Диагноз сгм зчмт расшифровка: Закрытая черепно-мозговая травма (ЗЧМТ)

Содержание

Закрытая черепно-мозговая травма (ЗЧМТ)

Содержание:

Симптомы сотрясения головного мозга

Последствия сотрясенияголовного мозга

Лечение сотрясения мозга

К черепно-мозговой травме легкой степени тяжести относятся сотрясение головного мозга и ушиб головного мозга легкой степени тяжести.

Закрытой черепно-мозговой травмой (ЗЧМТ) называется черепно-мозговая травма (ЧМТ), при которой мягкие ткани головы и апоневроз черепа остаются неповрежденными.

Сотрясение головного мозга (СГМ) – легкая форма ЧМТ, для которой характерна кратковременная утрата сознания с формированием посттравматической амнезии и обратимостью функциональных симптомов сотрясения мозга.

Отличие ушиба головного мозга легкой степени тяжести от СГМ включает в себя более стойкую неврологическую симптоматику, при выполнении нейровизуализационных методов исследования (МРТ, КТ) обнаруживаются очаговые изменения вещества мозга, которые в последующем исчезают, или признаки субарахноидального кровоизлияния, также может быть линейный перелом свода черепа.

Симптомы сотрясения головного мозга

СГМ по частоте занимает первое место в структуре черепно-мозговых травм и составляет 60-90% в зависимости от региона, причем у женщин встречается несколько чаще, чем у мужчин.

Последствия легкой закрытой черепно-мозговой травмы характеризуются кратковременной утратой сознания (1 сек. – 30 мин.), ориентации, наступающей немедленно после травмы. После восстановления сознания обнаруживается амнезия (до 1 часа), головная боль, нарушение сна, лабильность артериального давления и пульса, гипергидроз, бледность, головокружение, тошнота, рвота, мышечная слабость иногда нарушение координации движений.

Последствия сотрясения головного мозга

Неврологические нарушения при легкой ЧМТ полностью обратимы, однако процесс полного восстановления функций мозга может занять от нескольких недель до года. Тяжесть травмы, возраст пациента, количество полученных черепно-мозговых травм в течение жизни определяют длительность и полноту восстановления после ЧМТ. После ЧТМ возникает посткоммоционный синдром. В этом периоде, обусловленным легким диффузным аксональным повреждением и социально-психологическим фактором, пациенты обычно жалуются на периодическую головную боль, головокружение, снижение внимания, раздражительность, тревогу, нарушение сна, астению. Если признаки сотрясения головного мозга не прекращаются и пострадавшему не становится лучше, а только хуже, следует исключать психологические проблемы, ятрогению или побочные действия лекарственных препаратов.

В тоже время сотрясение мозга во время ДТП может сочетаться с повреждением височно-нижнечелюстного сустава, лабиринта, хлыстовой травмой шеи. В любом случае по истечении времени после получения травмы необходимо проведение дифференциальной диагностики и установление причины имеющихся жалоб.

Из-за нарушения внимания работоспособность пациентов с ЧМТ в течение 1-3 месяцев ограничена. Через год после легкого сотрясения головного мозга у 10-15% больных формируется хронический посткоммоционный синдром, который в свою очередь проявляется в основном периодической головной болью, головокружением и астенией.

Лечение сотрясения мозга

Больному с ЧМТ следует находиться на дневном стационаре в клинике, где ему могут проводить современное лечение и реабилитацию. Также пациент будет находиться под наблюдением не родственников, а медицинского персонала. После легкого ушиба головного мозга необходимо соблюдать постельный режим буквально первые несколько дней, затем для пациентов будет благоприятнее раннее возвращение к привычному образу жизни.

Черепно-мозговая травма

Черепно-мозговая травма

    Черепно-мозговая травма — механическое повреждение черепа и (или) внутричерепных образований (головного мозга, мозговых оболочек, сосудов, черепных нервов). Составляет 25—30% всех травм, а среди летальных исходов при травмах ее удельный вес достигает 50—60%. Как причина смертности лиц молодого и среднего возраста Ч.-м. т. опережает сердечно-сосудистые и онкологические заболевания.

             Черепно-мозговую травму по тяжести делят на 3 стадии: легкую, среднюю и тяжелую. К легкой Ч.-м. т. относят сотрясение мозга и ушибы мозга легкой степени; к средней тяжести — ушибы мозга средней степени; к тяжелой  — ушибы мозга тяжелой степени, диффузное аксональное повреждение и сдавление мозга.

    Основными клиническими формами черепно-мозговой травмы являются сотрясение мозга, ушибы мозга (легкой, средней и тяжелой степени), диффузное аксональное повреждение мозга и сдавление мозга.

    Сотрясение головного мозга отмечается у 60—70% пострадавших. Легкая диффузная черепно-мозговая травма, характеризующаяся нарушением сознания.     Хотя часто указывается на кратковременный характер этого нарушения, но четкой договоренности о его продолжительности нет. Обычно не наблюдается макро- и микроскопических повреждений мозгового вещества. На КТ и МРТ изменений нет. Также считается, что потеря сознания не является обязательной. Возможные изменения сознания: спутанность, амнезия (главный признак СГМ) или полная утрата сознания. После восстановления сознания возможны жалобы на головную боль, головокружение, тошноту, слабость, шум в ушах, приливы крови к лицу, потливость. Другие вегетативные симптомы и нарушение сна. Общее состояние больных быстро улучшается в течение 1-й, реже 2-й нед. после травмы.

    Ушиб (контузия) мозга. Различают ушибы головного мозга легкой, средней и тяжелой степени.

    Ушиб головного мозга легкой степени отмечается у 10—15% больных с Ч.-м. т. Характеризуется нарушением сознания после травмы, длительность возможна до нескольких минут. После восстановления сознания типичны жалобы на головную боль, головокружение, тошноту и др. Неврологическая симптоматика обычно легкая (нистагм, признаки легкой пирамидной недостаточности в виде рефлекторных парезов в конечностях, менингеальные симптомы), чаще регрессирующая на 2—3 нед. после травмы. Лечение консервативное, проводится первоначально обязательно в стационарных условиях нейрохирургического отделения.

    Ушиб мозга средней степени отмечается у 8—10% пострадавших. Характеризуется выключением сознания после травмы продолжительностью от нескольких десятков минут до нескольких часов.

Выражена амнезия (ретро-, кон-, антероградная). Головная боль нередко сильная. Может наблюдаться повторная рвота. Иногда отмечаются психические нарушения. Отчетливо проявляется очаговая симптоматика, характер которой обусловлен локализацией ушиба мозга; зрачковые и глазодвигательные нарушения, парезы конечностей, расстройства чувствительности, речи и др. Эти симптомы постепенно (в течение 3—5 нед.) сглаживаются, но могут держаться и длительно. Лечение, в большинстве случаев, консервативное в нейрохирургическом отделении. В некоторых случаях, течение данного вида травмы осложняется появлением вторичных кровоизлияний и даже формированием внутримозговой гематомы, когда может потребоваться хирургическая помощь. 

    Ушиб головного мозга тяжелой степени отмечается у 5—7% пострадавших. Характеризуется выключением сознания после травмы продолжительностью от суток до нескольких недель. Данный вид травмы особенно опасен тем, что проявляется нарушением стволовых функций головного мозга, наблюдаются тяжелые нарушения жизненно важных функций – дыхания и системной гемодинамики.

 Пациент госпитализируется в отделение реанимации. Лечением коллегиально занимается врач-нейрореаниматолог и врач-нейрохирург.          Общемозговая и очаговая симптоматика регрессируют медленно. Характерны стойки остаточные явления в виде нарушений психики, двигательного дефицита.

В случае формирования внутримозговой гематомы, являющейся причиной сдавления головного мозга показано оперативное лечение – трепанация черепа, удаление гематомы.

 

Внутримозговая гематома правой височной доли.

    Диффузное аксональное повреждение головного мозга характеризуется длительным (до 2—3 нед.) коматозным состоянием, выраженными стволовыми симптомами (парез взора вверх, разностояние глаз по вертикальной оси, двустороннее угнетение или выпадение световой реакции зрачков, нарушение или отсутствие окулоцефалического рефлекса и др.). Часто наблюдаются нарушения частоты и ритма дыхания, нестабильность гемодинамики.   Характерной особенностью клинического течения диффузного аксонального повреждения является переход из длительной комы в стойкое или транзиторное вегетативное состояние, о наступлении которого свидетельствует появление ранее отсутствовавшего открывания глаз спонтанно либо в ответ на различные раздражения.

При этом нет признаков слежения, фиксации взора или выполнения хотя бы элементарных инструкций (данное состояние называют апаллическим синдромом). Вегетативное состояние у таких больных длится от нескольких суток до нескольких месяцев и характеризуется функциональным и/или анатомическим разобщением больших полушарий и ствола мозга.    По мере выхода из вегетативного состояния неврологические симптомы разобщения сменяются преимущественно симптомами выпадения. Среди них доминирует экстрапирамидный синдром с выраженной мышечной скованностью, дискоординацией, брадикинезией, олигофазией, гипомимией, мелкими гиперкинезами, атаксией. Одновременно четко проявляются нарушения психики: резко выраженная аспонтанность (безразличие к окружающему, неопрятность в постели, отсутствие любых побуждений к какой-либо деятельности), амнестическая спутанность, слабоумие и др. Вместе с тем наблюдаются грубые аффективные расстройства в виде гневливости, агрессивности.

КТ картина при диффузно-аксональном повреждении головного мозга (диффузный отек, множество мелких кровоизлияний).

  Лечение данного вида травмы проводится консервативно с участием нейрореаниматолога, нейрохирурга, врача и инструктора ЛФК (проводится ранняя двигательная реабилитация с целью предупреждения формирования контрактур в суставах).

    Сдавление (компрессия) головного мозга

отмечается у 3—5% пострадавших. Характеризуется нарастанием через тот или иной промежуток времени после травмы либо непосредственно после нее общемозговых симптомов (появление или углубление нарушений сознания, усиление головной боли, повторная рвота, психомоторное возбуждение и т.д.), очаговых (появление или углубление гемипареза, фокальных эпилептических припадков и др.) и стволовых симптомов (появление или углубление брадикардии, повышение АД, ограничение взора вверх, тоничный спонтанный нистагм, двусторонние патологические знаки и др.).

   . Среди причин сдавления на первом месте стоят внутричерепные гематомы (эпидуральные, субдуральные, внутримозговые, внутрижелудочковые). Причиной сдавления мозга могут быть и вдавленные переломы костей черепа, очаги размозжения мозга, субдуральные гигромы, пневмоцефалия.

    Эпидуральная гематома на компьютерной томограмме имеет вид двояковыпуклой, реже плосковыпуклой зоны повышенной плотности, примыкающей к своду черепа. Гематома имеет ограниченный характер и, как правило, локализуется в пределах одной-двух долей.

Эпидуральная гематома задней черепной ямки.

 

Лечение острых эпидуральных гематом.

Консервативное лечение:

— эпидуральная гематома объемом менее 30 см3, толщиной менее 15 мм, при смещении срединных структур менее 5 мм у пострадавших с уровнем сознания по ШКГ более 8 баллов и отсутствием очаговой неврологической симптоматики. Клинический контроль осуществляется в течение 72 часов с периодичностью каждые 3 часа.

Оперативное лечение

1. Экстренное оперативное вмешательство

острая эпидуральная гематома у пострадавшего в коме (менее 9 баллов по ШКГ) при наличии анизокории.

2. Срочное оперативное вмешательство

эпидуральная гематома более 30 см3 независимо от степени угнетения сознания по ШКГ.

В отдельных случаях при незначительном превышении указанного объёма эпидуральной гематомы и полностью компенсированном состоянии пострадавшего с отсутствием симптоматики допустима консервативная тактика с динамическим КТ контролем ситуации.

Абсолютными показаниями к хирургическому лечению при повреждениях задней черепной ямки являются эпидуральные гематомы > 25 см3, повреждения мозжечка латеральной локализации > 20 см3, окклюзионная гидроцефалия, латеральная дислокация IV желудочка

 

Методы операций:

1.Декомпрессивная трепанация

2.Костно-пластическая трепанация

 

    Для субдуральной гематомы на компьютерной томограмме чаще характерно наличие серповидной зоны измененной плотности  плосковыпуклой, двояковыпуклой или неправильной формы.

Субдуральная гематома.

 Лечение острых субдуральных гематом.

Оперативное лечение

1. При острой субдуральной гематоме толщиной >10 мм или смещении срединных структур > 5 мм независимо от неврологического статуса пострадавшего по ШКГ.

2. Пострадавшим в коме с субдуральной гематомой толщиной < 10 мм и смещением срединных структур < 5 мм, если наблюдается ухудшение неврологического статуса в динамике – нарастание глубины комы, появление стволовой симптоматики. У пострадавших с острой субдуральной гематомой, при наличии показаний к операции, хирургическое вмешательство должно быть выполнено в экстренном порядке. Удаление острой субдуральной гематомы осуществляется путем краниотомии в большинстве случаев с удалением костного лоскута и пластикой твердой мозговой

   

Лечение вдавленных переломов костей черепа.

Оперативное лечение показано при наличии признаков повреждения твердой мозговой оболочки (ТМО), значительной внутричерепной гематомы, вдавления больше 1 см, вовлечения воздухоносных пазух, косметического дефекта.

 Принципы оперативного лечения..

для снижения риска инфицирования рекомендуется раннее хирургическое вмешательство; устранение вдавления и хирургическая обработка раны являются основными элементами операции. При отсутствии инфицирования раны возможна первичная костная пластика.

 Оскольчатый перелом костей черепа с наличием вдавления в полость черепа.

    Прогноз при легкой Ч.-м. т. (сотрясение, ушиб мозга легкой степени) обычно благоприятный (при условии соблюдения рекомендованного пострадавшему режима и лечения).

    При среднетяжелой травме (ушиб мозга средней степени) часто удается добиться полного восстановления трудовой и социальной активности пострадавших. У ряда больных развиваются лептоменингит и гидроцефалия, обусловливающие астенизацию, головные боли, вегетососудистую дисфункцию, нарушения статики, координации и другую неврологическую симптоматику.

    При тяжелой травме (ушиб мозга тяжелой степени, диффузное аксональное повреждение, сдавление мозга) смертность достигает 30—50%. Среди выживших значительна инвалидизация, ведущими причинами которой являются психические расстройства, эпилептические припадки, грубые двигательные и речевые нарушения. При открытой Ч.-м. т. могут возникать воспалительные осложнения (менингит, энцефалит, вентрикулит, абсцессы мозга), а также ликворея.

Фазы и периоды ЗЧМТ

Фазы черепно-мозговой травмы

Клиническая фаза ЧМТ определяется выраженностью общемозговых и очаговых неврологических нарушений.

  1. Фаза клинической компенсации.

    Социально-трудовая адаптация восстановлена. Общемозговая симптоматика отсутствует. Очаговая симптоматика либо отсутствует, либо резидуальна (не изменяется в течение длительного времени). Несмотря на отсутствие у больного жалоб и функционально значимых нарушений, признаки перенесенной ЧМТ могут отмечаться при неврологическом осмотре и по данным нейровизуализации.
  2. Фаза клинической субкомпенсации.

    Общее состояние больного обычно удовлетворительное. Сознание ясное, либо имеются элементы оглушения. Могут выявляться различные очаговые неврологические симптомы, чаще мягко выраженные. Дислокационная симптоматика отсутствует. Жизненно важные функции не нарушены.
  3. Фаза умеренной клинической декомпенсации.

    Общее состояние больного средней тяжести или тяжелое. Оглушение, обычно умеренное. При сдавлении мозга отчетливо выражены признаки внутричерепной гипертензии. Нарастают либо появляются новые очаговые симптомы как выпадения, так и раздражения. Лёгкие нарушения жизненно важных функций.
  4. Фаза грубой клинической декомпенсации.

    Общее состояние больного тяжелое или крайне тяжелое. Сознание нарушено: от глубокого оглушения до комы. При сдавлении мозга четко выражены синдромы ущемле-ния ствола, чаще на тенториальном уровне. Нарушения жизненно важных функций становятся угрожающими.
  5. Терминальная фаза.

    Обычно необратимая кома с грубейшими нарушениями жизненно важных функций, арефлексией, атонией, двусторонним фиксированным мидриазом.

Травматическое повреждение мозга глобально делится на два этапа — первичное непосредственное действие повреждающего фактора и вторичные повреждения (иммуноопосредованные, ишемические/реперфузионные, постапоптотические). Для обоих этапов характерна каскадность и взаимная зависимость механизмов повреждения мозга.

В экспериментах на животных моделях, признаки активации иммунных клеток сохраняются в течение нескольких месяцев после повреждения мозга.

Периоды черепно-мозговой травмы

Острый период

Определение: промежуток времени от момента повреждающего воздействия механической энергии на головной мозг с внезапным расстройством его интегративно-регуляторных и локальных функций до стабилизации на том или ином уровне нарушенных общемозговых и общеорганизменных функций, либо смерти пострадавшего.

Длительность: 2-10 недель.
  • сотрясение мозга — до 2-х недель;
  • лёгкий ушиб мозга — до 3-х недель;
  • среднетяжёлый ушиб мозга — до 4–5 нед;
  • тяжёлый ушиб мозга — до 6–8 нед;
  • диффузное аксональное повреждение 8–10 нед;
  • сдавление мозга — 3 — 10 нед.
В пределах острого периода ЧМТ можно различить несколько периодов:
  1. первичного максимума нарушений функций мозга;
  2. лабильных вторичных нарушений функций мозга;
  3. стабилизации — на том или ином уровне — нарушенных функций мозга.
По экспериментальным данным, в остром периоде усиливаются обменные процессы («пожар обмена»), а затем в нервной ткани развивается энергетический дефицит с его вторичными изменениями. Клинически для острого периода ЧМТ характерна симптоматика дезинтеграции и выпадения мозговых функций. Типичны нарушения сознания по типу угнетения и выключения с количественным снижением психической деятельности (оглушение, сопор или кома), преимущественно за счет дисфункции срединно-стволовых структур. Среди очаговых неврологических признаков в остром периоде ЧМТ преобладают симптомы выпадения функций мозга, структура и степень выраженности которых определяются локализацией и видом травматического субстрата. При тяжелой ЧМТ, особенно компрессии мозга, характерно появление вторичной дислокационной симптоматики, преимущественно со стороны ствола мозга, а также дистантной очаговой патологии сосудистого генеза. Для острого периода ЧМТ характерна посттравматическая иммуносупрессия и нарастание аутоиммунных реакций. Нейровизуализация: очаговые и диффузные изменения головного мозга, сужение или смещенение ликворосодержащих пространств. Патоморфологические исследования: детрит (при тяжёлом повреждении), кровоизлияния (обширность зависит от тяжести травмы), отёк и набухание мозга. При сотрясении мозга — ультраструктурные изменения глиальных клеток, нейронов и синапсов. При диффузном аксональном повреждении — разрыв аксонов.

Промежуточный период

Определение: промежуток времени от стабилизации нарушенных травмой общеорганизменных, общемозговых, очаговых функций до их полного или частич-ного восстановления или устойчивой компенсации.

Временная протяженность промежуточного периода:
  • легкая ЧМТ — до 2 мес,
  • среднетяжёлая ЧМТ — до 4 мес,
  • тяжёлая ЧМТ — до 6 мес.

Клинически для промежуточного периода характерно восстановление сознания, однако могут наблюдаться синдромы его дезинтеграции (психотические или субпсихотические).

Выражена астенизация.
После длительной комы возможны вегетативный статус и акинетический мутизм. Очаговые симптомы выпадения (двигательных, речевых, чувствительных, статокоординационных и других мозговых функций) регрессируют полностью или частично.
Обычно более стойко держатся парезы черепных нервов. Формируются различные синдромы раздражения: оболочечно-болевые, тригеминальные, эпилептические, подкорковые и другие.
Начинает развертываться разнообразная психовегетативная симптоматика. В промежуточном периоде происходит восстановление гомеостаза либо в устойчивом режиме, либо в ре-жиме напряжения и последующего истощения активности адаптационных систем с формированием затем отдаленных прогрессирующих последствий. Восстановление гуморального иммунитета при сохранении дефектов клеточного.

Нейровизуализация расправление и редислокация желудочков мозга, базальных и конвекситальных субарахноидальных пространств и развертыванием различных очаговых и диффузных посттравматических процессов с разнонаправленными изменениями вещества головного мозга. Морфологически в промежуточном периоде в ответ на ЧМТ в полной мере разворачиваются репаративные и регенеративные процессы. Повреждение нейрона, глии или нервного волокна обусловливает внутриклеточную регенерацию. Деструкция отдельных полей, слоев коры приводит к усиленному функционированию, вследствие гипертрофии или гиперплазии, клеток соседних участков. В промежуточном периоде продолжаются также и местные и дистантные процессы демиелинизации, фрагментация аксонов, формирование кист, спаек и др.

Отдаленный период

Определение: период клинического выздоровления, либо максимально достижимой реабилитации нарушенных функций, либо возникновения и/или прогрессирования обусловленных перенесенной ЧМТ новых патологических состояний.

Временная протяженность отдаленного периода: при клиническом выздоровлении — до 2 лет, при прогредиентном течении — не ограничена. Клиническая симптоматика, если она не исчезает, приобретает устойчивый характер резидуальной, сочетая признаки выпадения, раздражения и разобщения. Могут появляться новые неврологические симптомы. Иммунологически в отдаленном периоде определяются аутоантитела к нейронам и глиальным клеткам в 50–60% случаев. С учетом этого выделяют две формы посттравматического развития: иммунозависимую и иммунонезависимую.Для первой характерны вторичные иммунологические реакции.

Нейровизуализация посттравматические очаговые и диффузные изменения мозговой ткани: формирование кист, глиоз, атрофия, изменения, связанные в последствиями оперативного вмешательства.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обширные экспериментальные данные о патогенезе черепно-мозговой травмы, не дали средств, контролирующих клеточные и молекулярные изменения в головном мозге у пациентов.

Ситуация сходна с отказом от нейропротективной терапии в лечении инсульта.

— пациенты без жалоб и функционально значимых нарушений не требуют лечения;

— пациентам с проявлениями лёгкой ЧМТ требуется симптоматическое лечение: обезболивающие, противорвотные, анксиолитические и седативные средства;

— при тяжёлой и среднетяжёлой ЧМТ — контроль витальных показателей; профилактика, выявление и коррекция осложнений.

Набор необходимых средств реабилитации определяется не характером и тяжестью травмы а особенностями неврологичеких нарушений на текущее время, а также, преморбидными (медицинскими и личностными) особенностями пациента, уровнем его мотивации.

причины, симптомы, диагностика и методы лечения

Не все диагнозы, даже хорошо знакомые, являются понятными пациентам, представленные, как аббревиатура из Международного классификатора заболеваний. Что обозначает диагноз СГМ? Расшифровка будет представлена в статье. Также мы определимся с причинами этого состояния, степенями его тяжести. Рассмотрим тревожные симптомы, методики диагностики, первую помощь, лечение.

Значение аббревиатуры

Представим расшифровку диагноза СГМ. Это — сотрясение головного мозга.

Можно встретить и иную аббревиатуру в медицинской карте. Это ЗЧМТ СГМ. Что она значит? Закрытая черепно-мозговая травма, сотрясение головного мозга.

Теперь обратимся к классификатору. Что означает СГМ в МКБ 10? В Международном классификаторе болезней под определенными кодами зашифрованы определенные патологии, травмы, заболевания и патологические состояния. Что касается сотрясения мозга, то оно находится под кодом S06.1.

Что это?

Мы познакомились с расшифровкой диагноза СГМ. Чем оно представляется? СГМ и ЗЧМТ тесно связаны. Ведь сотрясение мозга — это один из видов черепно-мозговых травм.

В большинстве случаев, это легко обратимое нарушение каких-либо функций головного мозга, которое может возникнуть из-за сильного ушиба, удара головой или даже резкого движения ею. Специалисты считают, что из-за СГМ (расшифровку диагноза вы уже знаете) возникает также временное нарушение межнейрональной связи.

Выражение травмы

Что такое СГМ? В результате удара, ушиба или резкого движения происходит контакт костей черепа и вещества мозга. Это чревато следующим:

  • Изменение ряда химических или физических свойств нейронов (клеток, составляющих головной мозг). Это может повести за собой изменение пространственной организации белковых молекул.
  • Патологическое воздействие на всю массу вещества головного мозга.
  • Временное разобщение передачи сигналов, а также взаимоотношений между синапсами клеточных нейронов и отделами мозга. Синапсами называются локации контакта между парой нейронов. Или же между нейроном и получающей сигнал эффекторной клеткой. Это является причиной различных функциональных нарушений.

Тяжесть состояния

Специалисты выделяют три главные степени сотрясения головного мозга:

  • Легкая. У пострадавшего не наблюдается нарушений сознания. Однако он может страдать от головных болей, дезориентации в пространстве, тошноты, головокружения в продолжение короткого периода после травмы (не более получаса). После этого самочувствие обычно возвращается в норму. Также иногда отмечается кратковременное увеличение температуры тела (до 38°С).
  • Средняя. Потеря сознания не диагностируется. Но отмечается следующее: тошнота, головокружение, головная боль, нарушение ориентации в пространстве. Это наблюдается более 20-ти минут после травмы. В отдельных случаях добавляется так называемая ретроградная амнезия: пострадавший не помнит, что случилось за несколько минут до получения травмы.
  • Тяжелая. Такое СГМ сопровождается потерей сознания на небольшой период времени — от нескольких минут до нескольких часов. Развивается ретроградная амнезия — пострадавшему не удается вспомнить, что с ним произошло. Он отмечает у себя патологические симптомы в течение 1-2 недель после травмы — это тошнота, головная боль, дезориентация, сниженная работоспособность, головокружения, нарушения как аппетита, так и сна.

Симптомы

Каковые симптомы сотрясения головного мозга у ребенка и взрослого? Самым верным является наличие любой травмы головы. Ведь даже небольшой ушиб может привести к СГМ.

Симптомы сотрясения головного мозга у взрослых обычно могут быть следующими:

  • Спутанность сознания на короткий отрезок времени.
  • Головокружение. Притом оно наблюдается в состоянии покоя. Если человек меняет положение тела, поворачивает, наклоняет голову, оно усиливается. Причина этого — нарушение кровяной циркуляции в вестибулярном аппарате.
  • Пульсирующие головные боли.
  • Слабость.
  • Шумы в ушах.
  • Тошнота. Может быть и однократная рвота.
  • Спутанность сознания, заторможенность в движениях, бессвязная или замедленная речь.
  • Двоение изображения в глазах — диплопия. Если пациент пробует читать, он испытывает глазную боль.
  • Светобоязнь. Притом возможна болезненная реакция даже на нормальный уровень освещенности.
  • Увеличение чувствительности к шумам. Больного раздражают даже привычные звуки.
  • Нарушение координации движения.

Что касается последнего, это достаточно легко установить. Попросите человека с закрытыми глазами дотянуться подушечкой указательного пальца к кончику своего носа. Еще один вариант проверки координации — идти по прямой линии, ставя одну ногу за другую. Затем развести руки в стороны, закрыть глаза и попробовать сделать несколько маленьких шагов также по одной линии.

Определение СГМ у детей и пожилых людей

Симптомы сотрясения головного мозга у ребенка выражаются с определенными особенностями. Особое внимание тут нужно уделить младенцам и детям раннего возраста — часто СГМ у них не сопровождается нарушением сознания, отчего сотрясение сложно установить неспециалисту.

Поэтому нужно проверить следующие тревожные симптомы:

  • В момент получения травмы у ребенка бледнеет кожа (чаще всего лицо). Может участиться сердцебиение, после чего появляется сонливость и вялость.
  • Что касается грудных детей, тревожными признаками СГМ после травмы головы у них является срыгивание при кормлении или рвота, расстройство сна, общее беспокойство. Данные симптомы самостоятельно прекращаются через 2-3 дня.
  • У дошкольников СГМ протекает без нарушения сознания. При этом состояние ребенка улучшается самостоятельно через 2-3 суток.

У пожилых людей СГМ сопровождается потерей сознания куда реже, чем у молодежи, лиц среднего возраста. Но сотрясение проявляет себя больше дезориентацией в пространстве и времени. Пострадавшие жалуются на пульсирующие головные боли в зоне затылка.

Подобные нарушения у пожилых людей диагностируются в течение 5-7 суток. Более интенсивны у больных, страдающих от гипертонических патологий.

Первая помощь

Разберем основные меры ПМП при сотрясении головного мозга:

  • Если пострадавший потерял сознание, необходимо как можно быстрее вызвать «Скорую помощь». Предварительно уложите его на твердую ровную поверхность на правый блок, согните руки в локтях и ноги в коленях. Запрокиньте голову человека немного наверх, после чего поверните лицом к земле — так воздух будет лучше проходить по его дыхательным путям. Это предупреждает и аспирацию — проникновение инородных предметов и веществ.
  • Если у пострадавшего идет кровь, то следует наложить на рану кровоостанавливающую повязку.
  • Если человек очнулся, или обморока с ним не случилось, следует уложить его горизонтально, подложить под голову мягкий предмет так, чтобы она располагалась несколько приподнято. Следите, чтобы он находился в сознании — не позволяйте пострадавшему заснуть до прибытия врачей.
  • Все люди с травмой головы обязательно должны пройти обследование в травмпункте. По решению специалиста их в дальнейшем могут отправить на амбулаторную терапию к неврологу. В тяжелых случаях пострадавшего госпитализируют в неврологическое отделение для проведения диагностики, наблюдения за его состоянием, лечения.
  • Если человек находится без сознания, а вы не в состоянии самостоятельно определить степень тяжести и характер повреждений, не пытайтесь его подвинуть, пошевелить, перевернуть. Позаботьтесь только о том, чтобы ничего не стесняло его тело, ничего не мешало свободному дыханию. При необходимости удалите из дыхательных путей жидкости (например, рвотные массы), сыпучие вещества или какие-то мелкие предметы.

Домашнее диагностирование

Как установить СГМ самостоятельно? Есть несколько доступных приемов диагностирования сотрясения:

  • Пострадавшему больно переводить взгляд. Он не может отвести его в крайнее положение.
  • В первые часы после травмирования наблюдается легкое сужение или, напротив, расширение зрачков. Реакция их на свет при этом остается нормальной.
  • Легкая асимметрия как кожных, так и сухожильных рефлексов. Они будут разными с правой и с левой стороны. Например, левый коленный рефлекс может быть несколько живее правого. Но такой признак изменчивый — через несколько часов он может прийти в норму.
  • Горизонтальный мелкий нистагм (то есть, непроизвольное дрожание) при отводе глаз в крайнее положение. Пациент следит за мелким предметом в руке обследующего. В случае СГМ наблюдается легкое возвратное движение зрачка.
  • Появление шаткости в позе Ромберга: пациента просят свести ноги вместе, вытянуть перед собой руки параллельно полу и закрыть глаза.
  • Легкое напряжение затылочной мускулатуры (может самостоятельно закончиться спустя 3-ое суток).

Врачебная диагностика

Но при СГМ не обойтись без профессиональных методик диагностики состояния пациента:

  • МРТ при сотрясении головного мозга.
  • Рентген черепа и шейной зоны позвоночника.
  • Энцефалография.
  • Компьютерная томография.
  • Эхоэнцефалоскопия.
  • Взятие спинномозговой пункции.
  • Исследования глазного дна.

Терапия

Конечно, самостоятельно искать таблетки от сотрясения головного мозга не стоит. Неправильное или недостаточное лечение чревато при СГМ следующим:

  • Хроническое нарушение равновесия.
  • Психические изменения.
  • Хроническое дрожание конечностей.
  • Посттравматические синдромы — сохранение повышенной утомляемости, стойкое нарушение памяти.

Терапия при СГМ назначается комплексная:

  • Седативные препараты.
  • Анальгетики.
  • Снотворные средства.
  • Метаболическая и сосудистая терапия.
  • Тонизирующие средства.

Лечение не будет эффективным, если пациент в течение 5-7 дней не станет соблюдать постельный режим. В зависимости от тяжести сотрясения, правильности следования советам доктора улучшение состояния больного наступает через пару недель.

Домашнее лечение

Возможно ли лечение сотрясения головного мозга в домашних условиях? Только в том случае, если это позволил ваш доктор: повреждение не столь серьезно, чтобы госпитализировать больного.

Тут прописывается следующее:

  • Соблюдение постельного режима, полноценный сон.
  • Отсутствие физических и психических нагрузок.
  • Прием прописанных медикаментозных препаратов. Назначаются средства для налаживания мозгового кровообращения, уменьшающие головную боль. Лекарства, избавляющие от таких неприятных симптомов, как тошнота и головокружение.
  • Могут быть назначены препараты с нейропротекторными свойствами — улучшающие протекание жизненно важных процессов в головном мозге.
  • В каких-то случаях необходим прием снотворных и успокаивающих препаратов.
  • На этапе реабилитации доктор может прописать ноотропные, общетонизирующие лекарства.

В продолжение месяца после травмы не рекомендуется заниматься спортом, тяжелой физработой. Нужно отказаться от длительного чтения, просмотра телевизора, пользования компьютером и смартфоном. Рекомендуется слушать спокойную музыку, но не используя наушники.

СГМ — повреждение, которое нуждается во врачебном контроле. Только доктор может назначить правильное лечение после комплексной диагностики. Все его предписания обязательны к исполнению! В противном случае пациент может получить хронические осложнения.

Компьютерная томография (МСКТ) головного мозга и черепа

Компьютерная томография головного мозга и черепа является незаменимым и наиболее информативным и достоверным диагностическим исследованием в современной медицине. Высокая степень разрешения при КТ черепа определяет качество диагностики заболеваний головного мозга, выявляемых даже при самых минимальных патологических изменениях в структуре нервной ткани.
Чаще всего КТ головного мозга и черепа требуется при диагностике таких заболеваний, как:
• черепно-мозговые травмы (ушибы, сотрясения),
• истечение ликвора при переломах основания черепа,
• первичные и вторичные опухоли головного мозга,
• опухоли мозговых оболочек,
• сосудистые аневризмы и артерио-венозные соустья,
• кисты мозга, гематомы,
• геморрагические инсульты.
Компьютерная томография головного мозга и черепа позволят оценить в комплексе костные структуры (свод черепа, височные кости, основание черепа, придаточные пазухи), мягкие образования, полостные структуры, сосуды головного мозга и черепа (артерии, вены, синусы).
На компьютерной томографии лучше визуализируются костные структуры, в методиках с контрастированием — сосуды, на МРТ (магнитно-резонансной томографии) — ткань мозга, мягкие ткани, сосуды.
При проведении КТ головного мозга может понадобиться введение контрастного вещества. Решение об этом принимает врач лучевой диагностики во время проведения КТ и лечащий доктор. Это необходимо учитывать при планировании исследования.
Компьютерная томография дает возможность выявить не только структурные, но и качественные изменения при поражении головы.
Так, компьютерная томография черепа может подтвердить не только нарушение целостности кости, но и определить направление и глубину раневого канала, наличие инородных тел, заполнение канала кровью, ликвором или воздухом. Также благодаря КТ исследованию можно обнаружить и оценить:
• степень отека головного мозга,
• смещение структур, величину степени смещения желудочков мозга и базальных цистерн, качество субарахноидального пространства,
• наличие мелкоочаговых кровоизлияний,
• крупные субдуральные и эпидуральные гематомы и их наружные и внутренние листки, посттравматические воспалительные процессы (энцефалит, арахноидит),
• скопление гноя в субдуральном и эпидуральном пространстве.
Также на снимках компьютерной томографии головного мозга и черепа отчетливо визуализируются кисты и опухоли различных тканей: костной, хрящевой, мягких тканей головного мозга.

Скидки не распространяются на дорогостоящие расходные материалы.

Отделение

Фотогалерея

Cотрясение головного мозга симптомы и лечение в домашних условиях


Значение аббревиатуры

Представим расшифровку диагноза СГМ. Это — сотрясение головного мозга.

Можно встретить и иную аббревиатуру в медицинской карте. Это ЗЧМТ СГМ. Что она значит? Закрытая черепно-мозговая травма, сотрясение головного мозга.

Теперь обратимся к классификатору. Что означает СГМ в МКБ 10? В Международном классификаторе болезней под определенными кодами зашифрованы определенные патологии, травмы, заболевания и патологические состояния. Что касается сотрясения мозга, то оно находится под кодом S06.1.

Профилактика

Нужно помнить, что:

  1. При контактных играх или езде на роликах, велопрогулках, катании на коньках, лыжах, скейтборде — надевайте шлем.
  2. Если любите заниматься единоборствами — уделайте защите головы должное внимание.
  3. При езде на автомобиле — пристегивайтесь.
  4. Дома продумайте обстановку, что вы не спотыкались об элементы интерьера или на вас эти элементы не упали. Не загромождайте проходы в комнатах и коридоре, по которым вы перемещаетесь в темноте.
  5. Проявляйте осторожность в тех ситуациях, где есть риск получить черепно-мозговую травму.

Помните! Если вы, или кто-то из ваших близких неудачно упал или сильно ударился головой, не пускайте данное происшествие на самотек — обратитесь к врачу. Если все хорошо, то можно спать спокойно, если нет, то вы сможете избежать всех тех последствий, которые описаны выше.

И не обращайте внимание на глубокомысленные высказывания ученых соседок — получил сотрясение, теперь головными болями будешь мучиться до смерти — при своевременном лечении через год головная боль наблюдается лишь у 1% больных.

Профилактика сотрясения мозга включает защиту головы на производстве и при занятиях спортом. Работа на стройке предполагает ношение каски, некоторые виды спорта (скейтборд, хоккей, бейсбол, езда на велосипеде или мотоцикле, катание на роликах) требуют ношения специальных шлемов. При поездке в автомобиле необходимо пристегиваться ремнями безопасности. В бытовых условиях необходимо следить, чтобы коридоры были свободными для прохода, а жидкость, случайно разлитая на полу была сразу вытерта.

Что это?

Мы познакомились с расшифровкой диагноза СГМ. Чем оно представляется? СГМ и ЗЧМТ тесно связаны. Ведь сотрясение мозга — это один из видов черепно-мозговых травм.

В большинстве случаев, это легко обратимое нарушение каких-либо функций головного мозга, которое может возникнуть из-за сильного ушиба, удара головой или даже резкого движения ею. Специалисты считают, что из-за СГМ (расшифровку диагноза вы уже знаете) возникает также временное нарушение межнейрональной связи.

Выражение травмы

Что такое СГМ? В результате удара, ушиба или резкого движения происходит контакт костей черепа и вещества мозга. Это чревато следующим:

  • Изменение ряда химических или физических свойств нейронов (клеток, составляющих головной мозг). Это может повести за собой изменение пространственной организации белковых молекул.
  • Патологическое воздействие на всю массу вещества головного мозга.
  • Временное разобщение передачи сигналов, а также взаимоотношений между синапсами клеточных нейронов и отделами мозга. Синапсами называются локации контакта между парой нейронов. Или же между нейроном и получающей сигнал эффекторной клеткой. Это является причиной различных функциональных нарушений.

Тяжесть состояния

Специалисты выделяют три главные степени сотрясения головного мозга:

  • Легкая. У пострадавшего не наблюдается нарушений сознания. Однако он может страдать от головных болей, дезориентации в пространстве, тошноты, головокружения в продолжение короткого периода после травмы (не более получаса). После этого самочувствие обычно возвращается в норму. Также иногда отмечается кратковременное увеличение температуры тела (до 38°С).
  • Средняя. Потеря сознания не диагностируется. Но отмечается следующее: тошнота, головокружение, головная боль, нарушение ориентации в пространстве. Это наблюдается более 20-ти минут после травмы. В отдельных случаях добавляется так называемая ретроградная амнезия: пострадавший не помнит, что случилось за несколько минут до получения травмы.
  • Тяжелая. Такое СГМ сопровождается потерей сознания на небольшой период времени — от нескольких минут до нескольких часов. Развивается ретроградная амнезия — пострадавшему не удается вспомнить, что с ним произошло. Он отмечает у себя патологические симптомы в течение 1-2 недель после травмы — это тошнота, головная боль, дезориентация, сниженная работоспособность, головокружения, нарушения как аппетита, так и сна.

Нюансы реабилитации

После завершения постельного режима и стабилизации состояния больного врачи рекомендуют пройти курс восстановления. Массаж, физиотерапия, лечебная гимнастика позволят вернуть к нормальному состоянию систему кровообращения. Полезно будет соблюдать диету. Из молочных продуктов акцент следует сделать на сырах и твороге. Растительная пища должна быть представлена обилием фруктов и овощей.

Несмотря на возможные трудности, курильщикам и любителям спиртных напитков лучше отказаться от вредных привычек. Рекомендуется ограничить употребление кофе, сладостей, газированных напитков, снизить количество жирной и соленой пищи.

Ограничение на выполнение тяжелой физической работы должно составить минимум месяц, чрезмерные умственные нагрузки крайне нежелательны. Соблюдение простых правил составит основу щадящего режима и позволит быстрее восстановить работоспособность.

Симптомы

Каковые симптомы сотрясения головного мозга у ребенка и взрослого? Самым верным является наличие любой травмы головы. Ведь даже небольшой ушиб может привести к СГМ.

Симптомы сотрясения головного мозга у взрослых обычно могут быть следующими:

  • Спутанность сознания на короткий отрезок времени.
  • Головокружение. Притом оно наблюдается в состоянии покоя. Если человек меняет положение тела, поворачивает, наклоняет голову, оно усиливается. Причина этого — нарушение кровяной циркуляции в вестибулярном аппарате.
  • Пульсирующие головные боли.
  • Слабость.
  • Шумы в ушах.
  • Тошнота. Может быть и однократная рвота.
  • Спутанность сознания, заторможенность в движениях, бессвязная или замедленная речь.
  • Двоение изображения в глазах — диплопия. Если пациент пробует читать, он испытывает глазную боль.
  • Светобоязнь. Притом возможна болезненная реакция даже на нормальный уровень освещенности.
  • Увеличение чувствительности к шумам. Больного раздражают даже привычные звуки.
  • Нарушение координации движения.

Что касается последнего, это достаточно легко установить. Попросите человека с закрытыми глазами дотянуться подушечкой указательного пальца к кончику своего носа. Еще один вариант проверки координации — идти по прямой линии, ставя одну ногу за другую. Затем развести руки в стороны, закрыть глаза и попробовать сделать несколько маленьких шагов также по одной линии.

Определение СГМ у детей и пожилых людей

Симптомы сотрясения головного мозга у ребенка выражаются с определенными особенностями. Особое внимание тут нужно уделить младенцам и детям раннего возраста — часто СГМ у них не сопровождается нарушением сознания, отчего сотрясение сложно установить неспециалисту.

Поэтому нужно проверить следующие тревожные симптомы:

  • В момент получения травмы у ребенка бледнеет кожа (чаще всего лицо). Может участиться сердцебиение, после чего появляется сонливость и вялость.
  • Что касается грудных детей, тревожными признаками СГМ после травмы головы у них является срыгивание при кормлении или рвота, расстройство сна, общее беспокойство. Данные симптомы самостоятельно прекращаются через 2-3 дня.
  • У дошкольников СГМ протекает без нарушения сознания. При этом состояние ребенка улучшается самостоятельно через 2-3 суток.

У пожилых людей СГМ сопровождается потерей сознания куда реже, чем у молодежи, лиц среднего возраста. Но сотрясение проявляет себя больше дезориентацией в пространстве и времени. Пострадавшие жалуются на пульсирующие головные боли в зоне затылка.

Подобные нарушения у пожилых людей диагностируются в течение 5-7 суток. Более интенсивны у больных, страдающих от гипертонических патологий.

Патогенез

Более всего влияют следующие механические факторы — фиксация головы в момент сотрясения или она находилась в движении, второй момент связан с подъемом внутричерепного давления, что вызывает преходящую ишемию (кислородное голодание) головного мозга.

Все это вызывает разные биохимические и биофизические изменения клеток, которые чаще несут обратимый характер. Также имеют место симптомы, которые объединяют в посткоммоционный синдром — это головокружение, головные боли и различные проявления апатии и депрессии.

При различных повреждениях мозга очень эффективна транскраниальная микрополяризация головного мозга.

У каждого третьего человека в мире встречаются признаки аденомы гипофиза, но не стоит впадать в отчаяние. Лучше ознакомиться с методами лечения болезни.

Первая помощь

Разберем основные меры ПМП при сотрясении головного мозга:

  • Если пострадавший потерял сознание, необходимо как можно быстрее вызвать «Скорую помощь». Предварительно уложите его на твердую ровную поверхность на правый блок, согните руки в локтях и ноги в коленях. Запрокиньте голову человека немного наверх, после чего поверните лицом к земле — так воздух будет лучше проходить по его дыхательным путям. Это предупреждает и аспирацию — проникновение инородных предметов и веществ.
  • Если у пострадавшего идет кровь, то следует наложить на рану кровоостанавливающую повязку.
  • Если человек очнулся, или обморока с ним не случилось, следует уложить его горизонтально, подложить под голову мягкий предмет так, чтобы она располагалась несколько приподнято. Следите, чтобы он находился в сознании — не позволяйте пострадавшему заснуть до прибытия врачей.
  • Все люди с травмой головы обязательно должны пройти обследование в травмпункте. По решению специалиста их в дальнейшем могут отправить на амбулаторную терапию к неврологу. В тяжелых случаях пострадавшего госпитализируют в неврологическое отделение для проведения диагностики, наблюдения за его состоянием, лечения.
  • Если человек находится без сознания, а вы не в состоянии самостоятельно определить степень тяжести и характер повреждений, не пытайтесь его подвинуть, пошевелить, перевернуть. Позаботьтесь только о том, чтобы ничего не стесняло его тело, ничего не мешало свободному дыханию. При необходимости удалите из дыхательных путей жидкости (например, рвотные массы), сыпучие вещества или какие-то мелкие предметы.


Лечение сотрясений головного мозга

Первая помощь при сотрясениях

Первая помощь пострадавшему с сотрясением мозга, если он быстро пришел в сознание (что обычно имеет место при сотрясении мозга), заключается в придании ему удобного горизонтального положения с чуть приподнятой головой.

Если получивший сотрясение мозга продолжает находиться в бессознательном состоянии, предпочтительней так называемое спасительное положение —

  • на правом боку,
  • голова запрокинута, лицо повернуто к земле,
  • левая рука и нога согнуты под прямым углом в локтевом и коленном суставах (предварительно надо исключить переломы конечностей и позвоночника).

Эта позиция, обеспечивая свободное прохождение воздуха в легкие и беспрепятственное вытекание жидкости изо рта наружу, предотвращает нарушение дыхания вследствие западения языка, затекания в дыхательные пути слюны, крови, рвотных масс. Если на голове имеются кровоточащие раны, накладывают повязку.

Все пострадавшие с сотрясением мозга, даже если оно с самого начала представляется легким, подлежат транспортировке в дежурный стационар, где уточняется первичный диагноз. Пострадавшим с сотрясением мозга устанавливается постельный режим на 1-3 суток, который затем, с учетом особенностей течения заболевания, постепенно расширяют на протяжении 2-5 суток, а далее, при отсутствии осложнений, возможна выписка из стационара на амбулаторное лечение (длительностью до 2 недель).

Медикаментозная терапия

Медикаментозное лечение при сотрясении мозга часто не требуется и носит симптоматический характер (основное лечение — покой и здоровый сон). Направлена фармакотерапия главным образом на нормализацию функционального состояния головного мозга, снятие головной боли, головокружения, беспокойства, бессонницы и других жалоб.

Обычно спектр назначаемых при поступлении лекарств включает обезболивающие, успокаивающие и снотворные, преимущественно в виде таблеток, а при необходимости и в инъекциях. Среди обезболивающих (анальгин, пенталгин, дексалгин, седалгин, максиган и др.) подбирают наиболее эффективный у данного больного препарат. Подобным образом поступают и при головокружении, выбирая что-либо одно из имеющихся лекарственных средств (беллоид, циннаризин, платифиллин с папаверином, танакан, микрозер и т.п.).

В качестве успокаивающих используют валериану, пустырник, корвалол, валокордин, а также транквилизаторы (афобазол, грандоксин, сибазон, феназепам, нозепам, рудотель и др.). Для устранения бессонницы на ночь назначают донармил или релаксон.

Проведение курсовой сосудистой и метаболической терапии при сотрясениях способствует более быстрому и полному восстановлению нарушений мозговых функций. Предпочтительно сочетание сосудитстых (кавинтон, стугерон, сермион, инстенон и др.) и ноотропных (глицин, ноотропил, павнтогам, ноопепт и др.) препаратов.

Как варианты возможных комбинаций могут быть представлены ежедневный трехразовый прием кавинтона по 1 таб. (5 мг) и ноотропила по 2 капс. (0,8) или стугерона по 1 таб. (25 мг) и ноопепта по 1 таб. (0,1) на протяжении 1-2 месяцев. Положительный эффект приносит включение в курс терапии препаратов содержащих магний (Магне В6, Магнелис, Панангин) и антиоксидантов Цитофлавин 2 т 2 р в день, Милдронат 250 мг1 т 3 р в день.

Для преодоления частых астенических явлений после сотрясения мозга назначают: фенотропил по 0,1 1 раз утром, когитум по 20 мл 1 раз в день, вазобрал по 2 мл 2 раза в день, поливитамины-полиминералы типа «Юникап-Т», «Витрум» и т.п. по 1 таб. 1 раз в день. Из тонизирующих препаратов используют корень женьшеня, экстракт элеутерококка, плоды лимонника, сапарал, пантокрин. У лиц пожилого и старческого возраста, перенесших сотрясение мозга, усиливают противосклеротическую терапию. Также уделяют внимание лечению различных сопутствующих заболеваний.

Для предупреждения возможных отклонений в благополучном завершении сотрясения головного мозга требуется диспансерное наблюдение на протяжении года у невролога по месту жительства.

Домашнее диагностирование

Как установить СГМ самостоятельно? Есть несколько доступных приемов диагностирования сотрясения:

  • Пострадавшему больно переводить взгляд. Он не может отвести его в крайнее положение.
  • В первые часы после травмирования наблюдается легкое сужение или, напротив, расширение зрачков. Реакция их на свет при этом остается нормальной.
  • Легкая асимметрия как кожных, так и сухожильных рефлексов. Они будут разными с правой и с левой стороны. Например, левый коленный рефлекс может быть несколько живее правого. Но такой признак изменчивый — через несколько часов он может прийти в норму.
  • Горизонтальный мелкий нистагм (то есть, непроизвольное дрожание) при отводе глаз в крайнее положение. Пациент следит за мелким предметом в руке обследующего. В случае СГМ наблюдается легкое возвратное движение зрачка.
  • Появление шаткости в позе Ромберга: пациента просят свести ноги вместе, вытянуть перед собой руки параллельно полу и закрыть глаза.
  • Легкое напряжение затылочной мускулатуры (может самостоятельно закончиться спустя 3-ое суток).

Этиология и основные проявления

Сотрясение мозга регистрируют после разнообразных ударов и ушибов, а также после падений или других резких движений. Причинами подобного травмирования в основном становятся аварии на дорогах, бытовые, а также спортивные травмы. При указанном повреждении головы любые органические изменения отсутствуют. Считается, что основным в развитии сотрясения является сбой в работе нейронов, при котором ухудшается питание мозговой ткани и нарушается взаимосвязь между центрами мозга.

Легкое сотрясение не проявляется тяжелыми нарушениями в работе головы, а признаки поражения сохраняются максимум две недели. При тяжелом сотрясении патологическая симптоматика может сохраняться месяц или дольше. При такой травме могут разрываться кровеносные сосуды, что провоцирует появление гематомы и сжатие тканей мозга с соответствующими клиническими признаками. Основные проявления:

  • Потеря сознания. Нарушается передача импульсов по нейронам, а также кровообращение. При этом возникает недостаток кислорода, что ведет к потере сознания. У пострадавшего отсутствует реакция на раздражители. Такое состояние сохраняется несколько секунд или даже нескольких часов, в зависимости от силы травмирующего фактора.
  • При легком сотрясении возможен ступор. Вследствие нарушенной передачи импульсов наблюдается угнетение эмоций и двигательной активности.
  • Однократная рвота, которая возникает вследствие прекращения нормального кровообращения.
  • Тошнота и головокружение, которые появляются даже в покое и усиливаются при движениях.
  • Уменьшение или увеличение частоты пульса, что связано с ростом внутричерепного давления.
  • Изменения тонуса вегетативной НС, что сопровождается покраснением лица с последующим появлением резкой бледности. Это связано с периодическим расширением или сужением мелких кровеносных сосудов.
  • Головная боль, которая локализуется в затылке или в области действия травмирующего фактора. Возможно появление распирающих болей по всей голове.
  • Рост внутричерепного давления провоцирует сжатие ушного нерва. В результате пациент слышит шум, иногда звон в ушах.
  • Боль при движениях глазных яблок.
  • Нарушение координации.
  • Наблюдается чрезмерное возбуждение симпатической НС, что проявляется более активным функционированием потовых желез и повышенной потливостью.


Следует отметить, что симптомы сотрясения мозга классифицируются на ранние и поздние. К ранним проявлениям указанной травмы относят:

  • Измененная реакция зрачков. Наблюдают их сужение или расширение. Если только один зрачок меняется в размерах, это может указывать на более серьезные повреждения головного мозга.
  • Нистагм глазных яблок при отведении взгляда в сторону (пациенты не могут хорошо рассмотреть предметы, которые размещаются сбоку от них, им не удается сфокусировать взгляд, поэтому они вынуждены поворачивать голову).
  • Асимметрия сухожильных рефлексов.

Через несколько дней могут регистрироваться такие отдаленные проявления сотрясения:

  • Неадекватное восприятие звуков и света (возникают светобоязнь и непереносимость звуков даже умеренной громкости).
  • Вследствие нарушения нормальной взаимосвязи между клетками мозга, которые отвечают за эмоции, развивается депрессия. Пациенты капризны и чрезмерно раздражительны, плохо спят.
  • Амнезия – пациенты не помнят событий, которые произошли накануне травмы. Чем интенсивнее травма, тем длиннее период пострадавший не может вспомнить.
  • Невозможность сконцентрировать внимание – человек отвлекается, невнимателен.

Важно отметить, что у детей клиника несколько отличается. Так, у грудничков подобные травмы головы проявляются бледностью лица, ускоренным сердцебиением, рвотой после кормления, сонливостью и беспокойством. Потеря сознания отсутствует.

Сотрясение мозга не имеет четких диагностических проявлений. При данной травме череп без повреждений, давление цереброспинальной жидкости не меняется. УЗИ и МРТ также не проявляют смещений, расширений структур мозга или других травматических отклонений и нарушений. Часто под данную патологию маскируются более сложные повреждения головы, поэтому при наличии жалоб, которые указывают на сотрясение, следует пройти обследование в медицинском учреждении.

Врачебная диагностика

Но при СГМ не обойтись без профессиональных методик диагностики состояния пациента:

  • МРТ при сотрясении головного мозга.
  • Рентген черепа и шейной зоны позвоночника.
  • Энцефалография.
  • Компьютерная томография.
  • Эхоэнцефалоскопия.
  • Взятие спинномозговой пункции.
  • Исследования глазного дна.

Терапия

Конечно, самостоятельно искать таблетки от сотрясения головного мозга не стоит. Неправильное или недостаточное лечение чревато при СГМ следующим:

  • Хроническое нарушение равновесия.
  • Психические изменения.
  • Хроническое дрожание конечностей.
  • Посттравматические синдромы — сохранение повышенной утомляемости, стойкое нарушение памяти.

Терапия при СГМ назначается комплексная:

  • Седативные препараты.
  • Анальгетики.
  • Снотворные средства.
  • Метаболическая и сосудистая терапия.
  • Тонизирующие средства.

Лечение не будет эффективным, если пациент в течение 5-7 дней не станет соблюдать постельный режим. В зависимости от тяжести сотрясения, правильности следования советам доктора улучшение состояния больного наступает через пару недель.

Особенности режима

При нахождении дома на период восстановления больному следует соблюдать постельный режим. Его срок зависит от степени сотрясения. При этом важно помнить, что в эти дни противопоказаны:

  • просмотр телевизора;
  • чтение книг, газет, журналов;
  • работа или игра на компьютере;
  • долгие разговоры.

Нервное состояние больного стабилизируется при помощи седативных препаратов: таблеток Пустырника или Валерианы, капель Корвалола. Комната, где находится перенесший травму человек, должна хорошо проветриваться, температурный режим поддерживаться на отметке в 18-20 градусов.

Сон также является частью успешного восстановления, если его продолжительность составляет минимум 10 часов в сутки. Если наблюдается светобоязнь, то в комнате лучше задернуть шторы. Посторонние шумы следует исключить, но приятная расслабляющая музыка (не в наушниках!) пойдет на пользу.

Больной может находиться под наблюдением дежурного терапевта, если речь идет о домашнем восстановлении. В больнице наблюдение ведут хирург и невролог. В крайних случаях требуется консультация нейрохирурга.

Домашнее лечение

Возможно ли лечение сотрясения головного мозга в домашних условиях? Только в том случае, если это позволил ваш доктор: повреждение не столь серьезно, чтобы госпитализировать больного.

Тут прописывается следующее:

  • Соблюдение постельного режима, полноценный сон.
  • Отсутствие физических и психических нагрузок.
  • Прием прописанных медикаментозных препаратов. Назначаются средства для налаживания мозгового кровообращения, уменьшающие головную боль. Лекарства, избавляющие от таких неприятных симптомов, как тошнота и головокружение.
  • Могут быть назначены препараты с нейропротекторными свойствами — улучшающие протекание жизненно важных процессов в головном мозге.
  • В каких-то случаях необходим прием снотворных и успокаивающих препаратов.
  • На этапе реабилитации доктор может прописать ноотропные, общетонизирующие лекарства.

В продолжение месяца после травмы не рекомендуется заниматься спортом, тяжелой физработой. Нужно отказаться от длительного чтения, просмотра телевизора, пользования компьютером и смартфоном. Рекомендуется слушать спокойную музыку, но не используя наушники.

СГМ — повреждение, которое нуждается во врачебном контроле. Только доктор может назначить правильное лечение после комплексной диагностики. Все его предписания обязательны к исполнению! В противном случае пациент может получить хронические осложнения.

Особенности лечения и назначаемые медикаменты

После определения тяжести полученной травмы врач определяет особенности дальнейшей терапии. В случае легкого повреждения больной может проходить лечение в домашних условиях. При этом важно четко соблюдать назначения. Если травма тяжелая или средняя, лечение проводится в условиях стационара.

Назначаются ноотропные препараты – Ноотропил, Пирацетам, Пикамилон и др. Вазотропные препараты помогают предупредить осложнения на сосудистом уровне – Оксибрал, Теоникол, Вазотропин. Снизить утомляемость и повышенную раздражительность помогут Пантогам, Когитум и Вазобрал.

Мочегонные лекарственные препараты помогут исключить отек мозга. Витамины группы B, фолиевая кислота ускорят восстановление поврежденных нервных клеток. При сильных головных болях лечение бывает симптоматическим – врачи прописывают Пенталгин, Максилган. Иногда требуется прием транквилизаторов, например, Феназепама.

Тяжесть травмы влияет на срок восстановления. При самых тяжелых формах нахождение в стационаре затягивается на несколько месяцев. Легкая форма сотрясения лечится в течение пары недель. В любом случае больному показан щадящий режим.

КТ и МРТ при сотрясении головного мозга, что лучше и что покажет исследование.


 

Ежегодно в России от занятий спортом около полумиллиона людей получают черепно-мозговую травму и сотрясение головного мозга. По результатам обследования на КТ и МРТ при сотрясении головного мозга врачи травматологи и неврологи могут ответить пациенту на вопрос, насколько опасным оказалась для него эта травма, и каковы её последствия.


Диагностика головного мозга при сотрясении Какой метод диагностики — КТ или МРТ выбрать врачу при сотрясении головного мозга сильно зависит от того, как была получена травма, и как мозг человека в каждом индивидуальном случае отреагировал на удар. В большинстве случаев сразу после сотрясения или при потере сознания пациентом невролог скорее всего назначит компьютерную томографию головного мозга. Её можно сделать пациенту быстро, и она сразу даст ответ на критические для доктора вопросы:
  • есть ли перелом пластин черепа
  • есть ли угроза кровоизлияния и гематомы мозга.
А вот чтобы оценить состояние вещества и сосудистого русла головного мозга, а также проследить динамику после сотрясения головного мозга, МРТ головного мозга будет наиболее подходящим видом диагностики.

БЕСПЛАТНАЯ
КОНСУЛЬТАЦИЯ О ДИАГНОСТИКЕ

Если сомневаетесь, запишитесь на бесплатную консультацию.
Или проконсультируйтесь по телефону

+7 (812) 209-00-79


Что такое сотрясение головного мозга Человеческий мозг состоит из мягкой жировой ткани, по консистенции похожей на желе. Расположен он внутри защитных мембран и черепа. Все это должно обеспечить головному мозгу безопасное существование. Но даже малейшее внезапное столкновение или удар в голову может смесить мозг внутри черепной коробки. В отличие от желе, ткани головного мозга неоднородны. Мозг состоит из сложной нервной системы с более чем 90 миллионами нейронов, использующих длинные аксоны для передачи сигналов внутри организма и контроля тела. Такая структура весьма сложная и хрупкая, так что любое негативное воздействие на неё может повлиять на нейтронную сеть.

Нейроны от смещения головного мозга из-за удара могут растягиваться и рваться. Это нарушает их способность к сообщению сигналов. Кроме этого, поврежденные аксоны начинают распадаться, при этом выделяя вещества, которые могут навредить и другим нейронам. Это то, что происходит в веществе головного мозга при сотрясении. Поэтому даже легкое и, казалось бы, безобидное на первый взгляд сотрясение головного мозга, может иметь весьма негативные долгосрочные последствия для деятельности центральной нервной системы человека.  


Симптомы сотрясения головного мозга
  • потемнение в глазах;
  • головная боль;
  • нечеткое или расплывчатое зрение;
  • проблемы с равновесием;
  • изменении настроения и поведения;
  • проблемы с памятью, мышлением и сном.
Иногда сотрясение головного мозга может протекать вообще бессимптомно. Мозг каждого человека уникален, поэтому и реакция каждого пациента на сотрясение головного мозга может быть совершенно разной. В этом и заключается основная трудность в диагностике сотрясения головного мозга. И только с помощью аппаратных форм диагностики врачи могут оценить степень повреждения структур головного мозга после травмы и назначить релевантную терапию.   
 


Показывает ли МРТ и КТ сотрясение головного мозга Как правило, при подозрении на сотрясение головного мозга используют как МРТ, так и КТ. Эти два принципиально разных вида томографии в сумме смогут показать полную картину того, что случилось с головным мозгом человека при травме, и каких последствий следует ожидать. КТ при сотрясении головного мозга поможет оценить состояние всех костных структур черепной коробки и ответить на вопрос, есть ли черепные трещины и переломы в результате удара. Также компьютерная томография четко покажет угрозу возникновения кровоизлияния, если сосуды головы были повреждены при сотрясении. МРТ после сотрясения головного мозга даст исчерпывающую информацию о состоянии вещества головного мозга и сосудистого русла. Она также будет использоваться доктором как ежегодная контрольная форма обследования, чтобы наблюдать за состоянием головного мозга после травмы.
 
Следует помнить, что в отдельных случаях симптомы сотрясения головного мозга могут развиваться довольно медленно, и дегенеративные изменения в мозгу случаются через несколько месяцев или лет после момента удара. Иногда сотрясение головного мозга может возникнуть, когда не было прямого сильного воздействия на голову. Такие травмы обладают едва заметными симптомами, но могут приводить к гораздо более серьезным последствиям. Особенно, если это происходит неоднократно. Как пример можно взять футболистов, которым часто приходится принимать мяч головой. При помощи диффузионной МРТ во время исследования 2013 года ученые оценивали, какое влияние игра оказала на мозг футболистов.

В ходе МРТ обследования головы медики смотрели, как слабые, но неоднократные удары меча по голове могут изменить структуру мозга. В результате было обнаружено, что спортсмены, которые взаимодействовали с мячом головой более 1800 раз за год, повредили целостность структур своих аксонов. От этого у игроков заметно ухудшились результаты тестов на память и концентрацию. Этот эксперимент наглядно показал, как даже при отсутствии формальной травмы любые воздействия на мозг человека оставляют свой негативный след. Поэтому, если Вы занимаетесь активными видами спорта, где задействованы спина и голова, в обязательном порядке раз в год в качестве профилактики развития болезней головного мозга нужно проходить комплексное обследование головы на МРТ и КТ.


Неприятные последствия сотрясения головного мозга После сотрясения некоторые люди могут испытывать посткоммоционный синдром (ПКС). Это грозит человеку постоянными головными болями, проблемами с концентрацией и поведенческими изменениями, которые могут проявляться в течение нескольких месяцев или лет после черепно-мозговой травмы. Медицинская статистика показывает, что имея сотрясение головного мозга, раннее возращение к сильным нагрузкам или занятию активными видами спорта увеличивает риски появления ПКС. Поэтому так важно терпеливо соблюдать предписанный неврологом постельный режим в течение 7-10 дней после сотрясения.

Также из-за черепно-мозговой травмы у человека может развиться энцефалопатия (невоспалительное заболевание мозга). Больные этим недугом страдают от резкой смены настроения, проблем с мышлением и памятью, что в свою очередь может привести к деменции и слабоумию. Считается, что виной тому тау-белок (MAPT). В частности, он нужен для поддержания крошечных трубочек внутри аксонов. Врачи утверждают, что удары в голову способны повредить эти микротрубочки, что вызывает скопление тау-белков и нарушение коммуникационных функций нейронов. Чтобы избежать возможных отрицательных последствий после черепно-мозговой травмы, больному, даже если травма прошла на первый взгляд бессимптомно, обязательно нужно обратиться к неврологу и сделать КТ и МРТ после сотрясения головного мозга.

Где сделать МРТ или КТ головы при сотрясении головного мозга — адреса клиник

Список первоисточников

  1. Святская Е.Ф. Роль компьютерной томографии в оценке последствий черепно-мозговой травмы // Современные диагностические технологии в медицине. Материалы республиканской конференции. Минск, 2000.
  2. Слободин К.Э. Диагностические возможности компьютерной томографии при изменении ликворосодержащих структур головного мозга: Автореф. дисс. . канд. мед. наук / СПб., 1996. 
  3. Черепно-мозговая травма. Клиническое руководство / Под ред. А.Н. Коновалова, Л.Б. Лихтермана, A.A. Потапова. М.: Антидор, ИД Энциклопедия» Интернешнл, 2001. 
  4. Алексеенко Ю.В., Протас Р.Н., Лукомский И.В, Патогенез, клиника и диагностика легкой черепно-мозговой травмы. Обзор // Здравоохр. Беларуси. -1995.-№7.-С. 31-34.
  5. Петрова М.Ю. МРТ-диагностика последствий черепно-мозговой травмы / М.Ю. Петрова, П.Д Хазов // Материалы 4-го Рос. науч. форума «Радиология 2003». М, 2003. — С. 229-230.
  6. Антиоксиданты при ЧМТ // Нейротравматология: Справочник / Под ред. акад. РАМН А.Н.Коновалова, проф. Л.БЛихтермана, проф. А.А.Потапова. -М.: Вазар-Ферро, 1994. С. 16.
  7. Волошин П.В., Привалова Н.Н., Хомская Е.Д., Черненков В.Д. Острый период сотрясения головного мозга: Динамика клинических и нейропсихологических симптомов // Жури, неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. -1993.-№ 1.-С. 43-48.
  8. Дралюк Н.С. Сотрясение головного мозга // Актуальные вопросы черепно-мозговой травмы и другой ургентной патологии при повреждениях и заболеваниях нервной системы: Сб. науч. тр. / Редкол.: Н.С.Дралюк (отв. ред.) и др. Красноярск, 1990. — С. 15-19.
  9. Теленгатор А.Я., Готлиб В.А. Комплексная диагностика у больных с последствиями сотрясения головного мозга // Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1992. — № 3. — С. 40-42.
  10. Marion DW, Grimes JB, Hinds Ii SR, Lewis J, Baugh L, Stockinger ZT. MRI in Management of Mild TBI/Concussion in the Deployed Setting. Mil Med. 2018;183(suppl_2):65-66.
  11. Næss-Schmidt ET, Blicher JU, Tietze A, et al. Diffusion MRI findings in patients with extensive and minimal post-concussion symptoms after mTBI and healthy controls: a cross sectional study. Brain Inj. 2018;32(1):91-98.
  12. Nencka AS, Meier TB, Wang Y, et al. Stability of MRI metrics in the advanced research core of the NCAA-DoD concussion assessment, research and education (CARE) consortium. Brain Imaging Behav. 2018;12(4):1121-1140

Полезная информация

Покажет ли КТ опухоль головного мозга

Одним из самых новейших и высокоинформативных методов распознавания опухолей головного мозга является компьютерная томография. Ее работа основана на возможности тканей человеческого организма взаимодействовать с рентгеновскими лучами и предоставляет возможность очень быстро и безболезненно выполнить послойное сканирование нужного участка.

читать далее +

Что покажет МРТ головы

МРТ головы помогает выявить неврологические и нейрохирургические патологии, диагностика которых часто вызывает сложности даже у опытных врачей. А ведь от скорости и точности поставленного диагноза может зависеть не только здоровье, но и жизнь человека. Здесь на помощь специалистам приходит магнито-резонансная томография, будучи одной из наиболее быстрых и точных диагностических процедур. Это исследование

читать далее +

Что покажет МРТ головного мозга

МРТ головного мозга – это хорошо апробированный и надежный метод диагностики, который основывается на свойствах магнитного поля и отличается повышенной информативностью и точностью. Суть метода заключается в том, что под воздействием радиомагнитных импульсов в органах человека возникают ответные волновые сигналы, которые с помощью компьютера томографа преобразовываются в изображения в нескольких

читать далее +

 
 

Альтернативные расшифровки стенограммы в вариантной интерпретации: возможность пропущенного диагноза и неправильного диагноза

Цель: Рекомендации профессиональных организаций по оценке патогенности вариантов включают рекомендации по использованию биологически значимых транскриптов; тем не менее, существует вариативность выбора транскриптов в лабораториях.

Методы: Мы описываем трех пациентов, геномные результаты которых оказались неверными, поскольку альтернативные транскрипты и образцы тканевой экспрессии не рассматривались коммерческими лабораториями.

Полученные результаты: У индивидуума 1 патогенный кодирующий вариант в изоформе CKDL5, экспрессируемой мозгом, был пропущен дважды при секвенировании, потому что вариант был интронным в транскриптах, рассматриваемых в анализе. У индивидуума 2 микроделеция, затрагивающая KMT2C, не была обнаружена на микрочипе, поскольку делеции проксимальных экзонов в этом гене наблюдаются у здоровых людей; однако у этого человека была более дистальная делеция, включающая экспрессируемую мозгом изоформу KMT2C, что дало ей диагноз синдрома Клифстры.Сообщалось, что у индивидуума 3 имеется патогенный вариант в экзоне 10 OFD1 на экзоме, но не было типичных признаков нарушений, связанных с OFD1. Поскольку экзон 10 сплайсирован из более биологически релевантных транскриптов OFD1, было определено, что у него не было нарушения OFD1.

Заключение: Эти примеры иллюстрируют важность рассмотрения альтернативных транскриптов как потенциального мешающего фактора, когда генетические результаты отрицательны или не соответствуют фенотипу.

Ключевые слова: альтернативная сварка; хромосомный микрочип; секвенирование экзома / генома; изоформы; расшифровка выражения.

Страница не найдена «Бюллетень стенограммы Туэле — Новости в Туеле, штат Юта.

Бесплатный звонок:
(866) 721-9992

Местный:
(435) 882-0050

Факс:
(435) 882-6123

Электронная почта:
тбп @ tooeletranscript.ком


Часы работы
Понедельник — Пятница:
8:30 — 17:30
Закрыто Сб. & Солнце.

В бюллетене Tooele Transcript Bulletin мы предоставляем самые свежие новости и рекламу для округа Туэле, штат Юта. Наша газета, выходящая дважды в неделю, была основана в 1894 году и уже почти 120 лет обслуживает читателей и общественность.
Помимо газет, мы предоставляем широкий спектр печатных, цифровых и стратегических услуг. У нашей материнской компании, Transcript Bulletin Publishing, есть штатные графические дизайнеры, фотографы, писатели, журналисты и технические специалисты, которые создают классные вещи, от печатных материалов и веб-сайтов до вывесок и графики.Хотите, чтобы ваш бизнес или организация выглядели свежо и увлекательно — без ущерба для бюджета? Мы можем помочь. Посетите наш сайт www.tbpublishing.com ViewAnniversariesBabiesBirthdaysBlast

ArticlesSelect Категорияа Better LifeA студента из PastBook ReviewsBreaking NewsBulletin BoardChildren юстиции CenterChristmas WritingClerk в CornerCommunity NewsCritter ChatterEditor в NotebookEditorialsFamily TiesFeatured NewsFinancial FocusFrom HeartFrom SidelinesFront-Page FlashbackGarden SpotHand руку с ElayneHomefrontHometownHonors, Награды и GraduationsHorse WhispererIn Good HealthLetters к EditorMake Один большой DishMatters из FaithMIlitaryMissionariesMoments Какао в понедельник Выберите месяц Август 2021 (147) Июль 2021 (164) Июнь 2021 (152) Май 2021 (181) Апрель 2021 (182) Март 2021 (185) Февраль 2021 (181) Январь 2021 (178) Декабрь 2020 (199) Ноябрь 2020 ( 150) октябрь 2020 (216) сентябрь 2020 (193) август 2020 (179) июль 2020 (154) июнь 2020 (176) май 2020 (130) апрель 2020 (161) март 2020 (207) февраль 2020 (180) январь 2020 ( 201) декабрь 2019 (201) ноябрь 2019 (177) октябрь 2019 (225) сентябрь 2019 (190) август 2019 (196) июль 2019 (176) июнь 2019 (175) май 2019 (225) апрель 2019 (219) март 2019 ( 181) Февраль 2019 (186) Январь 2019 (218) Декабрь 2018 (197) Ноябрь 2018 (193) Октябрь 2018 (215) Сентябрь 2018 (187) Август 2018 (213) Июль 2018 (225) Июнь 2018 (198) Май 2018 ( 269) апрель 2018 г. (187) март 2018 г. (221) февраль 2018 г. (192) январь 2018 (199) декабрь 2017 г. (199) ноябрь 2017 г. (221) октябрь 2017 г. (227) сентябрь 2017 г. (199) август 2017 г. (252) июль 2017 г. ( 200) Июнь 2017 г. (254) Май 2017 г. (220 ) Апрель 2017 (197) март 2017 (226) февраль 2017 (236) январь 2017 (238) декабрь 2016 (230) ноябрь 2016 (232) октябрь 2016 (238) сентябрь 2016 (248) август 2016 (257) июль 2016 (230) ) Июнь 2016 (255) май 2016 (247) апрель 2016 (228) март 2016 (270) февраль 2016 (224) январь 2016 (218) декабрь 2015 (255) ноябрь 2015 (211) октябрь 2015 (264) сентябрь 2015 (255) ) Август 2015 (263) Июль 2015 (265) Июнь 2015 (261) Май 2015 (244) Апрель 2015 (270) Март 2015 (276) Февраль 2015 (229) Январь 2015 (241) Декабрь 2014 (304) Ноябрь 2014 (241) ) Октябрь 2014 г. (289) Сентябрь 2014 г. (294) Август 2014 г. (252) Июль 2014 г. (316) Июнь 2014 г. (282) Май 2014 г. (292) Апрель 2014 г. (292) Март 2014 г. (272) Февраль 2014 г. (259) Январь 2014 г. (272) ) Декабрь 2013 г. (258) ноябрь 2013 г. (253) октябрь 2013 г. (323) сентябрь 2013 г. (246) август 2013 г. (298) июль 2013 г. (293) июнь 2013 г. (265) май 2013 г. (316) апрель 2013 г. (318) март 2013 г. (287) ) Февраль 2013 г. (259) Январь 2013 г. (306) D декабрь 2012 (285) ноябрь 2012 (276) октябрь 2012 (294) сентябрь 2012 (89) август 2012 (37) июль 2012 (37) июнь 2012 (18) май 2012 (19) апрель 2012 (246) март 2012 (300) Февраль 2012 (250) Январь 2012 (13) Декабрь 2011 (29) Ноябрь 2011 (15) Октябрь 2011 (9) Сентябрь 2011 (11) Август 2011 (13) Июль 2011 (9) Июнь 2011 (17) Май 2011 (12) Апрель 2011 (8) Март 2011 (11) Февраль 2011 (12) Январь 2011 (13) Декабрь 2010 (9) Ноябрь 2010 (10) Октябрь 2010 (12) Сентябрь 2010 (11) Август 2010 (12) Июль 2010 (9) Июнь 2010 г. (10) май 2010 г. (9) апрель 2010 г. (9) март 2010 г. (6) февраль 2010 г. (4) январь 2010 г. (6) декабрь 2009 г. (9) ноябрь 2009 г. (6) октябрь 2009 г. (8) сентябрь 2009 г. (71) Август 2009 г. (7) июль 2009 г. (8) июнь 2009 г. (3) май 2009 г. (6) апрель 2009 г. (1) март 2009 г. (2) февраль 2009 г. (2) январь 2009 г. (3) декабрь 2008 г. (4) ноябрь 2008 г. (4) Октябрь 2008 г. (7) сентябрь 2008 г. (3) август 2008 г. (4) июль 2008 г. (6) июнь 2008 г. (4) май 2008 г. (4) 2 апреля 008 (7) март 2008 г. (5) февраль 2008 г. (5) январь 2008 г. (4) декабрь 2007 г. (5) ноябрь 2007 г. (4) октябрь 2007 г. (2) сентябрь 2007 г. (6) август 2007 г. (1) май 2005 г. (276) апрель 2005 (310) Март 2005 (323) Февраль 2005 (101)

Дрожжевой транскрипционный фактор Crz1 активируется светом Ca2 + / кальциневрин-зависимым и PKA-независимым образом

Abstract

Свет в видимом диапазоне может вызывать стресс у нефотосинтезирующих организмов.Ранее сообщалось, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae реагируют на синий свет посредством активации стресс-регулируемого фактора транскрипции Msn2p. Изменения окружающей среды также вызывают активацию кальциневрина, Ca 2+ / кальмодулин-зависимой фосфатазы, которая, в свою очередь, контролирует транскрипцию гена путем дефосфорилирования фактора транскрипции Crz1p. Мы исследовали связь между клеточным стрессом, вызванным синим светом, и передачей сигналов Ca 2+ у дрожжей, отслеживая динамику ядерной локализации Crz1p, Msn2p и Msn4p.Эти три белка демонстрируют совершенно разные реакции на стресс в зависимости от воздействия света. Msn2p и, в меньшей степени, Msn4p быстро колеблются между ядром и цитоплазмой очевидно стохастическим образом. Crz1p, напротив, обнаруживает быструю и постоянную ядерную локализацию, индуцированную освещением, которое запускает Crz1p-зависимую транскрипцию его гена-мишени CMK2 . Более того, повышенные уровни внеклеточного Ca 2+ стимулируют индуцированные светом ответы всех трех факторов транскрипции, например.грамм. Crz1p локализуется в ядре намного быстрее, и большая часть клеток обнаруживает постоянную ядерную локализацию Msn2p при более высокой концентрации Ca 2+ . Исследования на мутантах, лишенных переносчиков Ca 2+ , показывают, что приток внеклеточного Ca 2+ имеет решающее значение для начальных этапов светоиндуцированной ядерной локализации Crz1p, в то время как мобилизация внутриклеточных запасов Ca 2+ , по-видимому, необходима для устойчивого ответа. . Важно отметить, что мы обнаружили, что ядерная локализация Crz1p зависит от кальциневрина и белка-носителя Nmd5p, в то время как на него не влияет повышенная активность протеинкиназы A (PKA), которая сильно ингибирует индуцированную светом ядерную локализацию Msn2 / 4p.Мы пришли к выводу, что два центральных сигнальных пути, цАМФ-PKA-Msn2 / 4 и Ca 2+ -кальциневрин-Crz1, активируются синим светом.

Образец цитирования: Bodvard K, Jörhov A, Blomberg A, Molin M, Käll M (2013) Фактор транскрипции дрожжей Crz1 активируется светом Ca 2+ / кальциневрин-зависимым и PKA-независимым образом. PLoS ONE 8 (1): e53404. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404

Редактор: Мартина Бассилана, Université de Nice-CNRS, Франция

Поступила: 31.05.2012; Принята к печати: 28 ноября 2012 г .; Опубликовано: 15 января 2013 г.

Авторские права: © 2013 Bodvard et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Авторы выражают признательность за финансовую поддержку Шведскому фонду стратегических исследований. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Клетки дрожжей постоянно подвергаются воздействию разнообразных внешних условий, с которыми им необходимо справляться для максимального роста и выживания в естественной среде. Для поддержания оптимальных внутренних условий (т.е. гомеостаза) был разработан разнообразный набор механизмов, функций управления и стратегий. В отличие от высших эукариот, одноклеточные организмы, такие как почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae , не могут использовать специализированную ткань для защиты от широкого спектра экологических проблем, таких как изменение температуры, pH, токсические агенты, осмолярность, а также ультрафиолетовое или видимое освещение.Вместо этого весь организм должен иметь возможность быстро адаптироваться к изменениям окружающей среды, чтобы противостоять ущербу. Естественно, что один набор механизмов, оптимизированных для противодействия определенному внешнему стрессу, может не подходить для другого типа нарушения, то есть многие реакции на стресс являются специфическими и часто очень сложными. Например, сигнальные пути по-разному реагируют на разные типы стрессов, и их ответы также могут зависеть от предыдущих клеточных «состояний» [1]. В целом структура сигнальных путей, которые контролируют экспрессию индуцированных стрессом генов у дрожжей, довольно хорошо охарактеризована, но гораздо меньше известно о динамическом поведении сигнальных компонентов, в частности, на уровне отдельных клеток.Чтобы понять молекулярные механизмы, с помощью которых дрожжевые клетки регулируют стрессовые реакции, важно определить пространственную и временную динамику факторов транскрипции, которые участвуют в инициации и контроле индуцированной стрессом экспрессии генов. Предыдущие исследования показали, что как фактор транскрипции цинкового пальца Crz1p [2], так и факторы транскрипции общего стрессового ответа Msn2p и Msn4p контролируют экспрессию генов посредством ядерно-цитоплазматических колебаний [2], [3], [4], [5], [6] , [7], [8].Три фактора транскрипции также участвуют в ответе на множественные экологические проблемы [1], [9], [10], [11], [12]. В этой статье мы фокусируемся на связи между сигнализацией Ca 2+ и освещением видимым светом и сообщаем о сравнительном исследовании динамики временной локализации этих факторов транскрипции в отдельных клетках, подверженных одинаковому уровню светоиндуцированного стресса.

Ответы на стресс у дрожжей включают несколько интегрированных сигнальных каскадов [13], которые можно в общих чертах разделить на общий компонент, реакцию на стресс окружающей среды (СОЭ) [10], [11], [14] и другие системы, которые реагируют на более специфические изменения окружающей среды [11], [12], [15].Одной из наиболее универсальных сигнальных молекул является Ca 2+ , которая выполняет важные функции как в одноклеточных, так и в многоклеточных организмах [16]. Ca 2+ -зависимые сигнальные пути могут быть индуцированы либо повышенными цитозольными уровнями Ca 2+ , рекрутируемыми из секреторных компартментов, которые в эукариотических клетках содержат высокие концентрации Ca 2+ , либо повышенным притоком из внеклеточных источников [ 17]. В S. cerevisiae Ca 2+ передача сигналов имеет решающее значение для выживания клеток во время воздействия различных стрессов окружающей среды, включая высокие концентрации солей, щелочной pH и повреждение клеточной стенки.Эти условия вызывают увеличение цитозольного Ca 2+ [18]. В нормальных условиях цитозольная концентрация Ca 2+ поддерживается в пределах 50–200 нМ в активно отрастающих клетках, даже когда внеклеточные условия варьируются от <1 мкМ до> 100 мМ [19]. Внутриклеточная концентрация контролируется хорошо охарактеризованной гомеостатической системой, состоящей из насосов, обменников и каналов Ca 2+ [18], [20]. Когда цитозольные уровни Ca 2+ увеличиваются, сенсорный белок Ca 2+ кальмодулин связывается и активирует кальциневрин, хорошо консервативную протеинфосфатазу.Кальциневрин, в свою очередь, дефосфорилирует Crz1p [21], который затем перемещается из цитозоля в ядро, где он связывается с промоторными последовательностями, называемыми CDRE (кальциневрин-зависимый ответный элемент), и активирует примерно 160 генов, участвующих в адаптации к стрессу [12] , [22]. Эти гены участвуют в ряде различных функций, включая целостность клеточной стенки и ионный гомеостаз [18], а также в генах, индуцируемых, например, во время воздействия H 2 O 2 и тепловой шок [12].

Факторы транскрипции Msn2p и Msn4p [23] были идентифицированы как основные общие индукторы ответа на стрессы окружающей среды у почкующихся дрожжей [13].Во время стресса Msn2p и Msn4p перемещаются к ядру, где они влияют на экспрессию примерно 180 генов [10], [11] путем связывания с STREs (элементы ответа на стресс) в промоторах генов-мишеней. Известно, что несколько стрессов вызывают нуклеоцитоплазматические колебания Msn2p, включая высокие концентрации внеклеточного Ca 2+ [2], ограничение калорийности (низкий уровень глюкозы 0,1%) [5], [8], окислительный и осмотический стресс [5], а также свет [3], [4], [6], [7]. Локализация в ядре отрицательно коррелирует как с уровнем цАМФ, так и с активностью протеинкиназы A (PKA) [24], [25].Msn2p и Msn4p обнаруживают 41% идентичности на уровне аминокислот и сходны по размеру [23]. Первоначально считалось, что они выполняют сходные функции в ответной реакции на стресс [23], [26], но более поздние исследования вместо этого показывают, что Msn2p и Msn4p по-разному влияют на индукцию генов [27], [28] как в генах, так и в стрессовых ситуациях. конкретным образом [1]. Более того, гены-мишени Msn2p и Msn4p, по-видимому, не являются необходимыми для выживания против одного тяжелого стресса. Напротив, они кажутся более важными для выживания после вторичного стресса после легкого несмертельного первичного стресса, так называемой приобретенной стрессоустойчивости [1].

Следуя временной и пространственной динамике фактора транскрипции Msn2p, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP) с помощью флуоресцентной микроскопии, мы ранее продемонстрировали, что непрерывное воздействие синего света приводит к кумулятивному клеточному стрессу, скорее всего, из-за накопления токсичных фотопродуктов [3 ]. Индуцированный светом стресс приводит к кажущемуся стохастическому перемещению популяции Msn2p в клетке из цитоплазмы в ядро, что зависит от нескольких факторов, включая интенсивность света [3], [4], [6], [7].Здесь мы сообщаем, что Crz1p также активируется во время освещения, то есть он локализуется в ядре и активирует экспрессию генов. Мы количественно охарактеризовали его временную картину локализации для популяции клеток (N≈100) и сравнили результаты с ядерно-цитоплазматическим перемещением, наблюдаемым для Msn2p и Msn4p при идентичных условиях освещения. Хотя три фактора транскрипции отвечают на одном уровне интенсивности света, они ведут себя совершенно по-разному в том смысле, что Crz1p обнаруживает по существу постоянную локализацию в ядре, тогда как Msn2p и Msn4p осциллируют.Поведение, наблюдаемое для Crz1p, также резко отличается от ранее описанного ответа после воздействия высоких внеклеточных уровней Ca 2+ [2], что приводит к стохастическим «всплескам» ядерной локализации. Кроме того, мы сообщаем, что индуцированная светом ядерная локализация Crz1p зависит от кальциневрина, но не зависит от активности PKA. Более того, было обнаружено, что реакции ядерной локализации Crz1p и до некоторой степени Msn2p сильно стимулируются внеклеточным Ca 2+ .Помимо определения новой роли Crz1p в клеточном ответе на освещение, наши результаты подчеркивают индуцированную светом активацию двух центральных сигнальных путей, cAMP-PKA-Msn2 / 4 и Ca 2+ -calcineurin-Crz1.

Материалы и методы

2.1 Клетки и культивирование

Гаплоидные дрожжевые клетки S. cerevisiae (BY4742) с генотипом MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 были использованы на протяжении всего исследования. Штаммы с одиночной делецией, за исключением nmd5 Δ (подробности см. Ниже), были получены из коллекции делеций дрожжей EUROSCARF [29].Гаплоидные штаммы дикого типа и штаммы с единственной делецией трансформировали плазмидами, экспрессирующими Msn2-GFP, Msn4-GFP или Crz1-GFP. Msn2-GFP экспрессировался из плазмиды pAMG [25] на основе YCplac111, контролируемой промотором ADh2 и содержащей маркер LEU2 . Crz1-GFP экспрессировался из плазмиды pKK249 [30], контролируемой промотором MET25 и содержащей маркер URA3 . Msn4-GFP экспрессировался таким же образом, как Msn2-GFP, с использованием плазмиды pGR247 [6], которая была получена из pAMG, в которой ORF MSN2 была заменена ORF MSN4 из плазмиды pAL32-45.Штамм YAJ92 ( nmd5Δ ) был создан путем удаления NMD5 в штамме BY4742 по одностадийному ПЦРУ целевого метода разрушения гена [31] с использованием следующих праймеров олигонуклеотидов ( nmd5Δ ФВ TTTCAGCATAATCAATCATTTTTCGTCTGGATATTTGACACAATTTTGATTTTGACGAAGACATTTTATTCTCGATAATACGATTTAGGTGACACTATAG, nmd5Δ оборотов TTGAGCATAATATCCTCTCTCTTCTATCTAAATTATGTAATCCAGTGTTTGTTTCAATATACAATCGCCATTTAATTCAAATACGACTCACTATAGGGAG) и плазмиды pFA6-kanMX4 в качестве шаблона. Правильная интеграция подтверждена диагностической ПЦР.Штаммы YAJ85 (Cmk2-GFP дикого типа) и YAJ89 ( crz1Δ Cmk2-GFP) были получены путем скрещивания BY4741 Cmk2-GFP с BY4742 crz1Δ :: kanMX4 (оба из EUROSCARF) и отбора прототрофных, гистидных прототрофных метионинов. ауксотрофное к лизину и чувствительное к G418 (YAJ85) или устойчивое к G418 (YAJ89) потомство. YAJ85 — это MAT a, а YAJ89 — это MATα .

Штаммы выращивали при 30 ° C в синтетической среде определенного состава, содержащей дрожжевую азотную основу (Formedium ™) с сульфатом аммония (0.5%), глюкоза (2%) и полная смесь добавок без соответствующих аминокислот и нуклеотидных оснований (-лейцин для экспериментов с Msn2-GFP и Msn4-GFP, и -метионин и -урацил для экспериментов с Crz1-GFP), забуференные до pH 5.8 с 1% янтарной кислотой и 0,6% NaOH. В экспериментах с разными [Ca 2+ ] использовалась одна и та же среда, но сульфат аммония был заменен хлоридом аммония 3,5 г / л (Sigma), а CaCl 2 (Sigma) был использован для установки [Ca 2+ ]. Среда без CaCl 2 все еще содержала следовые количества Ca 2+ , происходящего из пантотената кальция (0.4 мг / л ∼ 0,8 × 10 −3 мМ). Ночные культуры инокулировали утром и вырастали до OD 600 0,4–0,5 в начале эксперимента с микроскопией. Если указано, добавление EGTA (этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ’, N’-тетрауксусной кислоты) до конечной концентрации 5 мМ производили из 200 мМ исходного раствора (pH 8,0).

2.2 Флуоресцентная микроскопия

Изображения были получены с использованием автоматического эпифлуоресцентного микроскопа (TE2000E-PFS, Nikon Instruments), оснащенного масляным иммерсионным объективом 60X (NA1.4, Plan Apochromatic, Nikon Instruments) и камеру на ПЗС-матрице с электронным умножением (iXon DU-885-CS0- # VP, Andor Technology). Возбуждение GFP и одновременная индукция стресса осуществляли путем непрерывного освещения синим светом (450–490 нм), как описано ранее [3]. Изображения светлого поля с небольшим смещением фокуса собирались раз в минуту, чтобы облегчить распознавание клеток во время анализа изображений. Интенсивность света была установлена ​​на 26 мкВт (0,10 Дж · см −2 · с −1 ), 58 мкВт (0,23 Дж · см −2 · с −1 ) и 115 мкВт (0.45 Дж · см ( −2 · с −1 ), комбинируя различные фильтры нейтральной плотности и поддерживая постоянной на протяжении всех экспериментов. Освещенная площадь составляла 2,57 × 10 −4 см 2 . Флуоресцентные изображения получали непрерывно в течение не менее 60 минут в одной фокальной плоскости со временем сбора данных 800 мс — 4 с с использованием программного обеспечения NIS-elements. Временное разрешение соответствовало примерно 4 секундам для всех экспериментов с факторами транскрипции. Во время экспериментов под микроскопом клетки хранили в перфузионной камере FCS2 (Bioptechs Inc.) при 28 ° C, чтобы избежать реакции на тепловой стресс. Свежую среду добавляли в камеру непосредственно перед началом эксперимента. Покровные стекла были предварительно покрыты в течение 1,5 часов лектиновым белком Конканавалином А (ConA), 0,5 мкг / мкл в 0,01 M PBS, для иммобилизации дрожжевых клеток на поверхности. Покрытие не вызывало стрессовой реакции. После каждого эксперимента клетки, окружающие освещенную область, были визуализированы, чтобы гарантировать, что только клетки, которые были освещены, демонстрируют ядерную локализацию, что исключает возможные ошибки в настройке или неконтролируемые факторы, которые могут привести к индукции стресса.Каждое условие и штамм тестировались как минимум дважды, и результаты основаны на 80–258 клетках, в зависимости от количества клеток, захваченных во время каждого прогона.

В случае Cmk2-GFP клетки освещали в течение 40 минут (115 мкВт). Для отслеживания изменений флуоресценции после того, как изображения стресса, вызванного светом, снимались каждые 10 минут в течение 5 часов, оставляя клетки в темноте между изображениями. Там, где указано, ингибитор транскрипции 1,10-фенантролин добавляли в среду непосредственно перед освещением до конечной концентрации 100 мкг / мл из исходного раствора 100 мг / мл (в этаноле).

2.3 Анализ изображений

Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения CellStat [32], которое определяет контуры клеток и извлекает флуоресцентные данные на основе алгоритмов, описанных в [33]. В сглаженной по Гауссу версии исходного флуоресцентного изображения самый яркий пиксель и окружающие его пиксели в радиусе 3 пикселя определялись как ядро. Чтобы уменьшить колебания из-за, например, При изменении размера вакуолей или слегка ошибочных контурах клеток 90 самых ярких пикселей из оставшихся пикселей клетки считались представляющими цитозоль.Для оценки динамики ядерно-цитоплазматической локализации фактора транскрипции использовали соотношение для каждой временной точки между средней интенсивностью в ядре и средней интенсивностью в цитозоле. Траектория локализации, используемая при анализе сигнала, определялась путем вычитания единицы из этого отношения, так что локализация ядер не была установлена ​​приблизительно равной нулю. Траектории ядерной локализации можно найти в дополнительных таблицах данных.

Чтобы оценить влияние более высоких, чем нативный, уровней Crz1p на световой ответ, мы сравнили ответы клеток, выращенных с метионином или без него (экспрессия Crz1-GFP контролируется промотором MET25 в pKK249).В среде, содержащей метионин, флуоресценция GFP была по крайней мере в 4 раза ниже, чем в среде, используемой для настоящих исследований Crz1p, в которой отсутствовал метионин, но мы не смогли увидеть никаких различий в структуре ядерной локализации Crz1p при освещении (данные не показаны).

Для оценки изменений Cmk2-GFP использовали среднюю флуоресценцию в каждой клетке (Cell). Среднее значение фона (BG) рассчитывалось для произвольной области без ячеек. Затем был рассчитан общий средний ответ населения

2.4 Анализ сигналов

Ядерные локализации были идентифицированы путем определения траектории локализации. Фильтр скользящего среднего из 5 кадров сначала отфильтровал траекторию локализации, а затем был создан двоичный сигнал с применением порога 0,28. Значения выше порога представляют собой ядерную локализацию. Периоды ядерной локализации и отсутствия ядерной локализации менее 5 кадров (∼20 с) были превращены в отсутствие ядерной локализации и ядерной локализации соответственно.

На протяжении всей статьи U-критерий Манна – Уитни [34] использовался для оценки того, принимает ли набор данных большие значения, чем другой набор данных.Тест основан на рангах и, следовательно, является непараметрическим, то есть не делает никаких предположений о принадлежности данных к определенному распределению, что делает его подходящим выбором в этом приложении, где, в частности, нельзя предположить гауссовское распределение.

Результаты

3.1 Непрерывное воздействие синего света вызывает ядерную локализацию Crz1p с явно отличающейся структурой ядерно-цитоплазматической локализации по сравнению с Msn2p и Msn4p

В этом исследовании мы обнаружили, что дрожжевой транскрипционный фактор Crz1p, мишень для кальциневрина Ca 2+ / кальмодулин-зависимой фосфатазы, быстро локализуется в ядре практически во всей популяции клеток во время воздействия непрерывного синего света (450–490 нм). ).Рис. 1A – C показана типичная траектория локализации (степень ядерной локализации в индивидуальной клетке в зависимости от времени) для Crz1p, Msn2p и Msn4p при наивысшей протестированной интенсивности света (115 мкВт). Crz1p мигрирует в ядро ​​примерно через 20 минут освещения, а затем остается там до конца эксперимента (рис. 1A). Напротив, Msn2p колеблется между цитоплазмой и ядром очевидно стохастическим образом, как сообщалось ранее [4], [6], прежде чем также постоянно локализоваться в ядре (рис.1Б). Три последовательных состояния локализации, наблюдаемые для Msn2p, то есть цитоплазматическая локализация, нуклеоцитоплазматические колебания и постоянная ядерная локализация, хорошо согласуются с нашим предыдущим сообщением об этом феномене [3]. Траектория локализации для Msn4p (Fig. 1C) довольно сильно отличается от Msn2p и Crz1p в том смысле, что она обнаруживает колебательный ответ, но никогда не обнаруживает устойчивой ядерной локализации.

Рис. 1. Реакции ядерно-цитоплазматической локализации Crz1p, Msn2p и Msn4p при непрерывном воздействии синего света.

(A) — (C) Траектории ядерной локализации в отдельной клетке и (D) — (L) профили временной нуклеоцитоплазматической локализации для популяций 80–100 клеток, извлеченные из изображений флуоресцентной микроскопии для Crz1-GFP (левый столбец), Msn2 -GFP (средний столбец) и Msn4-GFP (правый столбец) при трех различных интенсивностях света (строки). (A) — (C) Горизонтальная линия представляет порог, используемый для определения ядерной локализации. (D) — (L) Ядерная локализация (цветовая шкала) визуализирует относительную интенсивность флуоресценции между ядром и цитоплазмой в отдельных клетках ((I ядро ​​ / I цитозоль ) -1).Crz1p постоянно проникает в ядро ​​сравнительно однородным образом по всей популяции клеток и иногда проявляет только одно или два колебания в некоторых клетках до постоянной ядерной локализации (A, D, G и J). Обратите внимание на другую шкалу времени в (J). Msn2p и Msn4p проявляли нуклеоцитоплазматические колебания, при этом осцилляторный ответ Msn2p был гораздо более выраженным. Субпопуляция клеток обнаруживает постоянную ядерную локализацию Msn2p после периода колебаний (в основном наблюдаемых на B и E).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g001

Как подробно описано в параграфе 2.4, мы количественно оценили степень ядерной локализации транскрипционного фактора в каждой отдельной клетке путем определения траектории локализации (примеры пороговых значений показаны на рис. . 1A – C). Это позволяет нам проиллюстрировать поведение популяции с помощью цветных графиков (рис. 1D – L) и количественно проанализировать степень ядерной локализации (рис. 2). Как и ожидалось, общая степень ядерной локализации снижалась с уменьшением интенсивности света для всех трех факторов транскрипции (рис.1Д-Л). Этот эффект количественно выражен на рис. 2A – D, которые показывают, что доля клеток с ядерной локализацией уменьшалась с уменьшением интенсивности света в любой заданный момент времени. Однако есть также явные различия в общей форме кривых между тремя факторами транскрипции. При максимальной интенсивности света 115 мкВт все факторы транскрипции отреагировали примерно через 10 минут (рис. 2А). И Crz1p, и Msn2p выходили на плато через 20–30 минут воздействия, хотя и на совершенно разных уровнях, ∼75% и ∼40% соответственно.Msn4p, с другой стороны, проявлял временное поведение с пиком ~ 17% через 17 минут, после чего только несколько процентов клеток обнаруживали ядерную локализацию (также видно на фиг. 1F и I). При средней интенсивности света 58 мкВт пик ядерной локализации Msn4p был смещен в более позднюю временную точку (рис. 2D).

Рис. 2. Количественный анализ влияния освещения на ядерную локализацию Crz1p, Msn2p и Msn4p.

(A) — (D) Фракция клеток с факторами транскрипции, локализованными в ядре при различной интенсивности света.Вставка (B): Crz1-GFP подвергается воздействию 26 мкВт в течение 150 минут. (E) Общее время в ядре для факторов транскрипции Crz1p, Msn2p и Msn4p в течение 60 минут непрерывного воздействия света с различной интенсивностью. Статистически значимой разницы между ответами на две самые высокие интенсивности света для Msn4p нет (p = 0,2145). (F) Время до первой ядерной локализации Crz1p, Msn2p и Msn4p при различной интенсивности света. Изменения времени до первой ядерной локализации в зависимости от интенсивности света статистически значимы (Msn2p 58 мкВт vs.115 мкВт p = 0,011, другие p <0,001), за исключением Crz1p 26 мкВт против 58 мкВт (p = 0,109). Обратите внимание, что Crz1p вошел в ядро ​​только в ~ 25% клеток при мощности 26 мкВт в течение первых 60 минут, рассматриваемых здесь, что привело к относительно быстрому среднему значению 39 минут. Статистические тесты проводились с использованием U-критерия Манна – Уитни.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g002

Фиг. 2E – F показывают два дополнительных параметра, которые можно использовать для количественной оценки траекторий ядерной локализации; общее время (из 60 минут), которое каждый фактор транскрипции проводит в ядре, и время от начала воздействия света до обнаружения первой ядерной локализации.Crz1p и Msn2p, очевидно, реагируют пропорционально интенсивности света в обоих случаях, т.е. они проводят больше времени в ядре по мере увеличения интенсивности света (рис. 2E), а время задержки до обнаружения первого события ядерной локализации уменьшается с увеличением интенсивности света ( Рис. 2F). Последний эффект также наблюдался для Msn4p, но не наблюдалось статистической разницы в общем времени ядерной локализации между 58 мкВт и 115 мкВт (рис. 2E).

И Msn2p, и Crz1p проводят в ядре значительно больше времени по сравнению с Msn4p (рис.2E). Низкое медианное значение для Msn4p частично связано с тем фактом, что только ~ 50% клеток вообще ответили в течение этого периода времени, даже несмотря на то, что типичные одиночные колебания Msn4p имеют продолжительность 2-3 минуты (Fig. 1C). Crz1p и Msn2p, с другой стороны, обнаруживают ядерную локализацию в> 80% клеток (115 мкВт), хотя процент клеток с ядерной локализацией Crz1p резко снижается при самой низкой интенсивности. Однако, когда вместо этого за клетками наблюдали в течение 150 минут, Crz1p обнаружил ядерную локализацию в> 55% клеток (вставка на рис.2Б). Среднее время до первой ядерной локализации затем увеличивается до 79 минут. Такое распределение значительно отличается по сравнению с более высокой интенсивностью света (p <10 −11 , U-критерий Манна-Уитни). Кроме того, обратите внимание, что ядерный ответ на освещение становится более однородным на уровне популяции при более высоких интенсивностях света, на что указывает более крутой наклон, например Рис. 2В.

3.2 Световой ответ Crz1p зависит от кальциневрина и от активности PKA

Несколько исследований показали, что ядерная локализация Crz1p зависит от цитозольных уровней Ca 2+ [18], [20], [21].Наши находки по существу постоянной ядерной локализации Crz1p во время освещения контрастируют с более ранними сообщениями о стохастических «всплесках» ядерной локализации Crz1p после стресса Ca 2+ (50–300 мМ) [2]. Это поднимает интересные вопросы относительно Ca 2+ -зависимой передачи сигналов во время освещения, и мы хотели дополнительно исследовать роль, которую играют разные компоненты. Кальциневрин представляет собой кальмодулин-зависимую фосфатазу, которая контролирует локализацию Crz1p в нескольких стрессовых условиях [21], [35], и поэтому мы исследовали индуцированный светом ответ Crz1-GFP в мутантном штамме, лишенном регуляторного домена кальциневрина, CNB1 [36], [37].Индуцированный светом ответ Crz1p явно зависел от этой фосфатазы, поскольку в штамме cnb1Δ ни одна клетка не показывала ядерную локализацию Crz1p даже через 60 минут при наивысшей интенсивности света (115 мкВт; фиг. 3A). Тот же эксперимент был повторен для Msn2-GFP (рис. 3B). Результаты для штамма cnb1Δ показали отсутствие значительного уменьшения общего времени ядерной локализации Msn2-GFP (p = 0,08, U-критерий Манна-Уитни (фиг. S1)).

Рис. 3. Зависимость ядерной локализации транскрипционного фактора от активности кальциневрина и протеинкиназы А.

(A) Фракция клеток с Crz1-GFP, локализованными в ядре. У обоих штаммов cnb1Δ и nmd5Δ ядерная локализация Crz1p была резко снижена. (B) Фракция клеток с Msn2-GFP, локализованными в ядре в штамме cnb1Δ . (C) Фракция клеток с ядерной локализацией Crz1-GFP в штамме pde2Δ при различной интенсивности света (115 мкВт, 58 мкВт и 26 мкВт). (D) Фракция клеток с ядерной локализацией фактора транскрипции у мутантов pde2Δ (115 мкВт).Соответствующие эксперименты с диким типом / эталоном показаны для каждого набора образцов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g003

Предыдущие исследования показали, что ядерное накопление Crz1p в ответ на высокий уровень внеклеточного Ca 2+ требует ядерного импортина Nmd5p [38]. Мы оценили, важен ли Nmd5p также для ядерной локализации во время освещения, и обнаружили, что в штамме nmd5Δ первоначальная ядерная локализация Crz1p почти утрачена (рис.3A), хотя некоторые клетки, по-видимому, отреагировали примерно через 25–30 минут или дольше.

При определенных условиях Crz1p также негативно регулируется гомологом казеинкиназы I Hrr25p [39] и PKA [30]. PKA непосредственно фосфорилирует NLS Crz1p и тем самым противодействует активности кальциневрина. Таким образом, Crz1p интегрирует индуцированную стрессом передачу сигналов посредством обоих этих двух путей передачи сигналов. Поскольку Crz1p, Msn2p и Msn4p все были затронуты освещением, возможная механистическая гипотеза кросс-координации состоит в том, что воздействие синего света снижает активность PKA.Это, в свою очередь, изменит баланс между активностью PKA и кальциневрина и позволит увеличить ядерную локализацию Crz1p. Чтобы проверить эту гипотезу, факторы транскрипции, меченные GFP, были экспрессированы в штамме pde2Δ . Pde2p — это фосфодиэстераза цАМФ с наивысшим сродством к цАМФ, которая превращает цАМФ в АМФ [40], [41]. Делеция PDE2 дает штамм с высокими уровнями цАМФ и, следовательно, высокой активностью PKA [42], что, как мы ранее показали, резко снижает ядерную локализацию Msn2p во время освещения [3].Однако Crz1p все еще входит в ядро ​​в штамме pde2Δ , как и в штамме дикого типа, при всех испытанных интенсивностях света (фиг. 3C). Как и в случае с Msn2p, ядерная локализация Msn4p ингибировалась в штамме pde2Δ во время освещения. Количество клеток, которые вообще ответили на освещение (из общего числа> 150 клеток в двух экспериментах), уменьшилось с 50% до 5% и с> 80% до 20% в случаях Msn4p и Msn2p, соответственно. Кроме того, несколько мутантных клеток, которые действительно ответили, показали в целом гораздо более слабые ответы (рис.3D и фиг. S2) по сравнению с клетками дикого типа (фиг. 1 и 2A). В целом эти данные показывают, что индуцированная светом ядерная локализация Crz1p зависит от активности кальциневрина и не зависит от активности PKA. Кроме того, мы пришли к выводу, что по крайней мере два сигнальных пути участвуют в активации факторов транскрипции в ответ на световой стресс.

3.3 Увеличение внеклеточного [Ca

2+ ] сильно стимулирует Crz1p, но лишь умеренно увеличивает ядерную локализацию Msn2p и Msn4p

Чтобы выяснить, влияет ли на реакцию Crz1p на воздействие света внеклеточные концентрации Ca 2+ , клетки выращивали в среде с концентрациями Ca 2+ в диапазоне от следовых количеств до умеренных уровней (0.8 × 10 −3 мМ, 0,9 мМ, 5 мМ и 10 мМ), а затем осветили (стандартные синтетические среды содержат 100 мг / л CaCl 2 (∼0,9 мМ) [43]). Важно отметить, что при этих концентрациях кальция ни в одной клетке не наблюдалось ядерной локализации Crz1p в начале эксперимента по воздействию света, в отличие от гомогенной ядерной локализации (т.е. большинство клеток реагировали одновременно) после внезапного воздействия высоких уровней внеклеточного Ca 2+ (50 –300 мМ) [2]. В этом исследовании начальная ядерная локализация Crz1p в ответ на Ca 2+ была временной, и за ней следовали некоррелированные всплески ядерной локализации в отдельных клетках, то есть совершенно иное поведение по сравнению с постоянной локализацией, наблюдаемой здесь.Тем не менее, индуцированный светом ответ Crz1p явно зависел от концентрации Ca 2+ в среде. Как показано на фиг. 4A – B и рис. S3, Crz1p локализуется в ядре намного быстрее с увеличением концентрации Ca 2+ . Среднее время до первой ядерной локализации было сдвинуто с 32 минут при 0,8 × 10 -3 мМ Ca 2+ на 7 минут при 10 мМ Ca 2+ (фиг. 4B). При более низких концентрациях Ca 2+ заметно, что разброс во времени до первой ядерной локализации между различными клетками увеличивался, т.е.е. популяция стала менее однородной (обозначено более пологим наклоном, рис. 4А). Эффект более низких внеклеточных уровней Ca 2+ исследовали также на дрожжевых клетках, выращенных в стандартной среде с добавлением 5 мМ EGTA непосредственно перед экспериментом по воздействию света. Это привело к резкому увеличению времени клеточного ответа, даже более высокому, чем наблюдавшееся при 0,8 × 10 -3 мМ Ca 2+ выше, и с даже меньшим количеством клеток, реагирующих вообще (рис. S4). Однако ни в одном из этих случаев мы не наблюдали нуклеоцитоплазматических колебаний, возникающих в ответ на повышение уровня кальция (см.также рис.S3).

Рис. 4. Влияние внеклеточного [Ca 2+ ] и клеточного притока на локализацию Crz1p, Msn2p и Msn4p в ответ на свет.

Фракция клеток с факторами транскрипции (A) Crz1-GFP, (E) Msn2-GFP и (F) Msn4-GFP, локализованными в ядре как функция времени во время непрерывного воздействия синего света (450–490 нм, 115 мкВт). (C) — (D) Отсроченный ответ ядерной локализации был обнаружен в клетках, лишенных кальциевого канала плазматической мембраны CCh2 .Разница статистически значима (р <0,0001). (A) - (B) и (E) - (F) Клеткам позволяли адаптироваться к указанной внеклеточной концентрации Ca 2+ , выращивая их сначала в течение ночи, а затем в свежей культуре, которой позволяли достичь OD 600. = 0,4–0,5 в начале эксперимента по световой экспозиции. Ядерная локализация Msn2p увеличивалась при 5 мМ и 10 мМ по сравнению со стандартными условиями (0,9 мМ Ca 2+ ). Ядерная локализация Msn4p увеличивалась после 30 минут воздействия света (5 мМ и 10 мМ).Кривые были сглажены с помощью усредняющего фильтра для визуализации. (B) Средние значения времени до первой ядерной локализации как функция внеклеточной концентрации Ca 2+ . (G) Классификация траектории ядерной локализации Msn2-GFP. Клетки были вручную классифицированы как: отсутствие ответа (Msn2p находится только в цитоплазме), только колебание (Msn2p непрерывно колеблется, никогда не проявляет устойчивой ядерной локализации) или постоянная ядерная локализация (Msn2p находится в ядре в течение более длительного периода времени по направлению к конец эксперимента).Последний класс резко увеличился при 5 мМ Ca 2+ . [Ca 2+ ]: 0,8 × 10 -3 мМ (0,4 мг / л из пантотената кальция, без CaCl 2 ), 0,9 мМ (стандартная среда), 5 мМ и 10 мМ.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g004

Приведенные выше результаты показывают, что внеклеточное поглощение Ca 2+ важно для быстрого ответа Crz1p. Поэтому мы исследовали роль высокоаффинного кальциевого канала, Cch2p [44], [45].Cch2p расположен на плазматической мембране и, как полагают, частично отвечает за приток Ca 2+ . В штамме cch2Δ мы обнаружили, что среднее время до первой ядерной локализации Crz1p увеличилось с 19 минут в клетках дикого типа до 28 минут, что позволяет предположить, что Cch2p-опосредованный приток Ca 2+ модулирует ответ Crz1p (рис. 4C – D). Затем мы исследовали, влияет ли измененная внеклеточная концентрация Ca 2+ на локализацию Msn2p и Msn4p во время светоиндуцированного стресса (рис.4E – F). Интересно, что только относительно небольшое изменение общей фракции клеток с ядерной локализацией наблюдалось для обоих факторов транскрипции при 0,8 × 10 -3 мМ Ca 2+ по сравнению со стандартными условиями при 0,9 мМ Ca 2+ . Кроме того, не было изменений во времени до первой ядерной локализации при любой из протестированных концентраций Ca 2+ (фиг. 4B). Однако при 5 мМ и 10 мМ Ca 2+ общий ответ увеличился (рис. 4E – F и рис.S3). В случае Msn4p изменение все еще было довольно небольшим, но мы наблюдали увеличение доли клеток с ядерной локализацией после 30 минут воздействия света без заметной разницы между 5 мМ и 10 мМ Ca 2+ . Msn2p обнаруживал значительное увеличение ядерной локализации, которое было наиболее сильным при 5 мМ Ca 2+ . Это может быть связано с большим количеством клеток, достигающих постоянной ядерной локализации (рис. 4G и рис. S3). Более высокий уровень факторов транскрипции в ядре в ответ на более высокие уровни кальция указывает на то, что уровни Ca 2+ влияют на несколько сигнальных путей и / или устанавливают пороги для индуцированных светом стрессовых ответов на другом уровне.В целом, эти результаты демонстрируют, что изменения в клеточной среде могут довольно сильно влиять на светозависимый ответ.

3.4 Внутренний Ca

2+ Накопления усиливают индуцированную светом ядерную локализацию Crz1p

У почкующихся дрожжей вакуоль является основным резервуаром для Ca 2+ , который может высвобождаться в цитоплазму в ответ на определенные стимулы. 90% всего Ca 2+ в дрожжевых клетках находится в вакуоли, и большая часть его (примерно 99%) связана с полифосфатом [46].Vcx1p, Pmc1p и Yvc1p регулируют обмен Ca 2+ между вакуолью и цитоплазмой. Pmc1p является основным насосом притока в вакуоль в S. cerevisiae и основным вкладчиком в уровни вакуолярного Ca 2+ [47], а клетки, лишенные PMC1 , несут только ~ 10% нормальных уровней кальция в вакуолях [20]. Vcx1p представляет собой обменник Ca 2+ / H + , который, как было установлено, в основном транспортирует Ca 2+ в вакуоль [46] и ингибируется кальциневрином [48].Yvc1p представляет собой ионный канал, который высвобождает Ca 2+ из вакуоли [49] в ответ, например, на гиперосмотический шок или лечение перекисью водорода [50]. Чтобы проверить, участвует ли вакуоль в контроле ответа на освещение путем регулирования цитоплазматических уровней Ca 2+ , мы изучили нуклеоцитоплазматические ответы Crz1p у штаммов, лишенных одного из PMC1 , VCX1 или YVC1 (рис. 5A). . Интересно, что клетки pmc1Δ демонстрируют совершенно другой паттерн ядерно-цитоплазматической локализации по сравнению с клетками дикого типа, где поведение Crz1p по существу постоянная ядерная локализация во многих мутантных клетках заменяется спорадическими длинными колебаниями (рис.5С). Общее время ядерной локализации также сильно уменьшилось у штамма pmc1Δ (Fig. 5B). Кроме того, при добавлении 5 мМ EGTA во внешнюю среду непосредственно перед началом светового воздействия Crz1p вообще не попадал в ядро ​​(фиг. 5D и фиг. S4). Взятые вместе, это указывает на комбинированное значение вакуолярного и внеклеточного Ca 2+ в индуцированном светом ответе Crz1p. Клетки, лишенные VCX1 , демонстрировали паттерн, аналогичный клеткам дикого типа, тогда как клетки yvc1Δ демонстрировали снижение ядерной локализации по сравнению с клетками дикого типа (фиг.5A – B).

Рисунок 5. Внутренние насосы Ca 2+ важны для индуцированного светом ответа Crz1p дикого типа.

(A) Фракция клеток с Crz1-GFP, локализованными в ядре, как функция времени во время непрерывного воздействия синего света (450–490 нм, 115 мкВт). (B) Общее время ядерной локализации Crz1p в течение 60 минут воздействия света. (C) — (D) Профили нуклеоцитоплазматической локализации Crz1p, извлеченные из изображений флуоресцентной микроскопии pmc1Δ клеток.(D) EGTA добавляли к среде до конечной концентрации 5 мМ непосредственно перед воздействием синего света.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g005

Основной поставщик Ca 2+ в эндоплазматический ретикулум (ER), Pmr1p, локализован в комплексе Гольджи [51]. У S. cerevisiae ER содержат до 100 раз больше Ca 2+ , чем цитозоль, который может высвобождаться в цитозоль для инициирования сигнальной реакции Ca 2+ при определенных условиях [20].Правильная функция Pmr1p также, по-видимому, важна во время светоиндуцированного стресса, поскольку Crz1p локализуется в ядре намного быстрее, но не в такой же степени в мутантных клетках pmr1Δ по сравнению с клетками дикого типа (рис. 5A – B и рис. . S5).

Ранее мы наблюдали изменение морфологии вакуоля в ответ на свет [7]. Мы здесь расширяем это наблюдение и исследовали, были ли задействованы два сигнальных пути, которые имеют важное значение для светового ответа в этом исследовании, Ca 2+ -кальциневрин-Crz1 и цАМФ-PKA-Msn2 / 4 в этих световых эффектах. индуцированные вакуолярные изменения.Во время непрерывного освещения штамма дикого типа количество клеток, демонстрирующих измененную морфологию вакуолей, что проявляется в более высоком контрасте, чем до светового стресса, со временем увеличивалось (фиг. S6A-B). Делеция ни CNB1 , ни PDE2 в клетках, экспрессирующих Crz1-GFP, не изменила начало вакуолярных изменений (фиг. S6B-C). То же самое верно и в случаях, когда ядерная локализация Crz1p была либо увеличена (10 мМ CaCl 2 в среде), либо уменьшена добавлением EGTA (рис.S6E-F). Удаление PMC1 увеличивало количество клеток с измененной морфологией вакуоля (более высокий контраст) уже с начала эксперимента (фиг. S6D), но не увеличивало локализацию Crz1p до освещения (фиг. 5A и C). Мы пришли к выводу, что измененная морфология вакуолей, наблюдаемая при освещении синим светом, по-видимому, не связана с сигнальным каскадом Ca 2+ -кальциневрин-Crz1 или со сниженной активностью PKA.

3.5 Подсветка синим светом увеличивает уровни Cmk2 способом, зависящим от

CRZ1 и de novo Транскрипция

Наконец, мы обратились к вопросу, приводит ли индуцированная светом ядерная локализация Crz1p к усилению экспрессии нижележащих генов-мишеней или нет.Мы использовали слияние Cmk2-GFP, которое ранее использовалось как индикатор кальциневрин- и Crz1-зависимой транскрипции [2] для решения этой проблемы. Штамм дикого типа и штамм crz1Δ , экспрессирующий Cmk2-GFP, освещали в течение 40 минут (115 мкВт), после чего отслеживали среднюю клеточную флуоресценцию во времени (фиг. 6). Штамм дикого типа показал явное усиление флуоресценции, а штамм crz1Δ — нет. Кроме того, за счет ингибирования транскрипции с помощью 1,10-фенантролина непосредственно перед освещением клетки дикого типа не проявляли повышенной флуоресценции Cmk2-GFP, что указывает на то, что увеличение флуоресценции зависит от транскрипции de novo .Повышенной флуоресценции также не наблюдалось после 180 минут выдерживания штамма Cmk2-GFP дикого типа в темноте (данные не показаны). Взятые вместе, эти данные ясно показывают, что освещение синим светом запускает повышенную транскрипцию CMK2 в зависимости от CRZ1 .

Рис. 6. Освещение увеличивает флуоресценцию Cmk2-GFP в зависимости от транскрипции Crz1p и de novo .

Увеличение средней флуоресценции Cmk2-GFP (среднее популяции на клетку, N клетка, wt = 107, N клетка, crz1Δ = 99, N клетка, ингибитор транскрипции = 89) после 40 минут воздействия к синему свету (115 мкВт, 450–490 нм).Чтобы убедиться, что увеличение флуоресценции в клетках дикого типа было связано с de novo транскрипцией CMK2-GFP , непосредственно перед освещением добавляли ингибитор транскрипции 1,10-фенантролин (100 мкг / мл).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g006

Discussion

Ранние исследования установили, что ядерная локализация Crz1p после стрессовых условий, отличных от освещения, зависит от кальциневрина [21], [35].Однако PKA также негативно регулирует ядерную локализацию Crz1p [30], и предыдущие исследования показали, что ядерная локализация факторов транскрипции Msn2p и Msn4p во время освещения требует пониженной активности PKA. Здесь мы обнаруживаем, что ядерная локализация Crz1p во время светоиндуцированного стресса полностью зависит от кальциневрина (рис. 3; штамм cnb1Δ ) и не зависит от активности PKA (рис. 3; штамм pde2Δ ). Таким образом, это резко контрастирует с Msn2p, который зависит от активности PKA в отношении индуцированной светом ядерной локализации, но не затрагивается в штамме cnb1Δ .Однако мы также отмечаем, что индуцированная светом ядерная локализация Msn2p, возможно, может регулироваться и другими механизмами, кроме отсутствия ингибирующего фосфорилирования PKA, поскольку ранее сообщалось, что делеция генов фосфатазы PP2A PPh31 и PPh32 устраняет Msn2p. ядерная локализация во время светоиндуцированного стресса [4], указывая на то, что относительная активность как фосфатаз, так и киназ определяет ядерную локализацию Msn2p. Недавние данные показывают, что PKA необходима для индуцированной глюкозой активации PP2A [52], тогда как механизмы, лежащие в основе очевидной потребности PP2A для Msn2p, чтобы перемещаться в ядро ​​в ответ на свет, еще предстоит охарактеризовать.Более того, ядерная локализация Crz1p во время освещения зависела от транспортного фактора Nmd5p, как и в случае стресса Ca 2+ . Предыдущие исследования показали, что накопление Crz1p в ядре в ответ на высокий уровень внеклеточного Ca 2+ требует ядерного importin Nmd5p, но что дефосфорилирование Crz1p с помощью кальциневрина также подавляет его ядерный экспорт [38], [53]. Эти данные показывают, что два в значительной степени независимых сигнальных пути реагируют на непрерывное освещение синим светом (рис.7).

Рис. 7. Схематический обзор двух сигнальных путей, реагирующих на освещение.

Это исследование показало, что как внутри-, так и внеклеточные депо Ca 2+ важны для ответа Crz1p дикого типа во время освещения. Важно отметить, что ядерная локализация Crz1p зависит от кальциневрина и не зависит от PKA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.g007

Кроме того, мы демонстрируем, что реакция ядерной локализации, индуцированная светом, требует относительно низких уровней внеклеточного Ca 2+ , особенно в случае Crz1p. и Msn2p.Профиль ядерной локализации во время освещения изменялся по-разному для этих двух факторов транскрипции в зависимости от концентрации Ca 2+ . Для Crz1p время ядерной локализации сокращается с более высокой концентрацией Ca 2+ (рис. 4B), тогда как Ca 2+ не влияет на время ответа для Msn2p. Напротив, в случае Msn2p большее количество клеток обнаруживает постоянную ядерную локализацию. Однако при 10 мМ Ca 2+ локализация Msn2p была несколько снижена по сравнению с 5 мМ (рис.4E и рис. S3). Это может быть результатом повышенной деградации Msn2p в ядре после активации Crz1p [54]. Было высказано предположение, что деградация Msn2p жизненно важна для предотвращения длительной остановки роста в условиях конститутивного стресса [55], как здесь, но не играет никакой роли во время краткосрочных флуктуирующих условий. Однако усиление ядерной локализации как Msn2p, так и Msn4p в ответ на синий свет за счет увеличения уровней Ca 2+ указывает на то, что Ca 2+ также может усиливать ответы Msn2p и Msn4p.В случае Crz1p мы идентифицировали кальциевый канал плазматической мембраны Cch2p, который по крайней мере частично отвечает за приток Ca 2+ в клетку во время светоиндуцированного стресса (Figs. 4C – D). Кроме того, сообщалось, что активность кальциневрина выше в богатой среде, которая содержит более высокие концентрации Ca 2+ по сравнению с минимальной средой. Однако активации кальциневрин-зависимой транскрипции за счет индуцированного глюкозой притока кальция противодействует доступность кальция в среде [56].Кальциневрин контролирует активность Crz1p, который, как полагают, контролирует транскрипцию кальциневрин-зависимых генов-мишеней [12]. Следовательно, более быстрый ответ Crz1p при более высоких концентрациях внеклеточного Ca 2+ может быть связан как с повышенной базальной активностью кальциневрина, так и с повышенным притоком кальция.

Это исследование включило два сигнальных пути и выходные факторы транскрипции в ответ на освещение, один через кальциневрин и Crz1p, а другой через PKA и Msn2p / Msn4p.Несомненно, представляет интерес идентифицировать фотохимические продукты, образующиеся при освещении синим светом, а также компоненты, ответственные за восприятие повышенной фотонно-индуцированной токсичности перед сигнальными путями. Быстрая устойчивая локализация Crz1p в ядре может указывать на то, что стресс, вызванный освещением, является серьезным и более трудным для адаптации, чем уровень стресса, вызванный 200 мМ внеклеточного Ca 2+ [2], что приводит к стохастическим «всплескам» Crz1p ядерной локализации, и клетки оснащены адекватными регуляторными системами.Одним из возможных источников индуцированной светом токсичности является продукция H 2 O 2 с помощью флавинсодержащих оксидаз [57]. Связывающие элементы для Crz1p [12], а также Msn2p и Msn4p [11] были обнаружены в промоторах генов-мишеней, которые индуцируются после воздействия H 2 O 2 . Возможно, это до некоторой степени может объяснить причину наблюдаемой индуцированной светом ядерной локализации Crz1p, Msn2p и Msn4p. Было показано, что добавление сублетальных доз H 2 O 2 к культуральной среде вызывает приток Ca 2+ в цитозоль как из внеклеточных, так и из вакуолярных источников, тогда как летальные дозы в первую очередь вызывают отток из вакуоли [50 ].В этих условиях Yvc1p был необходим для высвобождения вакуолярного Ca 2+ . Наши данные показывают, что как внеклеточные, так и внутриклеточные депо Ca 2+ мобилизуются во время воздействия синего света, и мы ранее предположили, что количество токсичных фотопродуктов увеличивается со временем при непрерывном освещении [3]. Ранний ответ Crz1p, по-видимому, зависит в первую очередь от внеклеточной доступности Ca 2+ , поскольку клетки, лишенные кальциевого канала Cch2p плазматической мембраны, проявляют замедленный ответ, т.е.е. ядерная локализация Crz1p. Кроме того, снижение внеклеточной концентрации Ca 2+ или добавление EGTA также увеличивало время ответа. Быстрый ответ на 10 мМ Ca 2+ , который может указывать на повышенный внеклеточный приток, контрастирует со сниженным внеклеточным притоком Ca 2+ , наблюдаемым после обработки амиодароном клеток, выращенных на том же уровне Ca 2+ [58 ]. Этот приток, однако, не опосредован Cch2p и, следовательно, может включать другие неизвестные пути входа Ca 2+ .Уровень стресса увеличивается со временем освещения (повышенное накопление фототоксичных продуктов), и поэтому комбинированный эффект внутриклеточных и внеклеточных запасов Ca 2+ может стать все более важным. Наши результаты показывают, что внутриклеточные запасы в вакуоли также влияют на способность клеток реагировать на освещение. В клетках pmc1Δ , несущих только ∼10% нормального вакуолярного количества Ca 2+ [20], ответ Crz1p был намного слабее, чем в клетках дикого типа, и, кроме того, этот ответ в клетках pmc1Δ был полностью утрачен при добавлении EGTA.Сниженная ядерная локализация Crz1p в клетках, лишенных вакуолярного насоса оттока Ca 2+ Yvc1p (Fig. 5), также, по крайней мере до некоторой степени, поддерживает эту гипотезу. Более того, предыдущие исследования показали, что pmr1Δ клетки обнаруживают нарушенный гомеостаз Ca 2+ за счет более высокого притока Ca 2+ , повышенной цитозольной концентрации Ca 2+ и более высокой активности кальциневрина [59]. Более быстрый ответ в клетках pmr1Δ , то есть уменьшенное время, необходимое Crz1-GFP для входа в ядро, в этом исследовании согласуется с повышенной базальной активностью кальциневрина, более высокой скоростью притока и уже повышенными уровнями цитозольного кальция.Более низкая ядерная локализация и меньшая реакция клеток могут быть результатом изменения субклеточного распределения Ca 2+ , поскольку, например, Сообщается, что Pmc1p сильно активирован и неправильно локализован у мутанта pmr1Δ [60], возможно, это ответ, чтобы компенсировать секреторные дефекты, связанные с отсутствием Pmr1p [47]. Однако из-за сложности реакции есть место для дальнейших исследований, чтобы получить более широкое представление о механизмах светового явления, зависящих от Ca 2+ .

Роль Msn2p и Msn4p в ответах на стресс недавно была показана как специфичная как для гена, так и для конкретного состояния, и они играют главную роль в приобретении устойчивости к стрессу [1]. Было также высказано предположение, что Msn2p и Msn4p по-разному активируются в ответ на разные стрессы; делеция MSN2 снижает экспрессию различных генов-мишеней, а делеция MSN4 — нет. Однако двойная делеция приводит к еще более низкой экспрессии генов, указывая на некоторый уровень избыточности и на то, что Msn4p вносит вклад в индукцию транскрипции определенных генов вместе с Msn2p [14], [28], [61].Наши данные ясно показывают, что Msn2p и Msn4p по-разному реагируют на один и тот же тип и уровень светового стресса. Кроме того, исходя из количества клеток с ядерной локализацией, ядерная локализация Msn4p не может присутствовать во всех клетках, которые демонстрируют ядерную локализацию Msn2p в течение 60 минут воздействия света. Оба фактора транскрипции ответили в одно и то же время (рис. 2), но Msn4p, по-видимому, накапливается в ядре в основном на ранних стадиях стрессовой реакции (рис.1 и 2). Эти данные дополнительно подтверждают различные роли Msn2p и Msn4p и также согласуются с предыдущей публикацией, которая продемонстрировала разные уровни гиперфосфорилирования в этих двух белках при тепловом стрессе и истощении питательных веществ [27]. Можно предположить, что Msn4p более важен на ранней стадии стрессовой адаптации, при еще более высоких уровнях стресса или в ситуациях, когда присутствуют комбинации множественных стрессов. Незначительное увеличение ядерной локализации Msn4p при комбинированном воздействии повышенной концентрации кальция и светового стресса (рис.4F), возможно, указывает на последнее.

В этой работе мы количественно оценили динамику ядерной локализации факторов транскрипции Crz1p, Msn2p и Msn4p как функцию индуцированного светом клеточного стресса, а также исследовали и обсудили связь с передачей сигналов Ca 2+ у дрожжей. Три белка демонстрируют совершенно разные реакции на стресс. В частности, Crz1p обнаруживает быструю и постоянную ядерную локализацию, которая приводит к транскрипции его гена-мишени CMK2 зависимым от CRZ1 образом.Повышенные уровни внеклеточного Ca 2+ приводят к более сильному светоиндуцированному ответу для всех трех факторов транскрипции. Исследования на мутантах, лишенных переносчиков Ca 2+ , показывают, что приток внеклеточного Ca 2+ имеет решающее значение для начальных этапов светоиндуцированной ядерной локализации Crz1p, в то время как мобилизация внутриклеточных запасов Ca 2+ , по-видимому, необходима для устойчивого ответа. . Мы также обнаружили, что ядерная локализация Crz1p зависит от кальциневрина и белка-носителя Nmd5p, но не зависит от активности PKA.Паттерны ядерной локализации Msn2p и Msn4p, которые характеризуются стохастическими колебаниями, вместо этого сильно зависят от активности PKA. Мы пришли к выводу, что два центральных сигнальных пути, цАМФ-PKA-Msn2 / 4 и Ca 2+ -кальциневрин-Crz1, активируются синим светом. Однако непосредственные причины и подробные механизмы светового стресса у дрожжей все еще остаются открытыми.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Ядерная локализация Msn2p в cnb1 Δ-клетках. Общее время, проведенное Msn2p в ядре в течение 60 минут непрерывного воздействия света (115 мкВт, 450–490 нм) в штамме cnb1Δ . CNB1 кодирует регуляторную субъединицу кальциневрина. Эти две популяции существенно не различаются (значение p = 0,08, U-критерий Манна-Уитни), но штамм cnb1Δ демонстрирует тенденцию к снижению ядерной локализации Msn2p.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.s001

(EPS)

Рисунок S2.

Повышенная активность PKA ингибирует ядерную локализацию Msn2p и Msn4p во время освещения. Профили нуклеоцитоплазматической локализации (A) Msn2p и (B) Msn4p в штамме pde2Δ (высокая активность PKA). Клетки освещали непрерывным синим светом (115 мкВт, 450–490 нм) в течение 60 минут.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Влияние концентрации Ca 2+ на ответы ядерно-цитоплазматической локализации. Профили локализации нуклеоцитоплазмы, извлеченные из изображений флуоресцентной микроскопии для Crz1-GFP (левый столбец), Msn2-GFP (средний столбец) и Msn4-GFP (правый столбец) при четырех различных концентрациях Ca 2+ (строки). [Ca 2+ ]: 0,8 × 10 -3 мМ, 0,9 мМ (стандартная среда), 5 мМ и 10 мМ. Клетки подвергали непрерывному воздействию синего света (450–490 нм, 115 мкВт) в течение 60 минут и анализировали ядерную локализацию факторов транскрипции. В начале эксперимента не было обнаружено ядерной локализации клеток в результате изменения концентрации Ca 2+ по сравнению со стандартной средой.Обратите внимание, что Ca 2+ может усиливать ответ, в частности, для Crz1p и Msn2p.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Ca 2+ Хелатирование EGTA ингибирует реакцию ядерной локализации Crz1p во время освещения. Добавление EGTA к культуральной среде до конечной концентрации 5 мМ непосредственно перед освещением увеличивает время ответа и снижает количество клеток с ядерной локализацией Crz1p (синяя кривая) по сравнению с клетками дикого типа (красная кривая) или клетками выросли в следовых количествах Ca 2+ (черная кривая).В штамме pmc1Δ Crz1p не локализовался в ядре (зеленая кривая), что указывает на то, что как внеклеточный приток Ca 2+ , так и вакуолярные запасы важны для ответа дикого типа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.s004

(EPS)

Рисунок S5.

Ядерная локализация Crz1p в клетках pmr1Δ . (A) Профиль нуклеоцитоплазматической локализации Crz1-GFP, извлеченный из изображений флуоресцентной микроскопии.Клетки непрерывно освещали синим светом (450–490 нм, 115 мкВт). (B) Время до первой ядерной локализации Crz1p. Удаление PMR1 уменьшает время отклика Crz1p. Различия статистически значимы (p <0,001; U-критерий Манна-Уитни).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.s005

(TIF)

Рисунок S6.

Измененная морфология вакуолей, по-видимому, не зависит от нарушений в сигнальном каскаде Ca 2+ -calcineurin-Crz1 или активности PKA. (A) Измененная морфология вакуоля в ответ на освещение (450–490 нм, 115 мкВт) была количественно определена путем ручного осмотра в (B) клетках дикого типа и cnb1Δ клетках, (C) pde2Δ клетках, (D) Клетки pmc1Δ , (E) клетки, обработанные 5 мМ EGTA непосредственно перед светоиндуцированным стрессом, и (F) клетки, выращенные с более высокими внеклеточными уровнями Ca 2+ . На графиках показано среднее значение двух независимых экспериментов с полосами ошибок, представляющими 1 стандартное отклонение. Эти данные показывают, что измененная морфология вакуоля, наблюдаемая при освещении синим светом, по-видимому, не связана с сигнальным каскадом Ca 2+ -кальциневрин-Crz1 или со сниженной активностью PKA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053404.s006

(EPS)

Благодарности

Мы благодарим Мишеля Жаке за его вклад в стимулирующие обсуждения и Аннабель Форсмарк за помощь в проведении экспериментов. Плазмиды были любезно подарены Кристофом Шуллером (Msn2-GFP), Мишелем Жаке и Сесилией Гармендиа-Торрес (Msn4-GFP), а также Мартой Сайерт и Джагори Рой (Crz1-GFP).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: KB AJ AB MM MK.Проведены эксперименты: КБ АЖ ММ. Проанализированы данные: КБ. Написал статью: KB AJ AB MM MK.

Ссылки

  1. 1. Berry DB, Gasch AP (2008) Изменения геномной экспрессии, активируемые стрессом, служат препаративной ролью для надвигающегося стресса у дрожжей. Молекулярная биология клетки 19: 4580–4587.
  2. 2. Cai L, Dalal CK, Elowitz MB (2008) Частотно-модулированные всплески ядерной локализации координируют регуляцию генов. Природа 455: 485–490.
  3. 3.Бодвард К., Врангборг Д., Тапани С., Логг К., Слива П. и др. (2011) Непрерывное воздействие света вызывает кумулятивный стресс, который влияет на динамику локализационных колебаний фактора транскрипции Msn2p. BBA-Mol Cell Res 1813: 358–366.
  4. 4. Гармендиа-Торрес C, Goldbeter A, Jacquet M (2007) Нуклеоцитоплазматические колебания дрожжевого транскрипционного фактора Msn2: доказательства периодической активации PKA. Текущая биология 17: 1044–1049.
  5. 5. Hao N, O’Shea EK (2011) Сигнально-зависимая динамика транслокации транскрипционного фактора контролирует экспрессию генов.Nat Struct Mol Biol 19: 31–39.
  6. 6. Jacquet M, Renault G, Lallet S, De Mey J, Goldbeter A (2003) Колебательное ядерно-цитоплазматическое перемещение активаторов транскрипции общего стрессового ответа Msn2 и Msn4 в Saccharomyces cerevisiae. Журнал клеточной биологии 161: 497–505.
  7. 7. Logg K, Bodvard K, Blomberg A, Käll M (2009) Исследования светоиндуцированного стресса в флуоресцентной микроскопии с использованием ядерной локализации фактора транскрипции Msn2p в качестве репортера.FEMS Yeast Research 9: 875–884.
  8. 8. Медведик О., Ламминг Д.В., Ким К.Д., Синклер Д.А. (2007) MSN2 и MSN4 связывают ограничение калорий и TOR с опосредованным сиртуином продлением продолжительности жизни у Saccharomyces cerevisiae. PLoS Biol 5: e261.
  9. 9. Tsuzi D, Maeta K, Takatsume Y, Izawa S, Inoue Y (2004) Отчетливый регуляторный механизм дрожжевого GPX2, кодирующего фосфолипидгидропероксид глутатионпероксидазу, с помощью окислительного стресса и сигнального пути Ca2 +, опосредованного кальциневрином / Crz1.Febs Lett 569: 301–306.
  10. 10. Каустон Н, Рен Б., Кох С., Харбисон С., Канин Э. и др. (2001) Ремоделирование экспрессии генома дрожжей в ответ на изменения окружающей среды. Mol Biol Cell 12: 323–337.
  11. 11. Гаш А., Спеллман П., Као С., Кармель-Харел О., Эйзен М. и др. (2000) Программы геномной экспрессии в ответ на изменения окружающей среды дрожжевых клеток. Mol Biol Cell 11: 4241–4257.
  12. 12. Йошимото Х., Зальцман К., Гаш А., Ли Х., Огава Н. и др.(2002) Полногеномный анализ экспрессии генов, регулируемых сигнальным путем кальциневрин / Crz1p в Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 277: 31079–31088.
  13. 13. Estruch F (2000) Факторы транскрипции, контролируемые стрессом, гены, индуцированные стрессом, и устойчивость к стрессу у почкующихся дрожжей. Fems Microbiol Rev 24: 469–486.
  14. 14. Мартинес-Пастор М., Марчлер Г., Шюллер С., Марчлер-Бауэр А., Руис Х. и др. (1996) Белки цинковых пальцев Saccharomyces cerevisiae Msn2p и Msn4p необходимы для индукции транскрипции через элемент стрессового ответа (STRE).EMBO J 15: 2227.
  15. 15. Temple MD, Perrone GG, Dawes IW (2005) Сложные клеточные ответы на активные формы кислорода. Тенденции Cell Biol 15: 319–326.
  16. 16. Clapham DE (2007) Передача сигналов кальция. Ячейка 131: 1047–1058.
  17. 17. Берридж MJ, Bootman MD, Roderick HL (2003) Передача сигналов кальция: динамика, гомеостаз и ремоделирование. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 517–529.
  18. 18. Cyert M (2003) Передача сигналов кальциневрина в Saccharomyces cereviside: как дрожжи сходят с ума в ответ на стресс.Biochem Bioph Res Co 311: 1143–1150.
  19. 19. Cui J, Kaandorp JA, Sloot PMA, Lloyd CM, Filatov MV (2009) Гомеостаз кальция и передача сигналов в дрожжевых клетках и сердечных миоцитах. FEMS Yeast Research 9: 1137–1147.
  20. 20. Каннингем К.В. (2011) Кислые запасы кальция Saccharomyces cerevisiae. Cell Calcium 50: 129–138.
  21. 21. Stathopoulos AM, Cyert MS (1997). Кальциневрин действует через кодируемый CRZ1 / TCN1 фактор транскрипции, регулируя экспрессию генов в дрожжах.Гены и развитие 11: 3432.
  22. 22. Stathopoulos-Gerontides A, Guo J, Cyert M (1999) Дрожжевой кальциневрин регулирует ядерную локализацию фактора транскрипции Crz1p посредством дефосфорилирования. Джин Дев 13: 798–803.
  23. 23. Estruch F, Carlson M (1993) Два гомологичных гена с цинковыми пальцами, идентифицированные с помощью множественной супрессии в мутанте протеинкиназы SNF1 Saccharomyces cerevisiae. Молекулярная и клеточная биология 13: 3872.
  24. 24. Бой-Маркотт Э., Гармендиа С., Гарро Х., Лалле С., Маллет Л. и др.(2006) Область активации транскрипции Msn2p у Saccharomyces cerevisiae регулируется стрессом, но нечувствительна к сигнальному пути цАМФ. Mol Genet Genomics 275: 277–287.
  25. 25. Горнер В., Дурчшлаг Э., Мартинес-Пастор М., Эструч Ф., Аммерер Г. и др. (1998) Ядерная локализация белка цинкового пальца C2h3 Msn2p регулируется стрессом и активностью протеинкиназы А. Гены и развитие 12: 586–597.
  26. 26. Schmitt AP, McEntee K (1996) Msn2p, ДНК-связывающий белок цинкового пальца, является активатором транскрипции мультистрессового ответа у Saccharomyces cerevisiae.Proc Natl Acad Sci USA 93: 5777–5782.
  27. 27. Гарро Х., Хасан Р., Рено Дж., Эструч Ф., Бой-Маркотт Э. и др. (2000) Гиперфосфорилирование Msn2p и Msn4p в ответ на тепловой шок и диауксический сдвиг ингибируется цАМФ в Saccharomyces cerevisiae. Microbiol-Sgm 146: 2113–2120.
  28. 28. Treger JM, Schmitt AP, Simon JR, McEntee K (1998) Мутации транскрипционных факторов выявляют регуляторные сложности теплового шока и недавно идентифицированных генов стресса в Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem 273: 26875–26879.
  29. 29. Джавер Дж., Чу А., Ни Л., Коннелли С., Райлз Л. и др. (2002) Функциональное профилирование генома Saccharomyces cerevisiae. Природа 418: 387–391.
  30. 30. Кафадар К.А., Сайерт М.С. (2004) Интеграция стрессовых реакций: модуляция передачи сигналов кальциневрина в Saccharomyces cerevisiae протеинкиназой А. Эукариотическая клетка. 3: 1147–1153.
  31. 31. Wach A, Brachat A, Pöhlmann R, Philippsen P (1994) Новые гетерологичные модули для классических или основанных на ПЦР нарушений генов в Saccharomyces cerevisiae.Дрожжи 10: 1793–1808.
  32. 32. Центр промышленной математики Фраунгофера-Чалмерса, CellStat [компьютерное программное обеспечение], Гётеборг. CellStat — это бесплатное программное обеспечение для распознавания контуров клеток в исследовательских целях. Чтобы узнать условия и подробности загрузки, отправьте электронное письмо на адрес [email protected].
  33. 33. Kvarnström M, Logg K, Diez A, Bodvard K, Käll M (2008) Алгоритмы анализа изображений для распознавания контуров клеток у почкующихся дрожжей. Opt Express 16: 12943–12957.
  34. 34. Манн Х. Б., Уитни Д. Р. (1947) О проверке того, является ли одна из двух случайных величин стохастически большей, чем другая. Анналы математической статистики 18: 50–60.
  35. 35. Matheos DP, Kingsbury TJ, Ahsan US, Cunningham KW (1997) Tcn1p / Crz1p, кальциневрин-зависимый фактор транскрипции, который дифференциально регулирует экспрессию генов в Saccharomyces cerevisiae. Гены и развитие 11: 3445–3458.
  36. 36. Cyert MS, Thorner J (1992) Регуляторная субъединица (продукт гена CNB1) дрожжевых Ca2 + / кальмодулин-зависимых фосфопротеин-фосфатаз необходима для адаптации к феромону.Mol Cell Biol 12: 3460–3469.
  37. 37. Куно Т., Танака Х., Мукаи Х., Чанг С.Д., Хирага К. и др. (1991) клонирование кДНК гомолога кальциневрина B в Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun 180: 1159–1163.
  38. 38. Polizotto RS, Cyert MS (2001) Зависимый от кальциневрина ядерный импорт фактора транскрипции Crz1p требует Nmd5p. Журнал клеточной биологии 154: 951–960.
  39. 39. Kafadar K, Zhu H, Snyder M, Cyert M (2003) Отрицательная регуляция передачи сигналов кальциневрина с помощью Hrr25p, дрожжевого гомолога казеинкиназы I.Гены и развитие. 17: 2698–2708.
  40. 40. Nikawa J, Sass P, Wigler M (1987) Клонирование и характеристика низкоаффинного гена циклической АМФ-фосфодиэстеразы Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 7: 3629–3636.
  41. 41. Sass P, Field J, Nikawa J, Toda T, Wigler M (1986) Клонирование и характеристика высокоаффинной фосфодиэстеразы цАМФ Saccharomyces cerevisiae. P Natl Acad Sci USA 83: 9303–9307.
  42. 42. Park J-I, Grant CM, Dawes IW (2005) Высокоаффинная цАМФ-фосфодиэстераза Saccharomyces cerevisiae является основным детерминантом уровней цАМФ в стационарной фазе: участие различных ветвей пути Ras – циклического АМФ в стрессовых ответах.Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 327: 311–319.
  43. 43. Шерман Ф. (1991) Начало работы с дрожжами. В: Guthrie C, Fink GR, редакторы. Руководство по генетике дрожжей и молекулярной биологии. Сан-Диего: Academic Press. 3–22.
  44. 44. Фишер М., Шнелл Н., Чаттауэй Дж., Дэвис П., Диксон Дж. И др. (1997) Ген CCh2 Saccharomyces cerevisiae участвует в притоке кальция и спаривании. FEBS Letters 419: 259–262.
  45. 45. Paidhungat M, Garrett S (1997) Гомолог потенциалзависимых кальциевых каналов млекопитающих опосредует стимулируемое феромонами дрожжи поглощение Ca2 + и усугубляет дефект роста cdc1 (Ts).Mol Cell Biol 17: 6339–6347.
  46. 46. Данн Т., Гейбл К., Билер Т. (1994) Регулирование клеточного Ca2 + дрожжевыми вакуолями. J Biol Chem 269: 7273-7278.
  47. 47. Каннингем К.В., Финк Г.Р. (1994) Кальциневрин-зависимый контроль роста у мутантов Saccharomyces cerevisiae, лишенных PMC1, гомолога Са2 + АТФаз плазматической мембраны. J Cell Biol 124: 351–363.
  48. 48. Cunningham KW, Fink GR (1996). Кальциневрин ингибирует VCX1-зависимый обмен H + / Ca2 + и индуцирует Ca2 + АТФазы в Saccharomyces cerevisiae.Mol Cell Biol 16: 2226–2237.
  49. 49. Denis V, Cyert MS (2002) Внутреннее высвобождение Ca (2+) в дрожжах запускается гипертоническим шоком и опосредуется гомологом TRP-канала. Журнал клеточной биологии 156: 29–34.
  50. 50. Popa C-V, Dumitru I, Ruta LL, Danet AF, Farcasanu IC (2010) Экзогенный окислительный стресс индуцирует высвобождение Ca2 + в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Журнал FEBS 277: 4027–4038.
  51. 51. Strayle J, Pozzan T, Rudolph HK (1999) Стабильный свободный Ca (2+) в эндоплазматическом ретикулуме дрожжей достигает только 10 мкМ и в основном контролируется насосом секреторного пути pmr1.EMBO J 18: 4733–4743.
  52. 52. Castermans D, Somers I, Kriel J, Louwet W, Wera S и др. (2012) Индуцированная глюкозой посттрансляционная активация протеинфосфатаз PP2A и PP1 у дрожжей. Cell Res 22: 1058–1077.
  53. 53. Boustany LM, Cyert MS (2002) Зависимая от кальциневрина регуляция ядерного экспорта Crz1p нуждается в Msn5p и консервативном сайте стыковки кальциневрина. Гены и развитие 16: 608–619.
  54. 54. Такацумэ Ю., Охдате Т., Маэта К., Номура В., Идзава С. и др.(2010) Calcineurin / Crz1 дестабилизирует Msn2 и Msn4 в ядре в ответ на Ca2 + в Saccharomyces cerevisiae. Biochem J 427: 275–287.
  55. 55. Durchschlag E, Reiter W, Ammerer G, Schuller C (2004) Ядерная локализация дестабилизирует стресс-регулируемый фактор транскрипции Msn2. J Biol Chem 279: 55425–55432.
  56. 56. Groppi S, Belotti F, Brandao RL, Martegani E, Tisi R (2011) Индуцированный глюкозой приток кальция в почкующихся дрожжах включает новую систему транспорта кальция и может активировать кальциневрин.Клеточный кальций 49: 376–386.
  57. 57. Hockberger PE, Skimina TA, Centonze VE, Lavin C, Chu S, et al. (1999) Активация флавинсодержащих оксидаз лежит в основе индуцированного светом производства h3O2 в клетках млекопитающих. Proc Natl Acad Sci USA 96: 6255–6260.
  58. 58. Muend S, Rao R (2008) Фунгицидная активность амиодарона тесно связана с притоком кальция. FEMS Yeast Research 8: 425–431.
  59. 59. Locke EG, Bonilla M, Liang L, Takita Y, Cunningham KW (2000) Гомолог потенциал-управляемых каналов Ca (2+), стимулируемых истощением секреторного Ca (2+) в дрожжах.Молекулярная и клеточная биология 20: 6686–6694.
  60. 60. Marchi V, Sorin A, Wei Y, Rao R (1999) Индукция вакуолярной Ca2 + -АТФазы и обменной активности H + / Ca2 + у дрожжевых мутантов, лишенных Pmr1, Ca2 + -ATPase Гольджи. FEBS Letters 454: 181–186.
  61. 61. Amorós M, Estruch F (2001) Hsf1p и Msn2 / 4p кооперируются в экспрессии генов HSP26 и HSP104 Saccharomyces cerevisiae в зависимости от гена и типа стресса. Мол микробиол 39: 1523–1532.

Публикации 2016 г. — Центр NSF по новым особенностям интегрированных сотовых систем

Просмотреть публикации (по годам): 2019 | 2018 | 2017 | 2016 | 2015 | 2014 | 2013 | 2012 | 2011 | 2010


Melhem MR, Park J, Knapp L, Reinkensmeyer L, Cvetkovic C, Flewellyn J, Lee MKyung, Jensen TWolf, Bashir R, Kong H et al. 2016. Напечатанный на 3D-принтере микроканалированный гидрогелевый патч с нагруженными стволовыми клетками гидрогелевыми пластырями для повышенного высвобождения факторов, секретирующих клетки, и лечения инфарктов миокарда. ACS Biomater. Sci. Eng ..

Raman R, Clay NE, Sen S, Melhem M, Qin E, Kong H, Bashir R. 2016. 3D-печать позволяет разделить ортогональные функции внутри частицы гидрогеля .. Biomed Microdevices. 18 (3): 49.

Hookway TA, Butts JC, Lee E, Tang H, McDevitt TC. 2016. Формирование агрегатов и суспензионная культура плюрипотентных стволовых клеток человека и дифференцированного потомства.. Методы. 101: 11-20.

Schmidt J, Lee MK, Ko E, Jeong JH, DiPietro LA, Kong H. 2016. Альгинатные сульфаты снижают кинетику связывания проангиогенных факторов роста с рецепторами для реваскуляризации .. Mol Pharm. 13 (7): 2148-54.

Adams DSpencer, Uzel SGM, Akagi J, Wlodkowic D, Andreeva V, Yelick PCrotty, Devitt-Lee A, Paré JF, Levin M. 2016. Передача биоэлектрических сигналов через калиевые каналы: механизм черепно-лицевой дисморфогенеза в KCNJ2-ассоциированном Andersex. -Синдром Тавила.J Physiol. 594 (12): 3245-70.

Roh K-H, Nerem RM, Roy K. 2016. Биопроизводство терапевтических клеток: современное состояние, текущие проблемы и перспективы на будущее .. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7: 455-78.

Rivet CA, Kniss-James AS, Gran MA, Potnis A, Hill A, Lu H, Kemp ML . 2016. Кальций Динамика CD8 + T-клеток, длительно культивируемых Ex vivo, регулируется изменениями в окислительно-восстановительном метаболизме .. PLoS One. 11 (8): e0159248.

Boggs K, Venkatesan N, Mederacke I, Komatsu Y, Stice S, Schwabe RF, Mistretta CM, Mishina Y, Liu HX. 2016. Вклад нижележащих клеток соединительной ткани во вкусовые рецепторы на языке и мягком небе мыши. PLoS. 11 (1): e0146475.

Бек К., Сингх Т., Фаруки А., Венкатеш Т., Васкес М. 2016. Контролируемая микрофлюидика для изучения индуцированной факторами роста миграции нейральных предшественников в зрительной системе дрозофилы. J Neurosci Methods. 262: 32-40.

Мэттис OB, Hookway TA, McDevitt TC. 2016. Принципы конструирования тканей из плюрипотентных стволовых клеток человека.. Curr Stem Cell Rep. 2 (1): 43-51.

Разлив F, Andasari V, Mak M, Kamm RD, Zaman MH. 2016. Влияние трехмерной геометрии на восприятие клеточного градиента и поляризацию .. Phys Biol. 13 (3): 036008.

Пьетак А., Левин М. 2016. Изучение инструктивной физиологической передачи сигналов с помощью механизма моделирования биоэлектрической ткани. Front Bioeng Biotechnol. 4:55.

Bartocci E, Gol EA, Haghighi I., Belta C. 2016. Подход формальных методов к распознаванию образов и синтезу в реакционных диффузионных сетях.IEEE Transactions по управлению сетевыми системами. ПП (99)

Guye P, Ebrahimkhani MR, Kipniss N, Velazquez JJ, Schoenfeld E, Kiani S, Griffith LG, Weiss R. 2016. Генетическая инженерия самоорганизации плюрипотентных стволовых клеток человека в ткань, похожую на почку печени, с использованием Gata6 .. Nature Communications. 7: 10243.

Пай В.П., Мартынюк С.Дж., Эчеверри К., Сунделакруз С., Каплан Д.Л., Левин М. 2016. Полногеномный анализ выявляет консервативные транскрипционные ответы после изменения потенциала покоя у эмбрионов Xenopus, регенерации аксолотлей и дифференцировки мезенхимальных клеток человека.. Регенерация (Oxf). 3 (1): 3-25.

Сюэ З., Хеннелли С., Дойл Б., Гулати А.А., Новикова И.В., Санбонмацу К.Ю., Бойер Л.А. 2016. G-Rich Motif в lncRNA Braveheart взаимодействует с фактором транскрипции Zinc-Finger, определяя сердечно-сосудистое происхождение .. Mol Cell. 64 (1): 37-50.

Surface LE, Fields PA, Subramanian V, Behmer R, Udeshi N, Peach SE, Carr SA, Jaffe JD, Boyer LA. 2016. h3A.Z.1 Моноубиквитилирование противодействует BRD2 в поддержании сбалансированного хроматина в ESC.. Cell Rep.14 (5): 1142-1155.

Узел SGM, Platt RJ, Subramanian V, Pearl TM, Rowlands CJ. 2016. Микрожидкостное устройство для формирования оптически возбудимых трехмерных моторных единиц. Журнал достижений науки. 2 (8): e1501429.

Леварио Т.Дж., Лим Б., Шварцман С.Ю., Лу Х. 2016. Микрофлюидика для высокопроизводительных количественных исследований на раннем этапе развития .. Annu Rev Biomed Eng. 18: 285-309.

Лю И, Лу Х. 2016. Микрожидкостные системы в системах биология — шумиха или по-настоящему полезна? Curr Opin Biotechnol. 39: 215-220.

Nguyen AH, Wang Y, White DE, Platt MO, McDevitt TC. 2016. ММР-опосредованный мезенхимальный морфогенез агрегатов плюрипотентных стволовых клеток, стимулированный включением микрочастиц желатинметакрилата .. Биоматериалы. 76: 66-75.

Барнс Д.Э., Хванг Х., Оно К., Лу Х., Оно С. 2016. Молекулярная эволюция тропонина I и роль его N-концевого удлинения в перемещении нематод.73 (3): 117-130.

Глейзер Д.Е., Тернер В.С., Мадфис Н., Вонг Л., Замора Дж., Уайт Н., Рейес С., Бернс А.Б., Гопинатан А., Макклоски К.Э. 2016. Многофакторные оптимизации для управления судьбой эндотелия из стволовых клеток .. PLoS One. 11 (12): e0166663.

Hwang H, Barnes DE, Matsunaga Y, Benian GM, Ono S, Lu H. 2016. Фенотипический анализ мышечного сокращения, включенный с помощью оптогенетики, выявляет функциональные взаимосвязи компонентов саркомера у Caenorhabditis elegans.. Научный доклад 6: 19900.

Уголини GStefano, Rasponi M, Pavesi A, Santoro R, Kamm R, Fiore GBeniamino, Pesce M., Soncini M. 2016. Оценка пролиферативных реакций первичных сердечных фибробластов человека на одноосное циклическое механическое напряжение на кристалле. Biotechnol Bioeng. 113 (4): 859-69.

Э. Бейтс К., Лу Х. 2016. Микрожидкостные платформы с интегрированной оптикой для биомолекулярных анализов. Биофизический журнал. 110 (8): 1684-1697.

Раман Р., Цветкович С., Узел СГМ, Платт Р.Дж., Сенгупта П., Камм Р.Д., Башир Р. 2016. Оптогенетические адаптивные биологические машины с питанием от скелетных мышц. Proc Natl Acad Sci U S. A. 113 (13): 3497-502.

Ма Л., Раджшекхар Г., Ван Р., Бхадури Б., Шридхаран С., Мир М., Чакраборти А., Айер Р., Прасант С., Миллет Л. и др. 2016. Фазовая корреляционная визуализация динамики немеченых клеток .. Sci Rep. 6: 32702.

Дюрант Ф., Лобо Д., Хаммельман Дж., Левин М. 2016. Физиологический контроль крупномасштабного формирования паттерна при регенерации планарии: молекулярная и вычислительная перспектива роста и формы.. Регенерация (Oxf). 3 (2): 78-102.

Уначукву У. Джон, Уоррен А., Ли З., Мишра С., Чжоу Дж., Сауане М., Лим Х., Васкес М., Реденти С. 2016. Прогнозируемые молекулярные сигналы, управляющие миграцией фоторецепторных клеток после трансплантации в поврежденную сетчатку. Sci Rep. : 22392.

Бхатт С., Гупта М. К., Хамаиси М., Мартинес Р., Гриценко М. А., Вагнер Б. К., Гай П., Бусскамп В., Ширакава Дж., Ву Г. и др. . 2016. Сохраненный путь контрольной точки повреждения ДНК защищает от осложнений при длительном диабете 1 типа.Клеточный метаболизм. 22 (2): 239-252.

McCracken JM, Badea A, Kandel ME, A Gladman S, Wetzel DJ, Popescu G, Lewis JA, Nuzzo RG. 2016. Программирование механических и физико-химических свойств трехмерных гидрогелевых клеточных микрокультур с помощью прямого чернильного письма .. Adv Healthc Mater. 5 (9): 1025-39.

Маджид Х., Шридхаран С., Мир М., Ма Л., Мин Э., Юнг В., Попеску Г. 2016. Количественная фазовая визуализация для медицинской диагностики. Журнал биофотоники. . Биофотоника.10 (2): 177-205.

Нгуен Т.Х., Эдвардс К., Годдард Л.Л., Попеску Г. 2016. Количественная фазовая визуализация слаборассеивающих объектов с использованием частично когерентного освещения .. Opt Express. 24 (11): 11683-93.

Pan C, Fan Y. 2016. Роль гистонов-линкеров h2 в развитии млекопитающих и дифференцировке стволовых клеток. Biochim Biophys Acta. 1859 (3): 496-509.

Мисра М, Аудолы Б, Кеврекидис И.Г., Шварцман С.Ю. 2016. Преобразования формы эпителиальных оболочек.. Biophys J. 110 (7): 1670-1678.

Узел SGM, Amadi OC, Pearl TM, Lee RT, So PTC, Kamm RD. 2016. Одновременное или последовательное формирование ортогонального градиента в микрожидкостной платформе трехмерных культур клеток .. Small. 12 (5): 612-22.

Mak M, Spill F, Kamm RD, Zaman MH. 2016. Миграция отдельных клеток в сложных микросредах: механика и сигнальная динамика .. J Biomech Eng. 138 (2): 021004.

Ким Т., Чжоу Р., Годдард Л.Л., Попеску Г. .2016. Решение обратной задачи рассеяния в биологических образцах с помощью количественной фазовой визуализации. Обзоры лазеров и фотоники. 10 (1): 13-39.

Хорстмайер Р., Хайнцманн Р., Попеску Г., Валлер Л., Янг К. 2016. Стандартизация требований к разрешающей способности для когерентной микроскопии. Природа Фотоника. 10 (2): 68-71.

Шан М., Настаса В., Попеску Г. 2016. Статистическое дисперсионное соотношение для пространственно широкополосных полей. Оптическое общество Америки. 41 (11): 2490-2492.

Тиг Б.П., Гай П., Вайс Р. 2016. Синтетический морфогенез .. Колд-Спринг-Харб Perspect Biol. 8 (9)

Jiayu L, Liam G, Kong H. 2016. Адаптация матриц на основе коллагена для регенеративной медицины и тканевой инженерии. Существенные вопросы: Сигма-Олдрич. 10 (4)

L JCMVega, Lee MK, Qin EC, Rich M, Lee KY, Kim DH, Chung HJ, Leckband DE, Kong H. 2016. Трехмерное конъюгирование рекомбинантного N-кадгерина с гидрогелем для анизотропного нейронного роста.. J Mater Chem B. 4 (42): 6803-6811.

Джексон Э.Л., Лу Х. 2016. Трехмерные модели для изучения развития и болезней: переход от организмов к органам на кристалле и органоидам. Интегр. Биол .. 8 (6): 671-683.

Шан М., Кандел М.Э., Маджид Х., Настаса В., Попеску Г. 2016. Дифракционная фазовая микроскопия в белом свете при удвоенном произведении ширины полосы пропускания .. Opt Express. 24 (25): 29033-29039.

Шоу Рэйчел Мэддау, стенограмма 29.01.13

РЕЙЧЕЛ МЭДДАУ, ВЕДУЩИЙ: Добрый вечер, Эд.Спасибо, мой друг. ЭД ШУЛЬЦ, ВЕДУЩИЙ «ЭД ШОУ»: Вы держите пари. Мэддау: И спасибо тебе дома за то, что присоединились к нам в этот час. Сегодня президент произнес то, что будет рассматриваться как одна из знаковых политических речей своего второго срока. И если вы прищурились, вас можно простить за то, что вы подумали, что это, возможно, был второй набросок того, что вы, возможно, слышали раньше. (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПОВ) БАРАК ОБАМА, ПРЕЗИДЕНТ СОЕДИНЕННЫХ ШТАТОВ: Что ж, хорошо снова вернуться в Лас-Вегас. (АПЛОДИСМЕНТЫ) Привет, Эль Пасо.Что ж, это замечательно, замечательно снова оказаться со всеми вами в Штате Одинокой Звезды. Я здесь, потому что большинство американцев согласны с тем, что пора исправить систему, которая слишком долго ломалась. Все признают, что система сломана. Поэтому мы сегодня на границе. Возникает широкий консенсус. Существует консенсус относительно исправления того, что сломано. Мы определяем себя как нацию иммигрантов. Мы определяем себя как нацию иммигрантов. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПОВ) MADDOW: Речь президента Обамы сегодня в Лас-Вегасе по поводу его иммиграционных предложений абсолютно соответствует тому, за что она отстаивала все это время.Просто посмотрите этот фрагмент здесь. Это жутко. (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПОВ) ОБАМА: В последние годы каждый четвертый стартап в сфере высоких технологий в Америке был основан иммигрантами. В последние годы целых 25% стартапов в сфере высоких технологий в США были основаны иммигрантами. Иммигранты помогают открывать такие предприятия, как Google и Yahoo. Посмотрите на Intel. Посмотри на гугл. Посмотрите на Yahoo. Посмотрите на eBay. Угадайте, кто был основан каждым из них? Иммигрант. Мы собираемся развернуться и сказать им, чтобы они открыли этот бизнес и создали рабочие места в Китае, Индии, Мексике или еще где-нибудь.Новые отрасли в Америке развиваются не так. Мы не хотим, чтобы следующий Intel или следующий Google создавался в Китае или Индии. Мы хотим, чтобы эти компании и рабочие места пустили здесь корни. Прямо сейчас у нас в Америке 11 миллионов иммигрантов без документов. Сегодня в Соединенных Штатах насчитывается около 11 миллионов иммигрантов без документов. Да, они нарушили правила. Они пересекли границу нелегально. Некоторые пересекли границу нелегально. Они нарушили правила. И подавляющее большинство этих людей не ждут никаких неприятностей.Они вносят свой вклад в сообщество. Они заботятся о своих семьях. Подавляющее большинство этих людей просто пытаются заработать себе на жизнь и обеспечить свои семьи. Компании, которые пытаются поступать правильно, нанимают людей на законных основаниях, платят приличную заработную плату, соблюдают правила, страдают именно они. Им приходится конкурировать с компаниями, которые нарушают правила. Это ставит компании, которые следуют правилам, и американцев, которые справедливо требуют минимальной заработной платы или сверхурочных или просто безопасного места для работы, ставит эти предприятия в невыгодное положение.Во-первых, я считаю, что нам нужно сосредоточить внимание на обеспечении соблюдения. Это означает дальнейшее укрепление безопасности на наших границах. Во-первых, мы знаем, что правительство несет пороговую ответственность за безопасность наших границ. Более жесткие меры по борьбе с предприятиями, которые сознательно нанимают работников без документов. Компании должны быть привлечены к ответственности, если они эксплуатируют рабочих без документов. Мы ставим на Южную границу больше ботинок, чем когда-либо в нашей истории. Сейчас у нас больше войск на земле на юго-западной границе, чем когда-либо в нашей истории.Нам приходится иметь дело с 11 миллионами человек, которые находятся здесь нелегально. Те, кто находится здесь нелегально, тоже несут ответственность. Чтобы помочь продвинуть этот процесс, сегодня я излагаю свои идеи иммиграционной реформы. Я собираюсь внести свой вклад, чтобы вести конструктивную и гражданскую дискуссию по этим вопросам. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПОВ) MADDOW: Президент сказал, что те, кто находится здесь нелегально, когда он говорил в Эль-Пасо, сказали, что им нужно пройти проверку биографических данных. Сегодня он сказал, что им нужно пройти проверку биографических данных.Он говорил в Эль-Пасо, он сказал, что им нужно платить налог. Выступая сегодня в Лас-Вегасе, он сказал, что им нужно платить налоги. Когда он выступал в Эль-Пасо, он сказал, что им нужно будет заплатить штраф. Когда он выступал в Эль-Пасо, он сказал, что им нужно будет заплатить штраф. Таким образом, штраф заменен на штраф. Но кроме этого, да, весь диагноз проблемы, все предложение о том, как решить проблему, экономический и социальный аргумент в пользу того, почему нам нужно решать проблему, точно такие же для президента Обамы сегодня, как и в 2011 году. .И, честно говоря, это было до этого от него. Что изменилось, так это его политическая оценка: то, что он хотел для страны раньше, но не мог получить, теперь он получит. Теперь это возможно. С точки зрения политики, он все это время оставался на одном и том же месте. Что тронули республиканцы. (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПА) ОБАМА: Хорошие новости заключаются в том, что впервые за много лет республиканцы и демократы, похоже, готовы вместе решать эту проблему. (АПЛОДИСМЕНТЫ) На данный момент, похоже, есть искреннее желание сделать это в ближайшее время.И это очень обнадеживает. Но на этот раз действие должно последовать. Я здесь сегодня, потому что пришло время для всеобъемлющей иммиграционной реформы, основанной на здравом смысле. (АПЛОДИСМЕНТЫ) Время пришло. Сейчас самое время. Сейчас самое время. Сейчас самое время. ТОЛПА: Si se puede! Si se puede! Si se puede! Si se puede! ОБАМА: Сейчас самое время. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: По словам Вашингтона, он прав. По мнению Вашингтона, сейчас, видимо, самое время. Не потому, что политические предложения президента или сама проблема изменились ни на йоту по сравнению с тем, что было во время его первого президентского срока, а потому, что республиканцы изменили свое мнение о том, что они хотели бы делать.Когда президент Обама два года назад был в Эль-Пасо, выдвигая тот же самый рецепт, ту же политическую программу в отношении иммиграции, которую он придерживается сегодня, и это почти точно такое же, как то, что было только что обнародовано четырьмя сенаторами-республиканцами и четырьмя сенаторами-демократами на вчера состоялась большая двухпартийная пресс-конференция. И то, что нам сказали, также похоже на то, что двухпартийная группа сейчас рассматривает в Палате представителей США, когда президент Обама уже был там два года назад, излагая этот план, который он все еще поддерживает, подумайте о том, где были республиканцы тогда.(НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПОВ) МИТТ РОМНИ (R), БЫВШИЙ КАНДИДАТ ПРЕЗИДЕНТА: Я баллотируюсь на пост, ради Пита. У меня не может быть нелегалов. Мой отец, как вы, наверное, знаете, был губернатором Мичигана, руководил автомобильной компанией. Но он родился в Мексике. И если бы он родился от мексиканских родителей, у меня были бы большие шансы на победу. НЕИЗВЕСТНЫЙ МУЖЧИНА: Следует ли вести себя агрессивно, «разыскать, найти и арестовать», как защищает шериф Арпайо? РОМНИ: Знаешь, я думаю, ты видишь модель здесь, в Аризоне.Ответ — самоликвидация. Если бы меня избрали, и Конгресс принял бы Акт МЕЧТЫ, я бы наложил вето на него? И ответ — да. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПОВ) MADDOW: И проблема республиканцев в этом вопросе не только проблема Митта Ромни. Кандидат от Республиканской партии до того, как Митт Ромни был сенатором, который был сторонником иммиграционной реформы, за год до того, как он стал их кандидатом. Но затем, чтобы стать кандидатом от Республиканской партии, ему пришлось отказаться от собственных идей. Ему пришлось отказаться от своих предложений и сказать, что он даже проголосовал бы против своего законопроекта, принятого только в прошлом году.(НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПА) НЕИЗВЕСТНАЯ ЖЕНЩИНА: Если бы ваше первоначальное предложение было вынесено на голосование в зале Сената, вы бы проголосовали за него? SEN. ДЖОН МАККЕЙН (R), АРИЗОНА: Не будет. Не будет. Вот почему мы прошли дебаты. НЕИЗВЕСТНАЯ ЖЕНЩИНА: Да. МАККЕЙН: Нет, я бы не стал, потому что мы знаем, какова ситуация сегодня. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: Для сенатора Джона Маккейна иммиграционная реформа была приоритетом. И тогда он был против. И теперь он снова за это. Некоторые современные деятели Республиканской партии связаны с иммиграционной реформой, например, бывший президент Джордж У.Буш и его брат Джеб Буш, бывший председатель Республиканской партии Мэл Мартинес, которого вчера вечером я назвал бывшим председателем Республиканской партии штата Флорида. Он был национальным председателем. Прошу прощения за это. Он бывший сенатор от Флориды. Итак, некоторые из этих ребят на протяжении всей своей карьеры связаны с иммиграционной реформой. Но остальная часть партии, нынешние выборные должностные лица в партии просто дико крутятся вокруг этого вопроса, принимая совершенно разные и прямо противоположные ответы от избирательного цикла к избирательному циклу — поскольку республиканцы, я думаю, пытаются решить, будет ли восходящее движение вверх. Ползучий процент латиноамериканцев в американском электорате — это то, что они собираются использовать, чтобы разжечь страх своей базы перед коричневой планетой, или это то, что они собираются использовать, чтобы попытаться вдохновить себя переосмыслить кем должна быть их база.Число голосов латиноамериканцев становится все больше, а доля республиканцев в этом голосовании со временем становится все меньше. Со временем они получают все меньше и меньше того, что со временем становится все больше и больше. И даже если ты плохо разбираешься в математике, это повод для паники. И паника, которая вызвала у Республиканской партии, заставила их — по крайней мере, на данный момент — принять то, что всегда было позицией демократов. Когда президент Обама предпринял исполнительные меры в свой первый президентский срок, чтобы распространить своего рода закон о мини-МЕЧТАХ на молодых людей, которых незаконно доставили сюда в детстве, общая реакция республиканцев в Конгрессе на это была тем, что они назвали амнистией, запрещающей черный ход. Действуйте, чтобы попытаться отменить то, что сделал президент.Но теперь, всего через несколько месяцев, республиканцы полностью разделяют подход президента к проблеме. Он остановился, и они двинулись. И они переехали, потому что думают, что их собственная токсичность для латиноамериканских избирателей заставляет их переехать. Но здесь есть еще один последний фактор, есть еще одна неизменная истина, которую не учитывает этот замечательный республиканский урод и поворот вспять. И это большой плюс за пределами секрета Кольцевой дороги — то, что латиноамериканские избиратели действительно либеральны, действительно либеральны.Латиноамериканская информационно-пропагандистская группа Джеба Буша провела опрос латиноамериканцев из колеблющихся штатов после прошедших выборов. И оказывается, что дело не только в иммиграции, латиноамериканские избиратели больше любят демократов, чем республиканцев. Латиноамериканцы, вроде Демократической партии, меняют положение по всем вопросам, о которых их спрашивают. Им больше нравятся демократы в вопросах образования, прав женщин, ценностей в социальных вопросах в целом. Им больше нравятся демократы с дефицитом. Им больше нравятся демократы за экономику, малый бизнес, иммиграцию, за помощь среднему классу, за все это, за все, о чем их спрашивают.Единственные две категории, в которых латиноамериканцы в колеблющихся штатах предпочитают республиканцев демократам, — это когда их спрашивают, кто больше настроен против иммигрантов и кто больше заботится о помощи богатым людям. Республиканцы побеждают по этим двум вопросам: они выступают против иммигрантов и копают богатых людей. Но демократы побеждают по всем остальным вопросам политики. Экзит-поллы электората 2012 года показали, что латиноамериканский электорат был более либерален в отношении однополых браков, чем страна в целом. Экзит-поллы на выборах 2012 года показали, что латиноамериканский электорат больше поддерживает права на аборт, чем страна в целом — больше, а не меньше.Более. Существует миф о том, что если республиканцы просто перестанут быть такими оскорбительными по отношению к латиноамериканцам в отчужденной манере, в которой они говорили о латиноамериканцах как об этнической группе и как о политическом округе, если они смогут просто стать мейнстримом в вопросе реформирования иммиграционной системы … просто согласитесь с демократами в этом вопросе, мы просто заткнем нос и сделаем это — существует миф о том, что тогда республиканцы получат новый электорат избирателей, который готов голосовать за них. Новый электорат избирателей, миллионы избирателей, растущее число избирателей, согласных с ними, особенно в отношении социального консерватизма.Все эти латиноамериканцы начнут голосовать за республиканцев, если вы сможете контролировать обратную сторону, если республиканцы ослабят иммиграцию. На самом деле ничто не говорит о том, что это касается латиноамериканских избирателей. Но республиканцы все равно идут на иммиграцию, по крайней мере, на данный момент. Уступят ли они, когда поймут, что латиноамериканцы все равно будут голосовать за демократов? Я точно знаю, кого хочу об этом спросить. Это дальше. (КОММЕРЧЕСКАЯ ПЕРЕРЫВ) (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПА) ОБАМА: Теперь вопрос простой.Есть ли у нас решимость как народ, как страна, как правительство, чтобы наконец оставить этот вопрос позади? Я верю, что да. Я верю, что да. (АПЛОДИСМЕНТЫ) Я считаю, что мы наконец достигли момента, когда всеобъемлющая иммиграционная реформа находится в пределах нашей досягаемости. Но я тебе это обещаю. Чем ближе мы подойдем, тем более эмоциональными станут эти дебаты. Иммиграция всегда была проблемой, разжигающей страсти. Знаете, в этом нет ничего удивительного. Есть несколько вещей, которые важнее для нас как общества, чем то, кто может приезжать сюда и называть нашу страну своим домом, кто получает привилегию стать гражданином Соединенных Штатов Америки — это большое дело.Когда мы говорим об этом абстрактно, иногда в дискуссии легко возникает ощущение того, что мы против них. И когда это происходит, многие люди забывают, что большинство из нас было ими. Мы забываем об этом. (АПЛОДИСМЕНТЫ) Я имею в виду, что нам действительно важно помнить свою историю. Знаете, если вы не один из первых американцев, коренной американец, вы приехали из другого места. Кто-то вас привел. (АПЛОДИСМЕНТЫ) Ирландцы, оставившие после себя страну голода, немцы, бежавшие от преследований, скандинавы, прибывшие с нетерпением на Запад, поляки, русские, итальянцы, китайцы, японцы, индейцы, сбившиеся в кучу массы, которые прошли через остров Эллис на одном побережье и остров Ангела на другом.(АПЛОДИСМЕНТЫ) Все эти люди, прежде чем они были нами, они были ими. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: Президент Обама сегодня в Лас-Вегасе говорит об иммиграционной реформе. Сегодня в Вашингтоне республиканцам мягко напомнили, что, когда они говорят об иммиграции, им следует избегать любимых республиканских фраз, таких как, например, «отправить их всех обратно», или «электрический забор», или «якорь, ребенок». Также мягко, очень мягко предлагается, чтобы республиканцы избегали использования слов «нелегалы» или «иностранцы» и, цитируя, «не характеризовали всех латиноамериканцев как недокументированных».«Этот меморандум был впервые опубликован сегодня газетой« The Hill ». В нем предлагается сообщать, что можно и чего нельзя делать республиканцам. о нелегкой задаче избавиться от паники среди латиноамериканцев в Республиканвилле. Теперь к нам присоединяется Стив Шмидт, политический стратег-республиканец, старший стратег McCain / Palin в `08 и участник MSNBC. Стив, рад вас видеть. Спасибо СТИВ ШМИДТ, СОТРУДНИК MSNBC: Спасибо, Рэйчел.MADDOW: Если совет должен начинаться с того, чтобы перестать говорить «отправьте их всех обратно» и «закрепите младенцев», значит ли это, что мы вышли за пределы этого уровня советов? SCHMIDT: Ну, первое правило копания ям — когда ты в одном, перестань копать. Так что со стороны республиканцев есть некоторые обнадеживающие признаки. И я думаю, что люди начинают осознавать политическую реальность того, что Республиканская партия никогда больше не выиграет президентские выборы, если мы будем придерживаться той линии тренда, которую мы придерживаемся с 2004 года с латиноамериканскими избирателями в стране.В 2016 году электорат будет на 2 процента меньше белого, чем в 2012 году, что на 2 процента меньше, чем в 2008 году. Таким образом, Республиканской партии придется придумать, как разговаривать с этим сообществом через призму уважения. прежде, чем мы сможем даже приступить к изложению аргументов в пользу проблем и расширения прав и возможностей. Мэддау: Вы знаете, та же демографическая правда о латиноамериканском электорате и трудностях республиканцев в общении с латиноамериканским электоратом, которая была верна после вашей гонки с Джоном Маккейном в `08.Это было так же верно, как и после гонки с Миттом Ромни. Почему такое признание этой демографической истины приводит к изменениям в партии, когда после вашей гонки, после гонки 2008 года, республиканцы фактически пошли дальше прямо в этом вопросе? ШМИДТ: Нет вопросов. Но после второй потери президента, после того, как республиканцы проиграли всенародное голосование на пяти из последних шести президентских выборов, я не думаю, что для этого нужен ученый-ракетчик, чтобы разобраться в математике.И люди смотрят на это, видят надпись на стене. Вы смотрите на долгосрочную демографию. Например, рост латиноамериканцев в Техасе неумолимо изменит это состояние с сплошного красного на пурпурный и, в конечном итоге, на синий, поскольку линия тренда продолжает двигаться вперед. Итак, проблема, обозначенная в записке, о которой вы только что говорили, заключается в следующем. Когда вы слышите слово «латиноамериканец» для слишком многих политиков-республиканцев, первое, что они ассоциируют с этим, — это нелегальный иммигрант, в отличие от обладателя Серебряной звезды, сержант-майора, хирурга, доктора или учителя.Это жизненно важная часть американского сообщества, и республиканцам придется с уважением относиться к этому сообществу. Эту иммиграционную проблему, которая является огромной катастрофой для страны и которая существует уже долгое время, необходимо решить. Мы должны прийти к решению с 11 миллионами человек, которые находятся здесь в этом постоянно сером статусе. Мы должны решить проблему. А затем, как только эта проблема будет решена, республиканцы, возможно, смогут начать восхождение к тому месту, где мы были не так давно, получив 44 процента голосов латиноамериканцев после президентских выборов 2004 года.Мэддау: Я — из-за этого, потому что Джордж Буш был настолько успешен в проведении голосования за латиноамериканцев и делал это таким образом, что казалось, что он будет продолжаться до тех пор, пока партия действительно просто не изменит свою позицию по этому вопросу. много вопросов, которые затрагивают латиноамериканских избирателей, я так привык слышать своего рода расхожую мудрость Кольцевой дороги о том, что латиноамериканские избиратели, помимо иммиграционного вопроса, настолько социально консервативны, что они являются естественным электоратом для республиканцев. Я так привык слышать это, что, кажется, начал верить в это, и поэтому был шокирован, когда вернулся и посмотрел на фактическое голосование, которое показывает, что не только латиноамериканцы больше соответствуют избирателям-демократам с точки зрения их взглядов на социальную жизнь. вопросы, но они значительно более либеральны, чем остальная страна в этом.Как республиканцы подходят и к этой истине, и к этой стратегии? SCHMIDT: Что ж, вы совершенно правы. Это представление о том, что этому сообществу присущ социальный консерватизм, и поэтому, как только этот вопрос будет прояснен, что они по умолчанию перейдут в Республиканскую партию, я думаю, что это неправильно. Но если вы посмотрите, например, на штат, в котором сегодня находился президент, штат Невада, то в этом штате есть очень популярный латиноамериканский губернатор-республиканец Брайан Сандовал. Вы посмотрите на республиканского губернатора штата Нью-Мексико Сусану Мартинес, латиноамериканского происхождения.Итак, часть проблемы, с которой республиканцы сталкиваются при общении с латиноамериканцами, заключается в полной токсичности бренда республиканцев, бренда Вашингтона, округ Колумбия. Но как только вы сможете вырваться из этого бренда округа Колумбия, республиканцы смогут оставить на вечеринке отпечаток, соответствующий Неваде или Нью-Мексико. И вы в этом добиваетесь успеха. Я не думаю, что цифры, о которых вы говорили по этим вопросам, являются постоянными. Республиканцы, когда мы только заканчиваем президентские выборы, на которых мы были обречены такими комментариями, как 47 процентов, нам нужно донести до каждого американца послание о расширении прав и возможностей, о восхождении по социально-экономической лестнице, о возрождении американцев. средний класс находился в упадке.Мы должны поговорить об этих вещах. У нас должны быть планы, основанные на реальности, чтобы справиться с проблемами, с которыми сталкиваются американские семьи. Консерватизм — это серьезная правящая политика, которая со временем сослужила этой стране хорошую службу. Но в какой-то степени это было захвачено психами. И в той мере, в какой американцы выглядят агентами, они не видят партии, которая предлагала бы очень много решений проблем за последние пару лет. Так что, будем надеяться, после второго поражения на президентских выборах мы увидим, как реформаторы в партии начнут придавать новое лицо консерватизму и делать его привлекательным брендом, которым так было долгое время.Мэддау: Наблюдая за внутренними дебатами, я думаю, что особенно среди республиканцев в Палате представителей, когда они решают, что с этим делать, будет так увлекательно и так важно для страны. Стив Шмидт, бывший стратег McCain / Palin, участник MSNBC и человек, который только что приветствовал нового члена своей семьи — поздравляем с рождением вашего ребенка, Стив. ШМИДТ: Спасибо, Рэйчел. Мэддау: Большое спасибо. Похоже, ты спишь намного больше, чем я думал. Все в порядке.Впереди еще много всего, в том числе критическое голосование по ключевому кандидату в кабинет Обамы. И Хиллари Клинтон разговаривает с Андреа Митчелл, конечно же, и с журналистом, лауреатом Пулитцеровской премии Хосе Антонио Варгасом, — все они в ближайшее время. Оставайтесь с нами. (КОММЕРЧЕСКИЙ ПЕРЕРЫВ) MADDOW: До того, как его назначение на должность государственного секретаря было поставлено на голосование в Сенате США сегодня, до того, как он стал сенатором от великого штата Массачусетс, Джон Керри был офицером ВМС США. Он служил во Вьетнаме, где, как известно, был награжден тремя Пурпурными сердцами, Серебряной звездой и Бронзовой звездой.С другой стороны, до того, как стать сенатором от великого штата Техас, до того, как стать юристом, Тед Круз поступил в Принстон, а затем в Гарвардскую школу права, где очень хорошо учился. Поэтому было довольно захватывающе, когда сенатор Тед Круз выразил свое несогласие как с выдвижением сенатора Керри — кандидатом в Государственный департамент, так и с выдвижением Чака Хейгела на пост руководителя Министерства обороны. Чак Хейгел получил два Пурпурных сердца во Вьетнаме и ходит каждый день со шрапнелью в груди.Было весьма примечательно, когда мы услышали, почему сенатор Тед Круз сказал, что эти два раненых ветеранов боевых действий не собираются получить его голос в Сенате. (НАЧАТЬ ВИДЕОКЛИП) СЕН. ТЭД КРУЗ (справа), ТЕХАС: У нас есть две незавершенные номинации, Джон Керри и Чак Хейгел. Оба они явно настроены против нас — меньше, чем ярые фанаты армии США. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: Они не любят армию. Не так, как он. Он младший сенатор от Техаса. За такое заявление нет медалей, но, технически говоря, я думаю, что мы должны сказать — это какая-то латунь, сенатор.Впереди еще больше, в том числе от Хиллари Клинтон. Оставайтесь с нами. (КОММЕРЧЕСКИЙ ПЕРЕРЫВ) MADDOW: Взгляните на это изображение. Слева от экрана — министр внутренних дел Джанет Наполитано. Справа — министр образования Арне Дункан. Оба они остаются в кабинете Обамы на второй срок, как мы узнали. Это фотография агентства «Ассошиэйтед Пресс», сделанная на слушаниях судебного комитета Сената по иммиграции, которые проходили в июне 2011 года. Что примечательно в этой фотографии, так это то, что технически это лицо, Джанет Наполитано, — депортировать этого человека. , парень, сидящий прямо за ней.Это будет Хосе Антонио Варгас. Он родился на Филиппинах. Вот он со своими родителями, когда он был маленьким в Маниле. Когда он был 12-летним ребенком, мать отправила его в Соединенные Штаты с кем-то, кого он считал дядей. На самом деле, это был просто парень, которому его мама заплатила тысячи долларов, чтобы перевезти сына в Соединенные Штаты, чтобы Хосе мог жить лучше в США. Когда он приехал, Хосе жил в Маунтин-Вью, штат Калифорния, со своими бабушкой и дедушкой. . Он очень много работал, чтобы выучить английский язык.А через пару лет после приезда в Соединенные Штаты, не говоря по-английски, он окончил среднюю школу Криттенден в районе залива и был назван студентом года. Через пару лет пришло время получать водительские права. Хосе поехал на велосипеде в местное управление, он отдал свою грин-карту, и служащий вернул ее ему с предупреждением: никогда сюда не возвращайся. Хосе понятия не имел, но грин-карта, которую он считал на самом деле поддельной. Дед Хосе был натурализованным гражданином, как и его бабушка, но Хосе не был настоящим гражданином.До того дня в DMV он понятия не имел, не имел ни малейшего представления о том, что его, ребенка, отправили в США без надлежащих документов. И все это он узнал в 16 лет от незнакомца, который работал в DMV. Испуганный, сбитый с толку, но не знающий, что еще делать, Хосе очень много работал. Окончил среднюю школу. Он пел в хоре, когда учился в старшей школе. Он подал заявку и был принят в Государственный университет Сан-Франциско. Он хотел быть репортером. Он получил подработку, а затем стажировку в «The San Francisco Chronicle» и «The Philadelphia Daily News», а затем в «The Washington Post».«Он также получил действительно престижную стажировку в« Сиэтл Таймс ». Это было для него на столе, пока рекрутер для этой стажировки не попросил всех новых стажеров, включая Хосе, принести свои официальные документы, принести свидетельство о рождении. или паспорт или водительские права, которых у него не было. Итак, он тихо отказался от этой стажировки и так и не смог объяснить, почему он должен был. Он закончил колледж в 2004 году. Он вернулся на работу в «Вашингтон Пост» снова в Вашингтоне, Д.C. Он делал репортажи с предвыборной кампании 2008 года. Он писал для «Rolling Stone». Он писал для «Жителя Нью-Йорка». Но все это по сравнению с этим — Хосе Антонио Варгас за репортаж о стрельбе в Технологическом институте Вирджинии получил Пулитцеровскую премию. То, что вы здесь видите, на самом деле является репортажем из газеты его родного города из «The Mountain View Voice». Подумай об этом. Газета из родного города сообщает о том, что вы выиграли Пулитцеровскую гонку. Что может быть лучше для журналиста? Но возникла проблема. Чем более известным и успешным стал Хосе, чем выше взлетела его звезда журналистики, тем больше была вероятность того, что его секрет будет раскрыт.И вот в июне 2011 года он очень смело решил сбросить давление. Он решил публично заявить о себе. Он заявил, что он, Хосе Антонио Варгас, известный репортер, обладатель Пулитцеровской премии, американец филиппинского происхождения, на самом деле находился в Соединенных Штатах нелегально. Все те иммигранты без документов, о которых вы слышали все годы, живущие в тени, он был одним из тех, кто вел очень заметную жизнь. И он объявил себя таковым в «Нью-Йорк Таймс» и в журнале «Тайм», и в видео под названием «Определите американца», и даже на этом шоу.А потом Хосе присутствовал на слушаниях в Сенате и сел прямо за человеком, чья работа — отправить его обратно в страну, в которой он никогда не был с детства. Хосе больше не журналист. Теперь он активист, путешествующий по стране и рассказывающий об иммиграции и необходимости сделать систему более разумной, более гуманной, да — но также просто более разумной. И сегодня, когда президент Обама поехал в Лас-Вегас, чтобы поговорить об иммиграции, чтобы поговорить отчасти конкретно о том, почему детей привозят в эту страну нелегально, но которые окончили среднюю школу и поступили в колледж, и хотят вести здесь хорошую продуктивную жизнь, когда Президент говорит о том, почему для нас как страны не имеет смысла иметь в качестве единственного варианта, чтобы эти дети были отправлены куда-то еще, были выгнаны из Америки и депортированы в то место, о котором они могут даже не знать, когда президент выступил сегодня в Лас-Вегасе, Хосе был там.И вы никогда не угадаете, за кем он сидел еще раз. Сейчас к нам присоединяется Хосе Антонио Варгас. Хосе, рад снова тебя видеть. Спасибо, что присоединились к нам. ХОЗЕ АНТОНИО ВАРГАС, БЕЗДОКУМЕНТИРОВАННЫЙ ИММИГРАНТ: Большое спасибо за то, что пригласили меня. Мэддау: Вы действительно снова оказались рядом с Джанет Наполитано? ВАРГАС: На самом деле я сидел прямо перед ней. (СМЕХ) ВАРГАС: И мы поздоровались. И я представился. И она сказала: о, я знаю, кто ты. Вы знаете, я был … для меня большая честь сидеть в первом ряду, когда президент произносит свою речь.И все, о чем я мог думать, если честно, это как тысячи, вы знаете, десятки тысяч людей без документов в этой стране, а также около 2 миллионов человек сейчас, когда президент, к сожалению, депортировал за последние четыре года. И это реальность иммиграции в этой стране. Мэддау: До сих пор мы говорили в шоу сегодня вечером о том, насколько последовательны политические заявления президента по этому вопросу. ВАРГАС: Да, да. Мэддау: Он говорил то же самое, что он давно хочет, чтобы произошло то же самое.Очевидно, что сейчас ситуация иная. Политический импульс для продвижения этих предложений есть. Республиканцы, похоже, захотят согласиться. Учитывая это, учитывая, что кажется, что что-то может произойти, что вы думаете по существу о том, что предлагается? Как вы думаете, это решит самые важные проблемы? ВАРГАС: Ну, я думаю, что все внимание сосредоточено на принуждении, верно, даже сам президент сказал, что приоритет номер один — это принуждение. Мэддау: Да.ВАРГАС: Однако контекст там, что граница была обеспечена. Мы проделали огромную работу. Что, это похоже на самый низкий пункт пересечения границы с тех пор, как Никсон был президентом. И когда люди говорят о границе, вы знаете, я прилетел сюда на самолете из Филиппин. Моей границей был Тихий океан, вы знаете, полный миллион из 11 миллионов людей без документов — выходцы из Азии. Так что я чувствую, что эти разговоры о границе и принуждении — это кодовое название, верно, потому что мы не хотим, чтобы эти люди здесь. И я, честно говоря, думаю, чего не хватает, и это то, что я пытался сделать последние полтора года, теперь — это более честный разговор по этому вопросу.И я думаю, что теперь он у нас есть. Теперь у нас это будет. MADDOW: Вы чувствуете, что предложения по политике, а также то, как это обсуждается, особенно многими людьми, которые избегали этой темы в прошлом. ВАРГАС: Да. MADDOW: Вы чувствуете, что это — обсуждение осведомлено о том, каково это на самом деле пытаться ориентироваться в реальной иммиграционной системе? Очевидно, вы говорите, что это не отражает того факта, что не все пересекают южную границу. ВАРГАС: Да. Мэддау: Но действительно ли люди понимают, насколько сложна система и в каких случаях она не работает? ВАРГАС: Ну, первое, что я должен сказать, это аплодировать этим лидерам, которые, наконец, стали лидерами, верно? Я имею в виду политику здесь — я имею в виду, что политика здесь довольно очевидна, верно, с точки зрения того, что необходимо сделать.Политика всегда была тяжелой. Но я чувствую, что с точки зрения того, о чем идет разговор, я чувствую, что нам все еще не хватает уверенности в том, что мы ведем широкий разговор по этой проблеме, что речь идет не только о том, кого мы держим в стороне, но на самом деле какой мы хотим видеть эту страну? Какое будущее у этой страны в культурном и экономическом плане? Я чувствую, что этого не хватает. И я чувствую, что нам нужно лучше поработать над тем, чтобы сделать это американской проблемой. Это не просто вопрос — это не только проблема латиноамериканцев.Это не только пограничный вопрос. Речь идет о том, как будет развиваться эта страна, и о том, что нам нужно, чтобы двигаться вперед. MADDOW: Хосе Антонио Варгас, основатель Define American. И вы больше, чем кто-либо, я думаю, были очень, очень хороши, говоря о том, как мы должны думать об иммиграции как о потенциально большом активе и большом позитиве для нашей страны, как о реальном пути движения вперед. Вы говорите, чем многие другие люди. И ты действительно умел передать это, Хосе.Большое спасибо. ВАРГАС: Я очень, очень ценю это. Спасибо, Рэйчел. Мэддау: Здорово, что ты здесь. Все в порядке. ВАРГАС: Спасибо. Мэддау: Сенат Соединенных Штатов проголосовал за что-то действительно очень важное, и голосование было 94: 3. Вау, 94-3. А также, кто были эти трое? Разве это не то, что ты всегда удивляешься? Оказывается, это очень интересный ответ. Эта история следующая. (КОММЕРЧЕСКИЙ ПЕРЕРЫВ) (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПА) ОБАМА: Все мы знаем, что сегодня у нас иммиграционная система устарела и сильно сломана.Система, которая сдерживает нас, вместо того, чтобы помогать нам развивать нашу экономику и укреплять наш средний класс. Мы должны перенести нашу легальную иммиграционную систему в 21 век, потому что она больше не отражает реалии нашего времени. (АПЛОДИСМЕНТЫ) Например, если вы гражданин, вам не нужно ждать годы, прежде чем ваша семья сможет присоединиться к вам в Америке. Не нужно ждать годы. (АПЛОДИСМЕНТЫ) (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: Не нужно ждать годы. Вы знаете, сложность — это не просто характеристика того, как устроен мир и как работает бюрократия.Сложность также используется как тактика в политике. Намеренное запутывание, создание чего-то казалось более сложным, чем оно есть на самом деле, может иметь политический эффект. Por ejemplo, таблица страха, верно? Графическое изображение, которое сделано намеренно сложным, чтобы напугать вас по поводу этой проблемы — эта диаграмма страха называется организационной схемой плана здравоохранения Палаты представителей демократов, также известной как Obamacare. Это было сделано республиканцами Палаты представителей еще в дни дебатов о реформе здравоохранения.Посмотри, как сложно. Разве это не ужасно? Давайте добавим больше прямоугольников и линий, чтобы все выглядело еще хуже и отчуждающе. Когда эта версия, очевидно, не была достаточно пугающей, республиканцы позже выпустили второй проект. Посмотри на это. Вторая таблица опасений Obamacare, с — я не знаю — на 50 процентов больше зон нормирования или что-то в этом роде. Быть испуганным! Вот еще одна таблица опасений. Это стратегия Америки, якобы для победы в войне в Афганистане. Любые вопросы? Я не думаю, что эта диаграмма изначально создавалась для запугивания, но она была распространена, чтобы оказать политический эффект после того, как ее откопали.Это диаграммы страха. И группы, выступающие за иммиграцию, использовали ту же тактику схемы запугивания. Смотри прямо сюда. Это карта текущего легального пути иммиграции в эту страну. Вот как вы легально становитесь гражданином США, если вы им еще не являетесь. И все маленькие красные знаки остановки, которые вы видите, — это все те места в процессе, которые вы можете заблокировать, чтобы стать гражданином США в рамках нашего легального иммиграционного процесса. Итак, работодатель не желает подавать трудовой сертификат аккредитива? Извините.Или I-140 отказано? Извините. Как насчет того, что я вовремя не ответил на RFE. Извините. Или в проверках безопасности USCIS отказано. Извините. Все эти разные вещи и многое другое может привести вас к сожалению. Все они могут привести вас к знаку остановки, где вы потерпите неудачу в своей попытке пройти через то, что сейчас является легальной иммиграционной системой в Соединенных Штатах. На этой диаграмме также есть все эти маленькие часы, встроенные в некоторые из линий, чтобы показать вам места, где, даже если вы можете перейти от одного шага к другому, там есть часы.Между этими двумя шагами есть долгое время ожидания, даже если вам удастся продолжить. И, конечно же, эти маленькие часы начинают складываться по мере того, как ваша жизнь проходит мимо вас. Так что это жуткий кошмар, правда? В определенной степени это тоже пугающая таблица. Это опасается сложности этой системы. Но вы знаете, что? Эта диаграмма на самом деле тоже отчасти верна. И даже если вы намеренно стараетесь не преувеличивать, насколько сложна и трудна эта система, даже если вы не пытаетесь визуально запутать пути, по которым люди эмигрируют в эту страну, даже если вы попытаетесь сделать это не таким сложным — глядя насколько возможно, но, скорее, максимально ясно, это все еще невероятно невозможно.Либертарианский журнал «Reason» недавно попытался составить карту той же системы в легитимно удобной для пользователя форме. Они не пытаются запутать или казаться более сложными. Они пытаются казаться проще. Посмотрите, как они это сделали. Это маленькие герои мультфильмов. Он имеет очень хорошую цветовую кодировку, вместо того, чтобы расстраивать вас. Вы можете проследить за каждым из этих запоминающихся маленьких привлекательных персонажей на протяжении всего процесса таким образом, чтобы это помогло вам понять.Это не предназначено для визуального устрашения, но в конечном итоге так же ужасает правду. Ваш работодатель не хочет платить 10 тысяч на судебные издержки? Извините, вам не повезло. Являетесь ли вы женатым взрослым ребенком законного постоянного жителя? Извините, это означает, что вы не соответствуете требованиям. Трудно ориентироваться в действительно запутанной легальной иммиграционной системе, приводя к предсказуемым, рациональным или откровенно оправданным результатам. И в любой из ситуаций, в которых вам разрешено эмигрировать, это самая ужасная вещь из всех — посмотрите на типичное время, которое проходит для людей, которые следуют этим конкретным путям, чтобы стать U.Гражданин С. — посмотрите времена, семь лет, 16 лет, 20 лет, 13 лет, 28 лет? Двадцать восемь лет — сколько времени вы можете ожидать? Двадцать восемь лет — сколько времени может потребоваться прямо сейчас для людей, которые следуют правилам, делают это правильно и делают это по закону? Сколько времени люди могут ожидать от системы, когда она работает? (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПА) ОБАМА: Сегодня у нас иммиграционная система устарела и сильно сломана. (КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: Да, есть.Да, все, что требует 28 лет, мы делаем. То, что вы все время слышите от людей, вовлеченных в иммиграционную борьбу в Вашингтоне, — это то, что все, что нам приходится придумывать, должно быть жестким, но справедливым. Жестко, но честно. Жестко, но честно. Как насчет жестких, справедливых и эффективных? Легальный иммиграционный процесс в этой стране существует не просто так. Он существует потому, что легальная иммиграция — это то, что мы якобы ценим как страна. Это то, что мы позволяем. Это основа того, кем мы являемся как страна.И это процесс, за содействие которому отвечает наше правительство. И некоторые из юридических путей для этого прогресса прямо сейчас обычно занимают до 28 лет. Не потому, что ты облажался, а потому, что ты все сделал правильно. Причина, по которой они говорят, что иммиграционная реформа должна проводиться комплексно, а не по частям, а ля карт, когда вы просто выбираете одно или два дела, причина, по которой она должна быть всеобъемлющей, потому что отчасти потому, что Решение ala carte неизбежно означало бы попытку втиснуть больше людей через эту существующую систему.Нет, система не работает. Не только больше людей должно пройти через систему, но и система должна исчезнуть и быть заменена чем-то осмысленным. Это не либерально. Это не консервативно. Это то, что называется хорошим правительством. И если вы мне не верите, спросите кого-нибудь, кто через это прошел или кто пытается через это пройти. Если вы знаете кого-нибудь, кто иммигрировал в эту страну в этом поколении, спросите их — спросите их уважительно, но спросите их. Спрашивайте, пока не найдете кого-нибудь в своей личной жизни, кто прошел через эту систему, и спросите, не сломалась ли она.Посмотри, что они говорят. (КОММЕРЧЕСКИЙ ПЕРЕРЫВ) MADDOW: с пятницы 7-й по старшинству член Сената США больше не будет членом Сената США. Джон Керри, бывший старший сенатор Массачусетса, официально подал заявление об отставке сегодня после 28 лет работы в Сенате, и это потому, что он собирается получить новую работу — госсекретарь. Сенат проголосовал 94 голосами против 3 за утверждение кандидатуры Джона Керри на пост госсекретаря сегодня, что совсем не удивительно. Два из трех голосов против сенатора Керри поступили от обоих членов делегации Техаса, Теда Круза, «ветеран Вьетнама с наградами, Джон Керри не является достаточно большим поклонником военных» — да, за это вас будут помнить. Сенатор Круз.А также Джон Корнин. Третье голосование «против» было любезно предоставлено Джеймсом Инхофом из Оклахомы, да благословит его Бог. Но эти парни проиграли, поэтому Джон Керри покидает Сенат и переходит в штат. А дома, в Массачусетсе, уже назначена дата выборов, чтобы занять его место. Губернатор Массачусетса Деваль Патрик — вы видите здесь — объявил, что 25 июня он проведет внеочередные выборы, чтобы сменить Джона Керри. Пока что единственным человеком, который объявил о своем баллоте на это место, является конгрессмен от Массачусетса Эд Марки.Но сегодня вечером источник, близкий к другому конгрессмену из Массачусетса Стивену Линчу, сообщил NBC News, что конгрессмен Линч собирается объявить, что он также баллотируется от Демократической партии. И, конечно же, много спекуляций по поводу другой стороны прохода. Некий Твиттер обрадовал бывшего сенатора, который только что уступил место в Сенате Элизабет Уоррен на прошлых выборах. «Ассошиэйтед Пресс» сообщает сегодня вечером, что Скотт Браун, цитирую, «сильно склоняется» к бегу и что он, вероятно, примет участие в гонке на следующей неделе.Они процитировали анонимный республиканский источник, близкий к бывшему сенатору. Тем не менее, названный представитель сенатора позже сказал бостонскому телеканалу WCVB, что этот «A.P.» отчет был неверным. Но пресс-секретарь не стал вдаваться в подробности. Так что да, это так. Хотите увидеть странные твиты, которые Скотт Браун опубликовал после полуночи в субботу, а затем удалил после того, как я ретвитнул их миллионам людей. Вот они, кто угодно, Скотт Браун, ты потрясающий. Также предстоит решить, кто займет освободившееся место в Сенате Джона Керри до внеочередных выборов 25 июня.Бывший конгрессмен Барни Франк публично заявил, что хотел бы остаться на этом временном посту. Завтра ожидается, что губернатор Массачусетса Патрик объявит, назначит ли он временное назначение Барни Фрэнка или назначит кого-нибудь еще. Вики Кеннеди, вдова сенатора Теда Кеннеди, также включена в короткий список кандидатов на эту роль. Перед тем, как сегодня Сенат проголосовал за кандидатуру Джона Керри в Госдепартамент, несколько сенаторов почтили память уходящего госсекретаря Хиллари Клинтон.Она была госсекретарем в интересный период: арабскую весну, конец войны в Ираке, начало свертывания войны в Афганистане, конец Каддафи, конец Мубарака, конец войны. Ким Чен Ира. Теперь, когда она официально подала в отставку, возникают безумные предположения о том, что она будет делать дальше. Возьмите все предположения о том, что кто-то может баллотироваться в президенты на прошлых выборах, умножьте это на 100, и вы получите уровень предположений о планах Хиллари Клинтон.Но завтра здесь, на MSNBC, в 13:00 великая Андреа Митчелл соберется один на один с бывшим госсекретарем Хиллари Клинтон. И поскольку нам посчастливилось достаточно тесно сотрудничать с великими людьми на шоу Андреа Митчелл, достаточно близко, чтобы мы могли подкупить их для предварительного просмотра роликов, у нас есть для вас предварительный ролик этого интервью сегодня вечером, смотрите. (НАЧАЛО ВИДЕОКЛИПА) АНДРЕА МИТЧЕЛЛ, ВЕДУЩАЯ MSNBC: Сколько будет здоровья — вашего личного здоровья, мы знаем, что у вас было как минимум два сгустка? Как это влияет на решение баллотироваться в президенты и все связанные с этим полеты? ХИЛЛАРИ КЛИНТОН, БЫВШИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СЕКРЕТАРЬ: Ну, это вообще не имеет значения.Я имею в виду, вы знаете, что — я не сомневаюсь, что я достаточно здоров, и моя выносливость достаточно велика, и я полностью выздоровею, чтобы делать то, что я захочу. Но я еще не принимал никаких решений. У меня нет реальных планов принимать подобные решения. Я с нетерпением жду очень тихого времени, где я смогу найти все, от сна до чтения и прогулок с семьей. Думаю, мне сложно представить, что будет на следующей неделе, когда я проснусь. Мне некуда идти, и, может быть, я снова пойду спать для разнообразия.(КОНЕЦ ВИДЕОКЛИПА) MADDOW: Андреа Митчелл, индивидуальное интервью с Хиллари Клинтон. Остальную часть этого интервью смотрите «ОТЧЕТЫ АНДРЕИ МИТЧЕЛЛ» завтра в 1:00 по восточному времени прямо здесь, на MSNBC. Если вы находитесь на работе или в школе, когда это происходит, установите цифровой видеорегистратор на 1:00 завтра. Это делает это для нас сегодня вечером. Увидимся завтра снова. А теперь пришло время «ПОСЛЕДНЕГО СЛОВА С ЛОУРЕНСОМ О`ДОННЕЛЛОМ». Хорошей ночи. ЭТО БЫСТРЫЙ ТРАНСКРИПТ. ДАННАЯ КОПИЯ МОЖЕТ НЕ БЫТЬ В ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ ФОРМЕ И МОЖЕТ БЫТЬ ОБНОВЛЕНА.КОНЕЦ

Неинвазивная диагностика анеуплоидии плода с помощью дробовика секвенирования ДНК из материнской крови

Ссылки

1 марта 1979 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Л.А. Герценберг Г. М. Айверсон

1 мая, 1990 · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · DW BianchiS A Latt

1 октября 1993 г. · Генетика человека · Z Gelman-KohanJ Chemke

1 июня 1993 г. · Генетика человека · H HamadaH Iwasaki

1 ноября 1996 г. · Nature Genetics · MC CheungY W Kan

1 августа 1997 г. · Пренатальная диагностика · S SohdaT Kubo

16 августа 1997 г. · Lancet · YM LoJ S Wainscoat

23 октября 1997 г. · Американский журнал генетики человека · DW BianchiA P Shuber

13 июня 1998 г. · Американский журнал генетики человека · YM LoN M Hjelm

17 июля 1998 г. · Поджелудочная железа · MB GiaconaG D Sorenson

23 января 1999 г. · Американский журнал генетики человека · YM LoN М Ельм

10 марта 2001 г. · Природа · ES LanderUNKNOWN Международный консорциум по секвенированию генома человека

16 августа 2001 г. · Рак · С. Саймон Д. Кодиш

19 июля 2002 г. · Пренатальная диагностика · DW BianchiF de la Cruz

9 января 2003 г. · Человек Генетика · Чанда Н. Джонсон-Хопсон, Кэрол М. Артлетт

28 февраля 2003 г. · Генетика человека · Маддалена СмидЛора Кремонези

14 марта 2003 г. · Текущее мнение в области акушерства и гинекологии · Киараш Хосротехрани, Дайана В. Бьянки

21000, 2003 г. · Клиническая химия · Осаму СамураКосо Охама

, 10 октября 2003 г. · Медицинский журнал Новой Англии · Рональд Вапнер НЕИЗВЕСТНО, Исследовательская группа по биохимии материнской сыворотки в первом триместре и скринингу на затылочную кишку плода

8 января 2004 · Клиническая химия · KC Allen ChanY M Dennis Lo

26 февраля 2004 г. · Клиническая химия · Робберт JP RijndersC Эллен ван дер Шут

10 апреля 2004 г. · Клиническая химия · Ying LiSinuhe Hahn

9 октября 2004 г. · BMJ: Британский медицинский журнал · Зарко Альфиревич, Джеймс П. Нилсон

18 июня 2005 г. · Наука · Гуо-Ченг Юань Оливер Дж. Рандо

12 ноября 2005 г. · Медицинский журнал Новой Англии · Фергал Д. Мэлоун НЕИЗВЕСТНО Оценка рисков в первом и втором триместрах (БЫСТРЕЕ) Консорциум исследований

25 июля 2006 г. · Природа · Эран СегалДжонатан Видом

17 октября 2006 г. · Клиническая химия · Ю К. Тонги М Деннис Ло

6 декабря 2006 г. · Nature Reviews.Генетика · Й.М. Деннис Ло, Росса В.К. Чиу

, 9 января 2007 г. · Природная медицина

1 августа 2007 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Ю. М. Деннис ЛоРосса В. К. Чиу

25 августа 2007 г. · Аналитическая химия · Х. Кристина Фан, Стивен Р. Землетрясение

18 сентября 2007 г. · Природа Генетика · Уильям ЛиКори Нислоу

7 декабря, 2007 · Акушерство и гинекология · НЕИЗВЕСТНО Американский колледж акушеров и гинекологов

22 января 2008 · Натурные методы · Ладеана У Хиллиер Элен Р Мардис

Scientific American · 30 января 2008 г. Фтенакис

11 марта 2008 г. · Ячейка · Дастин Э. Шонес, Кеджи Чжао

2 апреля 2008 г. · Scientific American · Дж. Ли Нельсон

5 апреля 2008 г. · Наука · Тимоти Д. Харрис Чжэн Се

26 июня 2008 г. · Годовой обзор грамм Эномика и генетика человека · Элейн Р. Мардис

29 июля, 2008 · Исследование нуклеиновых кислот · Джулиан Дом Хайнц Химмельбауэр


Цитаты

14 января 2011 · Детская радиология · Лоран Гарел

27 января Обзоры · Михал Р. ШвайгерМелани Исау

4 ноября, 2009 · Журнал генетического консультирования · Дагмар Тапон

22 января 2013 г. · Журнал генетического консультирования · Патрисия Л. ДеверсПамела Флодман

23 июня 2009 г. la Sociéte française de pédiatrie · JM Costa

6 мая 2011 г. · Обзоры экспертов в области молекулярной медицины · Sinuhe HahnIrene Hösli

3 декабря 2009 г. · Европейский журнал генетики человека: EJHG · Antina de JongGuido MWR de Wert

апр. 2013 · Европейский журнал генетики человека: EJHG · Фессалия Папасавва Марина Клеантоус

28 января 2012 г. · Генетика в медицине: официальный журнал Американского колледжа медицинской генетики · Гленн Э. ПаломакиДжак ob A Canick

23 июня 2012 г. · Природа · Луис А. ДиазБерт Фогельштейн

6 июля 2012 г. · Природа · H Кристина Фан-Стивен R Quake

10 ноября 2012 г. · Природа Биотехнологии · Джей Шендуре, Эрез Либерман Эйден

11 июля , 2013 · Природная биотехнология · Мэлори Эллисон

8 марта 2011 · Природная медицина · Элисавет Папагеоргиу Филиппос К. Патсалис

10 июля 2012 · Природная медицина · Диана В Бьянки

9 марта 2011 · Природная медицина · Кэролайн Райт Николас Дж Уолд

5 июля 2011 г. · Природные методы · Кевин А. Хейриес Карл Л. Хансен

22 ноября 2011 г. · Природные методы · Теему Кивиоджа Джусси Тайпале

24 июня 2009 г. · Nature Reviews.Генетика · Дагмар ШмитцВольфрам Хенн

19 августа 2011 · Обзоры природы. Генетика · Antina de JongGuido MWR de Wert

11 ноября 2011 г. · Медицинский журнал Новой Англии · Дэвид Петерс и Александр Райкович

17 декабря 2008 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Rossa WK ChiuY M Деннис Ло

30 марта 2011 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Томас М. Снайдер, Стивен Р. Землетрясение

19 мая 2011 г. · Материалы Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Исаак KindeBert Vogelstein

3 августа 2012 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Майкл В. ШмиттЛоуренс Лоэб

29 августа 2012 г. · Генетическое тестирование и молекулярные биомаркеры · Youcheng ZhangHe Wang

8 октября 2009 г. · Брифинги по функциональной геномике и протеомике · Калим У Мир

25 марта 2009 г. · Биоинформатика · Тяньцзяо ЧуДэвид Джи Петерс

28 сентября 2010 · Биоинформатика · Тяньцзяо ЧуДэвид Джи Петерс

11 сентября 2012 г. · Биоинформатика · Peiyong JiangHao Sun

7 октября 2010 г. · Обновление репродукции человека · L Hui, DW Bianchi

16 ноября 2010 г. · Обновление репродукции человека · Attie TJI GoCees BM Oudejans

12 февраля 2013 г. · Человек Обновление репродукции · E MersyS GM Frints

5 марта 2010 г. · Молекулярная репродукция человека · C GötherströmN M Fisk

25 мая 2010 г. · Исследование нуклеиновых кислот · Alain R ThierryFranck Molina

15 апреля 2011 г. · Исследование нуклеиновых кислот · Джеймс А. CasbonConrad P Lichtenstein

6 марта 2009 · Текущее мнение в области акушерства и гинекологии · Neil D AventPeter W Soothill

11 марта 2010 · Генетика в медицине: Официальный журнал Американского колледжа медицинской генетики · Marleen R SusmanJane Halliday

Oct 19, 2011 · Генетика в медицине: Официальный журнал Американского колледжа медицинской генетики · Гленн Э. Паломаки, Джейкоб Э. Каник

8 сентября 2012 · Текущее мнение в области гематологии · Нэнси Бо Инь Цуй, Юк Мин Деннис Ло

Джу l 10, 2012 · Открытая биология · Юк Мин Деннис Ло

15 декабря 2010 · Научная трансляционная медицина · Ю.М. Деннис ЛоРосса В.К. Чиу

14 января 2011 · Научная трансляционная медицина 2012 · Трансляционная медицина · Джейкоб О. Кицман Джей Шендур

1 декабря 2012 · Трансляционная медицина · Ребекка Дж. Лири, Виктор Э Велкулеску

14 июня 2013 · Трансляционная наука · Джанет Дж. Маккарти, Джеффри С. Гинзбург

13 января 2011 · BMJ : Британский медицинский журнал · Rossa WK ChiuY M Dennis Lo

19 ноября 2011 г. · Диагностика и терапия плода · EJ VerweijD Oepkes

21 января 2012 г. · Диагностика и терапия плода · Mats HidestrandAoy Tomita-Mitchell

15 марта 2012 г. · Диагностика и лечение плода · Мортен Хег ХансенМортен Ханефельд Дзигель


Клетки | Бесплатный полнотекстовый | Прогрессирование и дифференцировка альвеолярной рабдомиосаркомы регулируется транскрипционным фактором PAX7 — значение субклонов опухоли

1.Введение.

Миогенез и миогенная дифференцировка — это процессы формирования мышц, которые регулируются рядом факторов транскрипции [1]. Миогенез включает сигнальные пути, состоящие из миогенных регуляторных факторов (MRF, таких как MYF5, MYOD, MYOG и MRF4), транскрипционных факторов парных гомеобоксов (PAX3 и PAX7) и гомеобокса, связанного с синусом окулиса (SIX1 и SIX4) [2]. Спецификация ранних клонов регулируется в основном факторами транскрипции SIX1 / 4 и PAX3 / 7, тогда как MYF5 и MYOD передают клетки в миогенную программу.Следовательно, экспрессия миогенина (MYOG) и MRF4 необходима для слияния миоцитов и образования мышечных трубок [2,3,4,5]. Интересно, что клетки, в которых экспрессия PAX7 остается неизменной, воссоздают пул недифференцированных сателлитных клеток [2]. Другим семейством факторов, участвующих во внутримышечной дифференцировке, являются ингибиторы связывания / дифференцировки ДНК (ID), принадлежащие к семейству факторов транскрипции типа bHLH. Белки ID1-4 являются ингибиторами связывания ДНК и ингибиторами дифференцировки.Они удерживают клетки в недифференцированном состоянии и позволяют сохранить свойства, типичные для стволовых клеток, поэтому их продукция происходит в основном во время эмбриогенеза и в стволовых клетках, в то время как их уровень снижается и в большинстве случаев не обнаруживается в дифференцированных клетках зрелого организма [6]. Было показано, что белки ID1 и ID2 сильно взаимодействуют с MYOD и MYF5 и слабо с миогенином и MRF4, в то время как ID3 сильно взаимодействует со всеми MRF [7]. Миогенные факторы могут регулировать нормальный миогенез и регенеративные процессы, но они также могут играть роль в патологическая миогенная дифференцировка.Неправильные сигнальные пути могут привести к развитию рабдомиосаркомы (RMS) [1], которая является наиболее частой опухолью мягких тканей у детей. Анализ транскриптомов аномально развитых мышечных клеток и клеток RMS показывает значительное сходство между ними [8]. Соответственно, для RMS-клеток характерны измененные уровни факторов транскрипции, регулирующих процесс миогенеза [9]. Различают несколько подтипов RMS, включая эмбриональный подтип (ERMS), на который приходится примерно 70% всех случаев RMS, и альвеолярный подтип (ARMS), который обычно связан с плохим прогнозом.Важные факторы, регулирующие прогрессирование RMS, включают поверхностные рецепторы, такие как CXCR4 [10] и c-MET [11,12,13], фактор транскрипции SNAIL [14,15,16] и микроРНК, которые могут посттранскрипционно регулировать экспрессию многих генов. [17,18,19]. Более того, в 80% ARMS есть две характерные транслокации: PAX3-FOXO1 и PAX7-FOXO1, которые составляют примерно 75% и 25% всех транслокаций, появляющихся в RMS, соответственно [1]. Тем не менее, роль PAX7 в ARMS-негативных для слияния PAX7-FOXO1 до сих пор описана в ограниченной степени в литературе.В частности, было определено, что подавление экспрессии PAX7, опосредованное miR-206, необходимо для прогрессирования дифференцировки клеток ARMS [20]. Полезным инструментом, позволяющим расширить знания в области исследования рака, являются культуры клеток in vitro, которые могут моделировать эволюция опухоли in vivo. Как во время культивирования клеточной линии in vitro, так и во время роста опухоли in vivo может происходить клональный отбор клеток, который приводит к изоляции популяции с эволюционно более благоприятными характеристиками, такими как лучшая выживаемость, более быстрый рост или способность к колонизации. другие анатомические участки тела в случае роста in vivo [21,22].Следовательно, особенности неопластических клеток, такие как пролиферативная, метаболическая, хемотаксическая или миграционная активность, влияют на злокачественность опухоли, ее метастатические способности и соответствующую эффективность терапии и благоприятный прогноз [23]. Существуют исследования, в которых генетическая нестабильность линий во время культивирования рассматривалась как модель клональной эволюции опухолей [24,25] и как инструмент, позволяющий идентифицировать молекулярные факторы, влияющие на прогрессирование опухоли [26,27].

Таким образом, в наших текущих исследованиях мы стремились провести сравнительный анализ клеток двух субклонов линии клеток ARMS Rh40, PAX7-отрицательных (PAX7 ) и PAX7-положительных (PAX7 + ), чтобы идентифицировать новые молекулярные факторы. влияние на прогрессирование опухоли на основе различий между этими субклонами и по сравнению с другими линиями клеток RMS.Кроме того, роль PAX7 была подтверждена в экспериментах с siRNA.

2. Материалы и методы

2.1. Культура клеток Клеточные линии
RMS — Rh40, Rh51 и RD — были любезно предоставлены доктором П. Дж. Хоутоном (Центр детского рака, Колумбус, Огайо, США), кроме того, клеточная линия Rh40 была заказана в АТСС (Американская коллекция типовых культур, Манассас). , VA, США) и клеточной линии Rh28 из DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток в Германии, DSMZ института Лейбница). Клетки культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria / Lonza Group Ltd., Базель, Швейцария) с добавкой FBS (EURx, Гданьск, Польша) и 50 мкг / мл гентамицина (Lonza) при 37 ° C, 5% CO 2 и влажности 95%. Клеточные линии обычно тестировались на Mycoplasma spp. заражение с помощью набора для обнаружения микоплазм MycoAlert ™ (Lonza). Аутентификацию линии клеток RMS выполняли путем профилирования STR с использованием набора AmpFlSTR SGM PLUS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и устройства для секвенирования ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя.Результаты сравнивали с литературными данными, описанными в базе данных Expasy Cellosaurus [28]. Клеточные линии RMS дифференцировали в среде с низким содержанием глюкозы DMEM (Lonza или PAA) с добавлением 2% лошадиной сыворотки (HS) (Gibco, BRL Grand Island, Нью-Йорк, США), как описано ранее [15], или с той же средой с 5 мкМ ATRA, как описано ранее [29,30,31], в течение 6–7 дней. Эти два экспериментальных протокола дифференцировки in vitro сравнивали по их эффективности индукции миогенных факторов в субклонах Rh40.

Морфологию клеток визуализировали с помощью красителя Райта (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).

2.2. Трансфекция миРНК
Rh40 PAX7 Клетки + трансфицировали 20 нМ миРНК против PAX7 (комбинация двух вариантов siRNA ID Silencer Select: s10070 и s10071, Ambion Inc., Остин, Техас, США) или скремблированной контрольной миРНК (Silencer Select Negative Контроль № 1 siRNA, кат. 43
  • , Ambion) с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя, как описано ранее [14].Уровни экспрессии, пролиферации и миграции оценивали в течение нескольких дней после трансфекции.
    2.3. Пролиферация, клеточный цикл и включение BrdU
    Клетки

    Rh40 высевали на 24-луночные планшеты. Через 24 часа среду меняли, и через 24, 48 и 72 часа клетки подсчитывали в камере гемоцитометра Bürker для оценки скорости пролиферации в стандартной питательной среде.

    Для оценки содержания ДНК и включения BrdU клетки Rh40 высевали с плотностью 200000 клеток на одну лунку 6-луночного планшета и культивировали в трех различных условиях: (1) стандартная культуральная среда DMEM HG (с высоким содержанием глюкозы) с 10 % FBS в течение трех дней, (2) голодная среда DMEM с 0.5% BSA в течение 48 часов, а затем в DMEM с 10% FBS в течение последующих 24 часов и (3) в дифференцирующей среде DMEM с низким содержанием глюкозы (LG) с 2% HS в течение трех дней. Затем клетки анализировали с использованием набора APC BrdU flow Kit (BD Pharmingen, CA, USA) с использованием проточного цитометра Attune (ThermoFisher Scientific) в соответствии с протоколом поставщика.

    2.4. Scratch Assay
    Конфлюентные клетки Rh40 обрабатывали средой DMEM HG с 0,5% BSA в течение 24 часов для ингибирования пролиферации клеток. Впоследствии кончиком пипетки образовалась царапина.Фотографии были сделаны через 24 часа и проанализированы с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США), как описано ранее [14].
    2,5. Анализ хемотаксиса
    Хемотаксис клеток Rh40 до 10% FBS, 20 нг / мл HGF (R&D System) и 100 нг / мл SDF-1 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) оценивали с использованием модифицированной камеры Бойдена с поликарбонатом порами 8 мкм. мембранные вставки (Transwell; Corning Life Sciences — PZ HTL SA, Варшава, Польша), как описано ранее [13]. 0.5% БСА служил отрицательным контролем.
    2,6. Проточная цитометрия

    Для оценки уровней экспрессии рецептора CXCR4 клетки Rh40 метили PE-конъюгированным антителом против CXCR4 человека (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) или контрольным изотипом мышиного IgG1 (Becton Dickinson), конъюгированным с PE, соответственно. Уровень экспрессии других поверхностных маркеров оценивали с использованием технологии Lyoplate (Lyoplate Screening Panel, Becton Dickinson) в соответствии с протоколом производителя. Окрашенные клетки получали с использованием проточного цитометра Attune Next и анализировали с использованием программного обеспечения Attune NxT v2.2 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

    2.7. Выделение РНК и обратная транскрипция

    Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора GeneMATRIX Universal RNA / miRNA Purification Kit (EURx) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию мРНК проводили с использованием обратной транскриптазы MMLV (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию miRNA выполняли с использованием универсального набора для синтеза кДНК (Exiqon, Vedbaek, Дания) или miRCURY LNA RT Kit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

    2,8. Количественная ПЦР в реальном времени

    Экспрессия гена определялась с помощью анализа qRT-PCR с использованием системы Quant Studio 7 Flex (обе от Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), Blank qPCR Master Mix (EURx) и указанных зондов Taq-Man (Applied Biosystems): человек: GAPDH (Hs02758991_g1), Myf5 (Hs00271574_m1), MyoD (Hs00159528_m1), MRF4 (Hs00242962_m1) Pax7 (Hs01547104_g1), Рах3 (Hs00240950_m1), Six1 (Hs00195590_m1), Six4 (Hs00213614_m1), MEF2A (Hs01050409_m1) , MSTN (Hs00976237_m1), MYOG (Hs01072232 m1), CXCR4 (Hs00237052_m1), ID1 (Hs03676575_s1), ID2 (Hs04187239_m1), ID3 (Hs00954037_g1), ID175 (Hs00954037_g1), ID1294 (Hs00954037_g1).Уровень экспрессии мРНК для всех образцов рассчитывали с использованием нормализации к гену домашнего хозяйства GAPDH (Hs99999905_m1) с использованием метода 2 -ΔCt .

    Уровень PAX3-FOXO1 измеряли с использованием SYBR Green qPCR Master Mix (EURx) и следующих праймеров:

    Для оценки экспрессии miRNA с помощью количественной ПЦР в реальном времени, SYBR Green qPCR Master Mix (EURx) с набором праймеров LNA ™ PCR (Exiqon) или анализ ПЦР miRNA miRCURY LNA (Qiagen) для человеческих miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-133b, miR-206 и miR-103a-3p.Уровни экспрессии miRNAs были количественно определены с использованием метода 2 -ΔCt и miR-103a-3p в качестве относительного контроля, как было выбрано в нашей предыдущей статье [14].
    2.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание

    Клетки Rh40 фиксировали в 4% формальдегиде (POCH) в PBS, пермеабилизировали в 0,1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) и блокировали в 5% козьей сыворотке (ThermoFisher Scientific) вместе с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA). , Sigma-Aldrich) в PBS. Затем клетки инкубировали с мышиным антителом против PAX7 (DSHB, Developmental Studies Hybridoma Bank, IA, USA), а затем инкубировали со вторичными козьими антимышиными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 (Life Technologies) и Hoechst 33342 (Life Terchnologies). .Окрашенные слайды помещали в среду для фиксации флуоресценции Dako (Dako, Дания).

    Микроскопические изображения получали с использованием микроскопа Olympus BX51 или IX70 (Olympus Corporation, Токио, Япония) и камеры Olympus XC50 с программным обеспечением cellSens Dimension (оба от Olympus). Изображения были обработаны с помощью программного обеспечения cellSens Dimension.

    2.10. Эксперименты in vivo
    Эксперименты на животных были одобрены Местным этическим комитетом в Кракове, Польша (№ 12/2018 с модификациями 208A / 2018 и 212/2018).Всего 5 × 10 6 клеток Rh40 вводили подкожно мышам NOD-SCID в возрасте от 6 до 8 недель. Каждая экспериментальная группа состояла всего из восьми животных. Эксперименты повторяли дважды, используя группу, состоящую из четырех животных для каждого условия. Размер опухоли оценивали с помощью штангенциркуля. Объем опухоли оценивали по формуле V = D × d 2 × 0,5 (где V — объем опухоли, D — наибольший размер, а d — наименьший размер). Через 23 дня мышей умерщвляли и собирали их опухоли.После оценки веса опухоли срезы опухоли фиксировали в формалине и окрашивали гематоксилин-эозином с использованием систем обнаружения Dako EnVision (Dako Polska Sp. Z o.o., Польша) для визуализации морфологии опухоли. После депарафинизации срезы опухоли окрашивали иммуногистохимически первичным мышиным моноклональным антителом против Ki67 для оценки пролиферации опухоли (клон MIB-1; 1:75, DakoCytomation, Дания, Великобритания) и антителом к ​​CD31 для визуализации васкуляризации опухоли (1:50). , Abcam, ab28364), как описано ранее [13].
    2.11. Анализ образцов опухолей RMS от пациентов

    Эксперименты на людях были одобрены местным биоэтическим комитетом Медицинской коллегии Ягеллонского университета в Кракове, Польша (№ KBET / 32 / B / 2014). Биопсии восьми опухолей RMS были собраны во время рутинной операции для подготовки образцов, залитых парафином. Суммарную РНК из залитых в парафин образцов опухолей пациентов выделяли с использованием набора RecoverAll ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion). Впоследствии был проведен анализ профиля экспрессии гена, как описано выше.

    2.12. Биоинформатический анализ литературных данных по линиям клеток и опухолям RMS
    Из литературных данных, опубликованных Gryder et al. 2017 г. в дополнительной таблице S3 [32] данные экспрессии в FPKM (количество фрагментов на килограмм оснований на миллион отображенных считываний) были извлечены для 25 клеточных линий и 90 образцов опухолей, отнесенных к типу рабдомиосаркомы. Образцы, содержащие слитые онкогены, отличные от PAX3-FOXO1, были исключены из анализа. Затем уровни экспрессии в отрицательных и положительных по слиянию тканях / клеточных линиях сравнивали и представляли в виде графиков средних значений ± SEM со статистическим анализом.
    2.13. Биоинформатический анализ миРНК-мишеней
    2.14. Статистический анализ

    Если не указано иное, результаты показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) по меньшей мере трех-четырех независимых биологических экспериментов, как указано в подписях к рисункам (значение n). Статистический анализ выполняли с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с пост-тестом Тьюки для сравнения более двух групп или t-критерием Стьюдента и непараметрическим критерием Манна-Уитни для сравнения двух групп с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.Статистически значимыми считались различия с p-значением менее 0,05.

    4. Обсуждение

    Мы продемонстрировали, что два субклона клеточной линии Rh40 из разных источников с одинаковым профилем STR, но с экспрессией PAX7 или без нее, различаются по многим характеристикам, таким как: морфология, пролиферация, миграция, хемотаксис и рост клеток. in vivo. Эти особенности неопластических клеток могут влиять на злокачественность опухоли, ее метастатические способности и соответствующую эффективность терапии и благоприятный прогноз [23].Они также важны в контексте уровней экспрессии миогенных факторов при злокачественных новообразованиях рабдомиосаркомы у пациентов [9]. В наших исследованиях наблюдаемые различия в клеточных параметрах также были связаны с нарушением регуляции факторов транскрипции, микроРНК и поверхностных маркеров. Наблюдаемые различия могут возникать по нескольким причинам. Первый — это долгосрочное культивирование, приводящее к клональному отбору in vitro и доминированию в исходной популяции клеток более адаптированной подлинии. Такие события могут иметь место как во время культивирования клеток in vitro, так и во время роста опухоли in vivo, чтобы способствовать популяциям с эволюционно более благоприятными характеристиками [21,22].Эта нестабильность была также описана ранее для других клеточных линий, таких как, например, клеточные линии злокачественной плазмоцитомы [24] или клеточная линия Ishikawa [25], и наши исследования дополнительно указывают на это как на важную особенность. Предыдущие результаты также продемонстрировали, что одни и те же клеточные линии, подтвержденные профилями STR, могут давать разные результаты в зависимости от клонального отбора [24,25]. Важно отметить, что линия Rh40 может быть приобретена из нескольких баз клеточных линий, в том числе: DSMZ или ATCC и STR-профили линии Rh40, сообщенные двумя организациями, различаются для некоторых отдельных локусов, согласно базе данных Expasy Cellosaurus [28].Это может свидетельствовать о том, что линия Rh40 не была однородной уже на этапе внесения в базы данных. Имеются также единичные публикации, описывающие точечно измененные STR-профили [66], которые дополнительно указывают на значительную генетическую нестабильность описываемой клеточной линии. Более того, согласно некоторым источникам, линия Rh40 также идентифицируется как линия RMS13 в соответствии с базой данных Expasy Cellosaurus [28], в то время как в других литературных источниках описываются Rh40 и RMS13 как происходящие от одного и того же пациента, но полностью разные линии [67].Согласно отчету, опубликованному в Nature [68], более 15% используемых линий клеток человека на самом деле не из источника, цитируемого авторами. Поэтому многие журналы требуют проверки профиля STR перед публикацией. Как и в предыдущих исследованиях [26,27], мы использовали инструмент двух субклонов Rh40 для выявления новых молекулярных путей, влияющих на прогрессирование RMS. Одним из решающих факторов, который был обнаружен нами для различения обоих субклонов, является PAX7, поскольку один субклон полностью отрицателен для экспрессии этого гена.Также важно указать, что в будущем должна быть проведена полная геномная и транскриптомная характеристика двух субклонов Rh40, поскольку действительно весьма вероятно, что в них могут присутствовать различные изменения, помимо PAX7. Интересно, что предыдущие исследования PAX3 / 7 в RMS обычно проводились с точки зрения наличия и важности слитых генов PAX3 / 7-FOXO1 [69]. Можно найти несколько исследований, посвященных роли PAX7 в линиях RMS, отрицательных по слиянию PAX3 / 7-FOXO1 [69], но уровень экспрессии и роль PAX7 в ARMS, характеризующихся транслокацией PAX3-FOXO1, изучены недостаточно.Роль PAX7 в ARMS не привлекла необходимого внимания, вероятно, потому что его уровни ниже в позитивных по слиянию ARMS, чем в негативных по слиянию ERMS, и его экспрессия неоднородна. В этой работе было показано, что PAX7 действительно играет важную роль в пролиферации, миграции и, в частности, выживании и дифференцировке клеток ARMS в клеточной линии, положительной по транслокации PAX3-FOXO1. Наши результаты предполагают, что если PAX7 присутствует в PAX3-FOXO1-положительных клетках ARMS, снижение его уровня может заставить опухоль дифференцироваться и ингибировать ее пролиферацию и прогрессирование.Интересным будущим направлением также является проверка у пациентов с RMS, может ли снижение уровней PAX7 в PAX3-FOXO1-положительных опухолях ARMS быть связано с лучшим прогнозом и выживаемостью пациентов. Мы подтвердили роль PAX7, используя субклоны и сайленсинг siRNA, но в будущем также стоит исследовать эффекты его сверхэкспрессии после трансдукции вирусными векторами. Описанная тенденция эффектов PAX7 при ARMS, по-видимому, согласуется с текущими знаниями о роли PAX7 в RMS и нормальном миогенезе.Другие исследования показывают, что высокие уровни PAX7 в ERMS поддерживают способность к миграции и инвазивность клеток [70]. Более того, повышенная экспрессия PAX7 в клетках ERMS, как и в случае сателлитных клеток [71], поддерживает их в пролиферативном состоянии и препятствует завершению процесса дифференцировки [72]. Тем не менее, роль PAX7 в RMS требует более детального исследования в будущем. Современные исследования показали, что подавление экспрессии PAX7, опосредованное miR-206, важно для прогрессирования дифференцировки клеток ARMS [20].Интересно, что наше исследование продемонстрировало, что подавление PAX7 также может увеличивать уровни miR-206, предполагая, что может быть взаимодействие между этими двумя факторами. miR-206 может быть также регулятором других факторов, важных для миогенной дифференцировки. Биоинформатический анализ потенциальных сайтов связывания с miRDB [33] и TargetScanHuman 7.1 [34] выявил сайты связывания miR-206 в PAX7 и PAX3. Кроме того, согласно данным прогнозирования miRDB, miR-206 также может связываться с ID4. Что также важно, субклоны Rh40 обнаруживают дифференциальную экспрессию miR-206.Аналогичные эффекты были обнаружены и для других миогенных микроРНК, таких как miR-1-3p, miR-133a-3p и miR-133b. Анализ их мишеней и взаимодействий в клетках Rh40 — интересное направление для будущих исследований. Важно отметить, что дифференцировка субклонов Rh40 привела к изменению уровней экспрессии не только PAX7, но и различных факторов транскрипции, связанных с миогенной дифференцировкой. В случае клеток PAX7 + в процессе дифференцировки наблюдалась тенденция к увеличению уровней экспрессии SIX1, SIX4, PAX3, PAX7, MYOD, MYOG, MEF2A и MSTN, тогда как клетки Rh40 PAX7 демонстрировали более высокие уровни экспрессии. базальные уровни выбранных факторов, которые не увеличивались далее в среде дифференцировки in vitro.Интересно, что в обоих субклонах уровни экспрессии факторов ID имели тенденцию к снижению во время дифференцировки, что также указывает на роль факторов ID в RMS, которая ранее не описывалась в литературе. Более того, наши результаты могут указывать на то, что дифференцировка в линиях RMS, находящихся на разных стадиях миогенеза, может запускать разные пути передачи сигналов дифференцировки. Функция факторов ID в ингибировании внутримышечной дифференцировки на определенных стадиях нормального миогенеза была описана ранее [73], и как нормальные мышцы [74], так и стволовые клетки [6] также экспрессируют факторы из этого семейства.Наши эксперименты с линиями и опухолями ERMS и ARMS показали, что они экспрессируют транскрипты для всех белков ID, но их уровни были разными для каждой линии RMS. Самый низкий уровень общей экспрессии мРНК факторов ID был характерным признаком линии Rh51, которая в то же время показывала относительно высокий уровень экспрессии поздних миогенных маркеров по сравнению с другими линиями, то есть в случае MRF4 и MYOG. Факторы ID1 и ID3 характеризовались наивысшими уровнями экспрессии в тестируемых линиях RMS.Коэкспрессия факторов ID1 и ID3, как в нормальных, так и в опухолевых клетках, обычно наблюдается, и их белковые продукты обычно выполняют одни и те же функции [75]. Также были описаны значительно более высокие уровни экспрессии генов ID1, ID3 и FOXO1 в мышцах пожилых мужчин вместе с корреляцией уровня фактора ID1 со снижением мышечной массы и силы [76], что может указывать на значительная роль белков ID1 / 3 в патологических состояниях мышц. Важно отметить, что ID1 был идентифицирован как фактор, экспрессируемый в недифференцированных и химиорезистентных клетках RMS [77].Анализ уровней экспрессии других генов, участвующих в миогенезе, проведенный в различных линиях RMS, также показал, что MYOD и MYOG экспрессируются во всех исследованных клеточных линиях. Уровень MRF4 в них практически не обнаруживался, за исключением линии Rh28, которая показывала относительно высокий уровень. Тем не менее, предыдущие результаты показали, что линии ARMS и ERMS, независимо от подтипа, демонстрировали экспрессию MYOD и MRF4, в то время как транскрипты MYOG и MYF5 обнаруживались во всех линиях ARMS и большинстве линий ERMS (пять из восьми для MYOG и семь из них). из восьми для MYF5) [74].Однако в большинстве статей показано, что экспрессия MYF5 находится на более высоком уровне в ERMS, а ARMS отрицательна для слияния PAX3 / 7-FOXO1 [78]. Наши исследования показали, что клетки ERMS и опухоли характеризуются более высокими уровнями экспрессии PAX7. ген, а клетки ARMS — для PAX3 и MYOD. Более того, во всех линиях RMS более высокая экспрессия MRF4 и MYF5, по-видимому, была связана со снижением экспрессии MYOD и MYOG. Эти тенденции согласуются с предыдущими исследованиями Tenente et al. 2017 [79]. Основываясь на анализе профилей экспрессии генов в образцах первичных опухолей, группа предположила наличие двух различных систем генетической регуляции, зависящих от MYOD или MYF5.Первый характеризовался одновременной экспрессией MYF5, MRF4 и PAX7, а второй — экспрессией MYOD, CDh25 (не тестировался в этом исследовании) и MYOG [79]. Субклон Rh40 PAX7 + по сравнению с субклоном PAX7 показал более высокие уровни экспрессии MYOD и MYOG, а также, по-видимому, более низкие уровни PAX3. Следовательно, профиль экспрессии миогенного фактора для этой линии, по-видимому, немного более смещен в сторону эмбрионального типа, чем у Rh40 PAX7 .. Этот тезис также подтверждается предыдущими исследованиями, показывающими, что клеточные линии эмбрионального подтипа характеризуются более низким уровнем CXCR4 по сравнению с альвеолярным подтипом [10], что согласуется с наблюдаемым пониженным уровнем экспрессии CXCR4 для клеток PAX7 + . по сравнению с клетками PAX7 . Описанные профили экспрессии RMS могут быть связаны с происхождением этих клеток из разных стадий внутримышечной дифференцировки. Многие исследования описывают клетки RMS как происходящие из мезенхимальных стволовых клеток [80] или предшественников и дифференцирующихся миобластов [81], что может отражаться в профилях их экспрессии.Например, иммуногистохимический анализ тканевых микрочипов с использованием антител против PAX7 показал полное отсутствие экспрессии PAX7 в 45% случаев ARMS и только в 14% случаев ERMS, в то время как экспрессия PAX7 была очаговой в 83% проанализированных случаев ERMS [ 82]. Эта работа показывает, что ERMS характеризуется более высоким уровнем экспрессии PAX7 по сравнению с ARMS и может указывать на происхождение ERMS из сателлитных клеток [83]. Однако здесь наблюдается обратный паттерн экспрессии миогенных факторов: PAX7, PAX3, MYOD, и MYOG, могут быть не связаны с конкретным подтипом RMS, а скорее быть результатом присутствия или отсутствия гена слияния PAX3-FOXO1.Мы обнаружили, что клетки ERMS, использованные в нашем исследовании, были отрицательными для слияния PAX3-FOXO1, по сравнению с линиями ARMS, положительными для слияния генов. Эти результаты согласуются с литературными данными по линиям RMS [67]. Существуют исследования, показывающие, что PAX3-FOXO1 индуцирует экспрессию гена PAX3, в то время как он снижает уровень экспрессии PAX7 [84]. Напротив, экспрессия MYOG может быть индуцирована PAX3-FOXO1 через MYOD-независимый путь в клетках ARMS [85]. Более того, наши исследования также показали различия в миграционных и хемотаксических способностях субклонов Rh40.Некоторые из этих различий могут быть связаны с нарушением регуляции поверхностных маркеров и рецепторов, таких как CXCR4. Ранее было показано, что рецептор CXCR4 регулирует транспорт, хемотаксис и адгезию RMS-клеток in vitro [10]. Различия были также в экспрессии интегринов ICAM и VLA, что может повлиять на метастатические свойства этих клеток, так как адгезия интегрина к ECM обеспечивает тягу, необходимую для инвазии опухолевых клеток [86], и может играть роль в постэкстравазационном движении клеток RMS. [14,87].Среди других маркеров, дифференциально регулируемых в субклонах Rh40, были: CD97, широко экспрессируемый рецептор, связанный с G-белком класса адгезии (aGPCR), который, как ранее было обнаружено, имеет повышенную регуляцию RMS по сравнению со скелетными мышцами [36]; CD140B, известный как PDGFRB, важен для прогрессирования RMS [37]; рецептор инсулина CD220 и рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 CD221, оба связаны с худшей выживаемостью RMS [38]; активированная молекула адгезии лейкоцитарных клеток (ALCAM) CD166, связанная с инвазивностью опухоли [39]; CD15 (SSEA1), который может служить маркером опухолевых клеток [40], и сиалофорин CD43, который опосредует адгезию опухолевых клеток к брюшине [41].
  • Leave a Comment

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *