описано ранее [50], [70].Приготовление матрицы для более длинных фрагментов дцРНК EGFP (520 п.н., 480 п.н., 69 п.н. и 60 п.н.), а также дцРНК dsRed длиной 462 п.н. проводили с помощью ПЦР с использованием прямых и обратных праймеров, специфичных для матричного гена, с промотором Т7. последовательность на их 5′-концах (табл. 1 и 2). Для более коротких фрагментов дцРНК EGFP (30 п.н. и 31 п.н.) матрицу EGFP не использовали. Вместо этого были сконструированы перекрывающиеся праймеры, соответствующие небольшой области кодирующей области EGFP , с промоторной последовательностью Т7 на их 5′-концах (таблица 1).Эти перекрывающиеся праймеры димеризовали в реакционной смеси для ПЦР при 50 ° C в течение 20 минут. Для дцРНК EGFP длиной 30 п.о., использованной для исследования кПЦР, мы использовали синтезированных de novo олигонуклеотидов для получения матрицы дцРНК (таблица 2). Смысловые и антисмысловые олиго, соответствующие первой области 30 п.н. кодирующей области EGFP с промоторной последовательностью Т7 на их 5′-концах, были отожжены для получения двухцепочечной ДНК-матрицы для синтеза дцРНК (95 ° C в течение 30 минут). минут, затем оставили на 1 час при комнатной температуре для отжига).Эти методы синтеза de novo были выбраны, чтобы избежать возможности синтеза более длинной дцРНК, чем предполагалось, из-за связывания праймеров с матрицей неспецифическим образом. Мы также использовали de novo синтезированных олигонуклеотидов для получения химерной матрицы EGFP-Ubx (таблица 2). Из-за длины этих химерных олигонуклеотидов мы использовали сервис IDT Ultremer oligo для обеспечения точности. дцРНК синтезировали с использованием набора MEGAscript T7 High Yield Transcript (Ambion).Приобретали миРНК Silencer GFP (eGFP) (21 п.н.) (Ambion). Информация о точных последовательностях и целевых сайтах этого продукта является конфиденциальной, и нам не удалось получить какую-либо информацию о последовательностях от компании. Однако Ambion ответил на наш запрос и заявил, что этот продукт действительно нацелен на ген EGFP , который мы использовали в этом исследовании. Положительный результат нашей эмбриональной инъекции также свидетельствует о том, что этот продукт является эффективным триггером РНКи EGFP при введении непосредственно внутрь клетки.

Впрыск

Личинок вводили, как описано ранее [15], [70]. Для каждого экспериментального условия 20-40 личинок последнего возраста инъецировали из одного препарата дцРНК (точное количество и выживаемость см. В дополнительных таблицах). Точная стадия определялась размером положительных крыльевых дисков EGFP. Были отобраны личинки, у которых была начальная стадия экспрессии EGFP в крыловом диске, что соответствует 2.5 суткам после финальной линьки. дцРНК вводили в дорсальную сторону первого абдоминального сегмента (А1) в концентрации 1 мкг / мкл, если не указано иное.Каждая личинка может содержать до 0,7 мкл раствора при введении на стадии, описанной выше. Объем, вводимый каждой личинке, рассчитывали путем деления общего объема раствора дцРНК, использованного в одном раунде инъекции, на количество введенных личинок (например, если 8 мкл использовалось для 12 личинок, средний объем, введенный в каждую личинку, составлял 0,67 мкл) . При нашей настройке инъекции мы постоянно вводим 0,6 мкл в каждую личинку (~ 0,6 мкг / личинка с 1 мкг / мкл раствора дцРНК). См. [70] для получения дополнительной информации. Совместную инъекцию восьми фрагментов дцРНК 30 п.н. проводили при общей концентрации 1 мкг / мкл (таким образом, концентрация каждой дцРНК 30 п.н. была равна 0.125 мкг / мкл). Иногда соревновательные эксперименты включали две отдельные инъекции. Вторая инъекция была произведена через 48 часов после первой инъекции. Молярные разведения определяли путем расчета молекулярной массы дцРНК. Для этих расчетов предполагалось, что каждое из нуклеотидных оснований было равно представлено (таким образом, 1000 п.н. дцРНК 0,73 мкг = 1 пмоль). После инъекции личинок выдерживали на культуральной муке при 30 ° C.

Флуоресцентный анализ EGFP

У личинок первой стадии мы сосредоточили наш анализ на экспрессии EGFP в нервной системе из-за его стабильного и надежного уровня экспрессии.Для анализа на последней личиночной стадии мы сосредоточили внимание на экспрессии EGFP крыльевых дисков. Мы исключили экспрессию нервной системы во время последней личиночной стадии из нашего анализа, потому что интенсивность EGFP в нервной системе у жука pu11 во время последней личиночной стадии нестабильна и колеблется. Мы также не оценивали экспрессию EGFP в глазу личинки, поскольку флуоресценция EGFP в глазу, по-видимому, нечувствительна к РНКи на последней стадии личинки. Возможно, это связано с тем, что глаза личинок уже сформированы и содержат приличное количество белков EGFP на момент инъекции.Следовательно, переносимость белка EGFP и / или отсутствие пролиферации клеток в зрелом глазу личинки, возможно, маскируют эффект EGFP РНКи в течение нескольких дней после инъекции. Для анализа на взрослой стадии мы отслеживали экспрессию EGFP в глазу взрослого, а не в крыльях, поскольку экспрессия крылового EGFP исчезает из-за гибели клеток после созревания крыльев.

Для документирования личинок личинки были отсеяны от муки и погружены в воду, что приводит к прекращению движения личинок и, если их удалить из воды в течение нескольких часов, не приводит к летальному исходу.После документирования личинок вынимали из воды и ненадолго сушили на папиросной бумаге перед возвращением в культуральную муку. За личинками наблюдали флуоресценцию через пять дней после первоначальной инъекции с использованием набора фильтров, способного обнаруживать как EGFP, так и EYFP. Куколки были зарегистрированы через 12 дней после первоначальной инъекции личинкам. В продолжительном эксперименте взрослых регистрировали еженедельно. Личинок, куколок и взрослых особей регистрировали с помощью микроскопа Olympus SZX12, оснащенного цифровой камерой Nikon DXM 1200F.Для всех изображений в одном эксперименте использовалось одинаковое время экспозиции.

Количественная RT-PCR

Суммарную РНК выделяли из куколок через 5 дней после инъекции (по две куколки на образец) с использованием автоматической системы выделения РНК Maxwell 16 с набором для очистки Maxwell 16 LEV simplyRNA (Promega). Качество РНК было подтверждено Agilent Bioanalyzer. кДНК синтезировали с использованием iScript Reverse Transcription Supermix для RT-qPCR (Bio-Rad). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием SsoAdvanced SYBR Green Supermix с системой обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Connect (Bio-Rad).Два гена, ген рибосомного белка RPS3e и RPL13a , использовали в качестве эталона для количественного определения ΔΔCq. Последовательности праймеров для эталонных генов, а также для EGFP перечислены в таблице 3. Эффективность амплификации этих праймеров определялась с использованием серийно разведенных образцов кДНК (таблица 3). Все ПЦР проводились в трех экземплярах, и данные анализировались с помощью CFX Manager.

Системный склероз | Склеродермия | Против артрита

В настоящее время нет лекарства от системного склероза.Однако есть лекарства, которые помогают контролировать симптомы и лечить любые осложнения.

Системный склероз может повлиять на организм разными способами. Следовательно, лечение, которое вам понадобится, будет зависеть от того, как это заболевание повлияет на вас.

Вы также можете многое сделать, чтобы помочь контролировать свое состояние, включая регулярные физические упражнения, здоровое питание и регулярный уход за кожей.

Лечение феномена Рейно

Лекарства могут помочь с симптомами феномена Рейно, улучшая кровообращение в руках и ногах.

Существует довольно много доступных лекарств, которые могут оказывать такой эффект, в том числе нифедипин и силденафил, которые можно принимать в виде таблеток. Возможно, вам придется принимать более одного препарата одновременно.

В более тяжелых случаях болезни Рейно, особенно когда есть болезненные язвы, которые не заживают, можно вводить такие препараты, как илопрост, в виде инфузии. Инфузия — это способ капельного введения лекарства в вену, обычно в больнице.

Препараты для лечения феномена Рейно работают, расслабляя кровеносные сосуды и увеличивая приток крови к пальцам рук и ног.Они также будут иметь такой же эффект на кровеносные сосуды в других частях тела. Следовательно, эти препараты могут вызывать побочные эффекты, такие как покраснение кожи, головные боли и отек лодыжек.

Лечение изжоги и затрудненного глотания

Чтобы предотвратить изжогу и затруднения при глотании, ваш врач может порекомендовать антациды — лекарство, которое нейтрализует кислоту, вырабатываемую в желудке.

Обычно они очень эффективны, хотя вам, возможно, придется принимать их в течение нескольких месяцев или лет.

Вам также могут назначить препарат, называемый ингибитором протонной помпы (ИПП), который может снизить количество кислоты, вырабатываемой желудком.

Лечение других проблем, связанных с желудком и пищеварительной системой

Если у вас есть приступы запора и диареи, вздутие живота, усиление ветра и дискомфорт, вам может потребоваться посещение гастроэнтеролога, специализирующегося в этой области.

Некоторые люди также испытывают анальное недержание, что означает, что они не могут должным образом контролировать движения кишечника, поэтому небольшое количество стула выскользнет и может испачкать их одежду.

Это может быть неудобно или неловко, и люди могут не осознавать, что это как-то связано с системным склерозом. Если это случилось с вами, поговорите со своим врачом и попросите направление к гастроэнтерологу.

Иногда в кишечнике развиваются дополнительные бактерии, и это можно лечить с помощью лекарств, например, антибиотиков.

Важно изучить такие симптомы, как диарея и недержание мочи, чтобы убедиться, что у них нет другой причины.

Лечение болезненных и опухших суставов

Обезболивающие и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) должны помочь уменьшить боль и отек суставов.

Более мягкие формы, такие как парацетамол и ибупрофен, можно купить без рецепта в аптеках и супермаркетах. При необходимости врач назначит более сильные обезболивающие и НПВП.

Лечение высокого кровяного давления и почечных осложнений

Люди с системным склерозом иногда могут иметь высокое кровяное давление, также известное как гипертония. Тяжелые случаи могут привести к повреждению почек и нагрузке на сердце.

Это серьезное осложнение, известное как почечный криз системного склероза.Его можно лечить или предотвращать с помощью лекарств, которые помогают контролировать артериальное давление, особенно ингибиторов АПФ.

Лечение легочных и сердечных осложнений

Воспаление в легких можно лечить стероидами или модифицирующими болезнь противоревматическими препаратами (DMARD).

Высокое кровяное давление в легких (легочная гипертензия) — редкое осложнение системного склероза, но вам нужно будет регулярно сдавать анализы, чтобы проверить, насколько хорошо работают ваши легкие и сердце.

При необходимости легочную гипертензию можно лечить специальными препаратами (включая бозентан, амбризентан, силденафил или простациклин), которые улучшают такие симптомы, как одышка.

Другие препараты, которые можно использовать при легочных и сердечных осложнениях, включают:

• стероидные таблетки
• препараты для подавления гиперактивной иммунной системы
• препаратов, применяемых для лечения артериального давления и холестерина.

Стероидные таблетки для лечения системного склероза

Таблетки

Стероиды можно использовать либо на ранних стадиях системного склероза, когда кожа начинает выглядеть опухшей, либо позже, если поражены мышцы или легкие.

Их обычно назначают в низких дозах, потому что высокие дозы могут повысить кровяное давление и увеличить риск проблем с почками.

Таблетки стероидов — это искусственные формы гормона (кортизона), который естественным образом встречается в организме. Их можно использовать для уменьшения отеков.

Иммуносупрессивные препараты для лечения системного склероза

Иммунодепрессанты нацелены на иммунную систему и могут использоваться в более тяжелых случаях системного склероза, особенно при более обширных заболеваниях кожи или легких.

Сюда могут входить препараты, известные как обычные противоревматические препараты, модифицирующие заболевание (DMARD).

Эти препараты, которые снижают эффективность сверхактивной и не срабатывающей иммунной системы, включают метотрексат, циклоспорин, циклофосфамид, микофенолат и азатиоприн.